Generazione di modelli per microscopia a trazione micropattern

Riepilogo

Descriviamo i miglioramenti a un metodo standard per misurare le forze di trazione cellulare, basato sulla stampa di microcontatti con una singola fase di pattern sottrattiva di array di punti di proteine della matrice extracellulare su idrogel morbidi. Questo metodo consente una fabbricazione più semplice e coerente dei modelli a isola, essenziale per controllare la forma del cluster cellulare.

Abstract

La microscopia a trazione micropattern consente il controllo della forma di singole cellule e cluster cellulari. Inoltre, la capacità di modellare la scala di lunghezza micrometrica consente l'uso di queste zone di contatto modellate per la misurazione delle forze di trazione, poiché ogni punto micropatternato consente la formazione di una singola adesione focale che quindi deforma l'idrogel morbido sottostante. Questo approccio è stato utilizzato per una vasta gamma di tipi di cellule, tra cui cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, fibroblasti, piastrine e cellule epiteliali.

Questa recensione descrive l'evoluzione delle tecniche che consentono la stampa di proteine della matrice extracellulare su idrogel di poliacrilammide in una serie regolare di punti di dimensioni e spaziatura prespecificate. Poiché i modelli su scala micrometrica sono difficili da stampare direttamente su substrati morbidi, i modelli vengono prima generati su coperture di vetro rigido che vengono quindi utilizzate per trasferire il modello all'idrogel durante la gelificazione. Innanzitutto, viene descritto l'approccio originale di stampa a microcontatto per generare matrici di piccoli punti sul coperchio. Un secondo passaggio che rimuove la maggior parte del modello per lasciare isole di piccoli punti è necessario per controllare le forme di celle e cluster di celle su tali matrici di punti modellati.

Successivamente, viene descritta un'evoluzione di questo approccio che consente la generazione di isole di punti utilizzando un singolo passaggio di pattern sottrattivo. Questo approccio è notevolmente semplificato per l'utente, ma ha lo svantaggio di una durata ridotta per lo stampo principale necessario per realizzare i modelli. Infine, vengono descritti gli approcci computazionali che sono stati sviluppati per l'analisi delle immagini dei punti spostati e dei successivi campi di trazione generati dalle cellule e vengono fornite versioni aggiornate di questi pacchetti di analisi.

Introduzione

La maggior parte dei fenotipi cellulari esercita forze di trazione sul loro ambiente. Queste forze di trazione sono generate dal citoscheletro contrattile di una cellula, che è una rete di actina e miosina, e altri biopolimeri filamentosi e proteine reticolanti 1,2,3,4. Le forze generate all'interno della cellula possono essere trasmesse all'ambiente extracellulare o alle cellule adiacenti, principalmente attraverso proteine transmembrana come integrine e caderine, rispettivamente ^5,6. Il modo in cui una cellula si diffonde o si contrae - e le grandezze delle forze di trazione associate a quei movimenti - è il risultato di una conversazione intima con il suo ambiente, che dipende in gran parte dal tipo e dalla quantità di proteina presente nella matrice extracellulare (ECM)^7,8 e dalla rigidità dell'ECM. In effetti, la microscopia con forza di trazione è diventata uno strumento inestimabile per comprendere la reattività cellulare a stimoli locali come la rigidità del substrato, le sollecitazioni e le tensioni meccaniche imposte o il contatto con altre cellule. Queste informazioni sono direttamente rilevanti per la comprensione di malattie come il cancro e l'asma 9,10,11,12.

Per calcolare le forze di trazione è necessario un sistema che può essere utilizzato per misurare la deformazione indotta dalla forza di un substrato con proprietà note del materiale. Questi cambiamenti devono essere monitorati nel tempo, richiedendo tecniche di imaging e di elaborazione delle immagini. Uno dei primi metodi utilizzati per determinare le forze di trazione cellulare è stata l'osservazione e l'analisi della contrazione di idrogel di collagene seminati con cellule, sebbene questo metodo fosse solo semiquantitativo¹³. Un altro metodo più raffinato è stato quello di misurare le forze di trazione esercitate dalle singole celle determinando le forze risultanti dalla deformazione di un sottile foglio di silicone¹⁴. Successivamente, sono state sviluppate tecniche di misurazione più quantitative e questi metodi hanno anche permesso l'uso di idrogel morbidi come la poliacrilammide (PAA)12,15,16. Quando si utilizzano questi materiali morbidi, le forze di trazione potrebbero essere determinate dallo spostamento indotto dalla forza di perline spostate casualmente incorporate nell'idrogel e dalle proprietà meccaniche del gel^16,17. Un altro progresso è arrivato con lo sviluppo di array di micropost fatti di polidimetilsilossano morbido (PDMS) in modo che la loro deflessione potesse essere misurata e convertita in forza usando la teoria del fascio¹⁸.

Infine, sono stati sviluppati metodi per la micropatterazione di idrogel morbidi in quanto questi approcci consentono il controllo delle aree di contatto per l'adesione cellulare. Misurando la deformazione del micropattern all'interno dell'area di contatto di una cella, le forze di trazione potrebbero essere facilmente calcolate perché non è richiesta un'immagine di riferimento priva di forza¹⁹. Questo metodo è stato ampiamente adottato in quanto consente il pattern indiretto di una serie regolare di punti di adesione di proteine fluorescenti discrete di dimensioni micron su gel PAA per la misurazione delle forze di trazione cellulare²⁰. Per calcolare queste forze, è stato sviluppato un algoritmo di elaborazione delle immagini, in grado di tracciare i movimenti di ciascun punto micropatterato senza richiedere l'input dell'utente²¹.

Mentre questo metodo è semplice per creare intere griglie di modelli di punti, è più complicato quando si desiderano modelli di patch isolate (o isole) di punti. Le isole micropatternate sono utili quando è necessario il controllo della forma, e in una certa misura delle dimensioni, dei gruppi di cellule. Per creare queste isole, il suddetto metodo di stampa a microcontatto richiede due passaggi distinti: i) utilizzando un timbro PDMS per creare un modello ad alta fedeltà di punti su una copertina, e quindi ii) utilizzando un secondo timbro PDMS diverso per rimuovere la maggior parte di quei punti, lasciando dietro di sé isole isolate di punti²¹. La difficoltà nel creare isole con questo metodo originale è aggravata dal fatto che creare modelli di griglia coerenti nella prima fase del processo è impegnativo da solo. I timbri di microstampa sono composti da una serie di micropost circolari, il cui diametro corrisponde alla dimensione del punto desiderata. Questi timbri vengono quindi rivestiti con uno strato uniforme di proteine e quindi stampati con una precisa quantità di pressione sulle coperture trattate per creare il modello desiderato. Da un lato, l'applicazione di troppa pressione sul timbro può comportare un trasferimento irregolare delle proteine e una scarsa fedeltà del modello a causa della deformazione del pilastro o del cedimento tra i pilastri, che porta al contatto con il vetro. D'altra parte, l'applicazione di una pressione troppo bassa si traduce in un trasferimento di proteine scarso o nullo e in una scarsa fedeltà del modello. Per questi motivi, è necessario un processo di trasferimento che possa essere utilizzato per creare costantemente micropattern di alta qualità di isole isolate di punti in un solo passaggio.

Qui, viene descritto un metodo per la micropatterning indiretta di isole di punti di adesione di proteine fluorescenti di dimensioni micron su un gel PAA che è più coerente e versatile rispetto ai metodi precedentemente sviluppati. Mentre i vecchi metodi di micropatterning indiretto si basano sul trasferimento di modelli proteici da un timbro PDMS a un substrato intermedio, il metodo introdotto qui utilizza i timbri PDMS invece come un vaso per la rimozione delle proteine, non l'aggiunta. Questo viene fatto cambiando prima radicalmente la struttura dei timbri PDMS utilizzati. Piuttosto che creare francobolli composti da un modello di pilastri circolari uniformemente distanziati, i francobolli sono costituiti da un modello di fori circolari uniformemente distanziati in questo metodo.

Con questa nuova struttura, la superficie di questi timbri PDMS può quindi essere trattata con glutaraldeide come descritto in precedenza^20,29,30, rendendo il timbro in grado di legarsi covalentemente con le proteine. Se utilizzati su un coperchio di vetro uniformemente rivestito con proteine fluorescenti, questi timbri PDMS trattati con glutaraldeide vengono utilizzati per rimuovere la maggior parte delle proteine sulla superficie del coperchio, lasciando dietro di sé solo il modello desiderato di punti predeterminati dalla posizione di fori di dimensioni micron sul timbro. Questo cambiamento aumenta il tasso di successo per la generazione di modelli costituiti da una griglia quasi continua di punti e per la creazione di isole isolate di punti attraverso un solo passaggio.

Protocollo

1. Creazione di master in silicone

NOTA: la maggior parte del processo di progettazione, creazione e risoluzione dei problemi dei master in silicio per lo stampaggio ripetuto di timbri PDMS è stato trattato in precedenza²¹, quindi qui verranno descritte solo le differenze chiave in questo nuovo approccio.

1. Creare il design per la maschera fotografica utilizzando AutoCAD o software di progettazione simile. Rivestire un lato della fotomaschera, un sottile pezzo di vetro, con un sottile strato di cromo per controllare la diffusione della luce UV. Progettare la fotomaschera in modo che la luce UV splendente attraverso di essa sul fotoresist scelto crei un master in silicone con l'inverso delle caratteristiche desiderate sui timbri PDMS finali. Vedere la Figura 1 per la progettazione di questa maschera.
   NOTA: Se le caratteristiche desiderate o l'area esterna devono essere rese trasparenti sulla fotomaschera dipende dal fotoresist scelto. Il fotoresist utilizzato qui è SU-8 2005 (ATTENZIONE: infiammabile, irritante per la pelle e gli occhi; tenere lontano da calore / fiamme / scintille e utilizzare guanti protettivi e occhiali durante la manipolazione), un fotoresist negativo che è in grado di rendere le caratteristiche alte 5 μm con pareti laterali quasi verticali.
   1. Curare il fotoresist negativo esponendolo alla luce UV e rimuovendo il SU-8 non polimerizzato con un solvente chimico. Pertanto, progettare le caratteristiche principali della maschera in modo che siano trasparenti mentre l'area circostante della maschera è opaca.
   2. Per questo nuovo metodo di rimozione, progettare la fotomaschera in modo che sia composta da due quadrati di 1,5 x 1,5 cm (Figura 1A), uno pieno di una griglia uniforme di cerchi da 2 μm distanziati di 6 μm da centro a centro e un altro costituito da molte isole quadrate che sono versioni più piccole e isolate di quello stesso modello di griglia (Figura 1B). Crea isole delle seguenti dimensioni: 6 x 6 punti, 12 x 12 punti, 25 x 25 punti e 42 x 42 punti.
      NOTA: Il diametro dei punti di adesione (2 μm) è stato scelto sulla base di studi precedenti che misuravano le forze di trazione cellulare^22,23. La maschera utilizzata qui è 101,6 x 101,6 mm ed è rivestita su un lato con uno strato di cromo spesso 0,06 μm, che è raccomandato a causa delle piccole caratteristiche del master. La maschera fotografica utilizzata qui è stata commissionata da una società di stampa di fotomaschere esterna.
2. All'interno di una camera bianca, rivestire uniformemente il wafer di silicio scelto con photoresist. Come passaggio opzionale, trattare in superficie il wafer in un plasma prima di rivestirlo con resist.
   NOTA: Qui vengono utilizzati wafer da 100 mm di diametro. Il trattamento in un plasma asher rende il wafer più suscettibile di legarsi a SU-8 e aiuta a prevenire la delaminazione di SU-8 dal wafer.
3. Eseguire i seguenti passaggi in base alle istruzioni del produttore del fotoresist:
   1. Ruotare il wafer rivestito per creare lo spessore della feature desiderato, variando il tempo di rotazione in base allo spessore desiderato e al tipo di resistenza. Per un SU-8 2005 di 5 μm di spessore, dividere il programma di spin consigliato nei tre passaggi seguenti:
      1. Rivestire il wafer con photoresist ruotando a 500 RPM per 10 s con una rampa di 100 RPM/s.
      2. Ridurre lo spessore della resistenza a circa 5 μm ruotando il wafer a 3.000 RPM con una rampa di 300 RPM/s per 30 s.
      3. Decelerare lentamente il wafer dopo la rotazione riducendo la velocità a 0 RMP con una rampa di 500 RPM/s per 1 s.
   2. Preparare la resistenza per l'esposizione ai raggi UV cuocendola brevemente su una piastra riscaldante a 95 °C. Modificare il tempo trascorso sulla piastra di cottura in base allo spessore desiderato della resistenza; il tempo di cottura è di 2 minuti per un SU-8 di 5 μm di spessore 2005.
   3. Esporre la resistenza alla luce UV per polimerizzare completamente le caratteristiche desiderate. Diffidare della sovraesposizione, in quanto ciò può rendere su-8 fragile e influire sulla qualità complessiva del master risultante.
      1. Utilizzare un'energia di esposizione di 105 mJ/cm² per un SU-8 da 5 μm di spessore 2005. In base alla potenza della lampada UV disponibile, calcolare il tempo di esposizione dividendo l'energia di esposizione per la potenza della lampada in mW.
         NOTA: poiché la lampada utilizzata qui ha una potenza di 8 mW, il tempo di esposizione dovrebbe essere di 13,1 s.
   4. Per impostare le caratteristiche del SU-8 dopo lo sviluppo, cuocere di nuovo su una piastra calda a 95 °C, questa volta per 3 minuti. Attendere che le caratteristiche desiderate del master appaiano entro 1 minuto durante questa fase di cottura se la resistenza è stata esposta correttamente.
   5. Rimuovere SU-8 non polimerizzato dal wafer di silicio utilizzando lo sviluppatore SU-8. Prestare attenzione quando si rimuove il SU-8 non polimerizzato, in quanto può rimanere bloccato tra le caratteristiche di dimensioni micron e distanziate sul wafer.
      ATTENZIONE: lo sviluppatore SU-8 è un irritante per la pelle e gli occhi infiammabile; tenerlo lontano da calore/ fiamme / scintille e utilizzare guanti protettivi e occhiali quando lo si maneggia.
   6. Dopo lo sviluppo, risciacquare con acetone per rimuovere lo sviluppatore in eccesso sul wafer e asciugarlo completamente con una pistola a spruzzo di azoto.
      ATTENZIONE: L'acetone è un irritante per la pelle e gli occhi infiammabile; tenerlo lontano da fiamme/scintille e utilizzare guanti protettivi e occhiali quando lo si maneggia.
   7. Opzionalmente, per SU-8 2005, cuocere su una piastra calda a 200 °C per 10 minuti.
      NOTA: Questa cottura dura aggiunge resistenza meccanica al fotoresist.
4. Dopo essere stato lasciato raffreddare, mettere il wafer in un vassoio porta-wafer e quindi gettarlo in PDMS. In primo luogo, completare un trattamento di silanizzazione sul wafer per rendere le caratteristiche SU-8 del master di silicio meno propense a legarsi al PDMS e quindi meno probabilità di essere rimosse dalla superficie del wafer.
   1. Per completare il trattamento superficiale di silanizzazione, posizionare il master e un piccolo coperchio di vetro all'interno di un essiccatore destinato all'uso solo con silani. Posizionare 1-2 piccole gocce di tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano sul coperchio, chiudere l'essiccatore e farlo passare sotto vuoto per 30 minuti ad una pressione di 4.500 Pa²⁴.
      ATTENZIONE: Il tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano è un irritante infiammabile per la pelle e gli occhi; tenerlo lontano da calore / fiamme / scintille, utilizzare guanti protettivi e occhiali durante la manipolazione e lavorare sotto un cappa aspirante.
   2. Spegnere l'aspirapolvere e lasciare il master e il coverslip nell'essiccatore per altri 30 minuti.
      NOTA: il master è ora pronto per la fusione in PDMS.

2. Stampa sottrattiva di microcontatti

1. Mescolare PDMS nel corretto rapporto tra agente polimerizzante e base in base alle istruzioni del produttore. Lasciare riposare a temperatura e pressione ambiente per 15 minuti; quindi, degas sotto vuoto per 15 min.
2. Versare il PDMS nel master e metterlo in un'incubatrice impostata a 37 °C durante la notte per la polimerizzazione.
3. Rimuovere il master dall'incubatore e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
4. Mentre il master si sta raffreddando, sonicare 25 mm coverslips in etanolo per 10 min. Usa tante copertine quante sono le etichette che vengono preparate.
5. Risciacquare accuratamente i coperchi da 25 mm con acqua deionizzata (DI) e asciugare con una pistola ad aria filtrata.
6. Il plasma tratta i coverslip per 1 minuto usando un detergente al plasma sotto vuoto ad alta frequenza (potenza a radiofrequenza di 30 W). Assicurarsi di rilasciare il vuoto lentamente dopo il trattamento per evitare che i coverslip si muovano all'interno della camera.
   NOTA: Il trattamento al plasma della superficie del vetro serve a due scopi: pulisce la superficie del vetro per rimuovere i contaminanti e genera gruppi polari a base di ossigeno sulla superficie del vetro per renderlo idrofobo²⁵. Questa idrofobicità rende la superficie del vetro più suscettibile al legame proteico.
7. In una stanza priva di luce solare diretta / illuminazione dall'alto, rivestire ogni coverslip con 100 μL di soluzione proteica marcata fluorescente ad una concentrazione di almeno 100 μg / mL, coprire per una protezione extra dalla luce e lasciarlo riposare per 20 minuti.
   NOTA: Qui viene utilizzata la fibronectina isolata dal plasma umano e tinta con AlexaFluor 488.
   1. Per tingere la fibronectina, combinare la fibronectina non etichettata di concentrazione e volume noti con la quantità appropriata di colorante fluorescente in un tubo da 1,5 ml. Coprire il tubo con un foglio di alluminio per proteggere il colorante dalla luce e incubarlo a temperatura ambiente per 1 ora, mescolando delicatamente ogni 10 minuti capovolgendo il tubo 5-10 volte.
      NOTA: La quantità di colorante richiesta varia in base al colorante utilizzato e alla massa di proteine utilizzate. Vedere Il file supplementare 1 per la calcolatrice utilizzata per determinare la quantità appropriata di colorante per la fibronectina etichettata con Alexa 488. Secondo le istruzioni del produttore, il colorante in eccesso può essere filtrato con l'uso di colonne di desalinizzazione (vedere la Tabella dei materiali).
8. Risciacquare accuratamente ogni coverslip con acqua DI e rimuovere l'acqua in eccesso dalla superficie picchiettando delicatamente i lati di ciascun coverslip su un tovagliolo di carta o materiale assorbente simile. Lasciare le coperture scoperte al buio per almeno 30 minuti per lasciarle asciugare completamente.
9. Mentre le coperture rivestite di proteine si asciugano, rimuovere il timbro PDMS dal master tagliandolo con un bisturi o un'altra lama affilata.
   NOTA: è meglio non provare a tagliare il PDMS al primo tentativo, poiché l'applicazione di tanta pressione romperà il wafer di silicio e danneggerà il master.
10. Il plasma tratta i timbri PDMS per 2 minuti sotto vuoto su alta frequenza (potenza in radiofrequenza di 30 W).
11. All'interno di una cappa aspirante, posizionare i timbri in un contenitore con un coperchio e rivestire ogni timbro con uno strato molto sottile (<100 μL) di 10% (3-amminopropil)trimetosilano (3-APTMS) diluito in etanolo al 100%.
    ATTENZIONE: 3-APTMS è un irritante per la pelle e gli occhi infiammabile; tenerlo lontano da fiamme / scintille, utilizzare guanti protettivi e occhiali durante la manipolazione e lavorare sotto un cappa aspirante. Un rivestimento eccessivo della soluzione 3-APTMS causerà la formazione di un film arancione più avanti in questo processo. Questo trattamento superficiale 3-APTMS incorpora la funzionalità amminica nella superficie del timbro PDMS, che consentirà un'ulteriore derivatizzazione della superficie del timbro in^{un secondo momento 26}.
12. Coprire il contenitore con i timbri e lasciarli riposare a temperatura ambiente per 5 minuti.
13. Usando acqua DI, risciacquare accuratamente ogni timbro su entrambi i lati.
14. Posizionare i timbri in un contenitore pulito e rivestirli liberamente con glutaraldeide al 2,5% in acqua DI.
    ATTENZIONE: La glutaraldeide è tossica; utilizzare guanti protettivi e occhiali quando si maneggia e si lavora sotto un cappuccio aspirante). Questo trattamento con glutaraldeide insieme al precedente trattamento 3-APTMS fornisce funzionalità di aldeide sulla superficie dei timbri PDMS, che possono reagire con i gruppi amminici nelle proteine per creare un legame amminico secondario, che è fondamentale per il processo di rimozione delle proteine²⁷.
15. Coprire i timbri, lasciarli riposare a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi risciacquare nuovamente abbondantemente con acqua DI. Rimuovere l'acqua in eccesso dalla superficie dei francobolli allo stesso modo delle coperture e lasciare asciugare i timbri scoperti per ~ 30 minuti.
16. Dopo 30 minuti, controlla se sia i coperchi rivestiti di proteine che i timbri sono asciutti. Se uno dei due non è completamente asciutto, utilizzare una pistola ad aria compressa filtrata per asciugarli completamente, assicurandosi che i coperchi non siano esposti alla luce per un periodo prolungato.
17. Una volta che sia i coverslip che i timbri sono asciutti, spingere il modello di timbri verso il basso sui coperchi con una pressione sufficiente in modo che i timbri entrino in pieno contatto con la superficie del coperchio. Lasciare i timbri a contatto con le coperture per 15 min.
    NOTA: A causa del legame ammidico covalente tra il timbro di glutaraldeide con lo strato proteico sul coperchio di vetro - che è molto più forte delle deboli interazioni idrofobiche tra lo strato proteico e il coperchio di vetro - le proteine dovrebbero staccarsi dal vetro secondo il modello sul timbro PDMS una volta rimosso.
18. Dopo 15 minuti, staccare con cura i timbri PDMS dalle copertine.
    NOTA: Se il processo di rimozione ha funzionato correttamente, i timbri non dovrebbero staccarsi dai coperchi senza resistenza, ma non dovrebbero anche essere così saldamente attaccati ai coperchi da non poter essere rimossi senza una forza eccessiva.
19. Controllare la fedeltà dei coverslip modellati utilizzando l'apposito filtro su un microscopio fluorescente (a seconda del colorante fluorescente con cui sono marcate le proteine).
20. Utilizzare immediatamente le coperture modellate o salvarle e conservarle al riparo dalla luce diretta.

3. Coverslip attivati

NOTA: Le coperture inferiori per l'uso nella camera sperimentale per i gel PAA sono realizzate in questa fase. Questo coverslip inferiore è appositamente trattato per consentire al gel PAA di rimanere saldamente aderente mentre il coverslip modellato in alto viene rimosso durante il processo di patterning. Tecniche simili sono descritte anche altrove 10,12,15,28.

1. Sonicate 30 mm coverslips in 100% etanolo per 10 minuti, risciacquare con acqua DI e quindi asciugare accuratamente con una pistola ad aria compressa filtrata. Preparare fino a 6 coverslip alla volta per lotto in una piastra a 6 pozzetti.
2. Il plasma tratta i coverslip per 1 minuto ad alta (potenza a radiofrequenza di 30 W) e quindi posiziona ogni coverslip in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
3. Rivestire ogni coverslip con uno strato molto sottile di APTMS al 5% in etanolo in una cappa aspirante.
   NOTA: si formerà un residuo arancione in caso di rivestimento eccessivo in questo processo.
4. Coprire la piastra a 6 pozzetti e lasciare riposare le coperture per 5 minuti.
5. Risciacquare accuratamente le coperture (entrambi i lati) e l'interno di ciascun pozzetto con acqua DI e rimuovere l'acqua in eccesso all'interno dei pozzetti.
6. Riposizionare le coperture nella piastra a 6 pozzetti e aggiungere circa 2 ml di glutaraldeide allo 0,5% in acqua DI.
7. Coprire la piastra a 6 pozzetti e lasciare riposare le coperture nella soluzione di glutaraldeide per 30 minuti; quindi, risciacquare accuratamente sia i coperchi che i pozzetti di ogni piastra con acqua DI.
8. Conservare le coperture trattate in acqua DI all'interno delle piastre a 6 pozzetti per un massimo di due settimane o utilizzarle immediatamente. Assicurarsi che le coperture siano completamente asciutte prima dell'uso.

4. Fabbricazione del gel PAA e trasferimento del modello

NOTA: Una volta realizzati i coverslip modellati, devono essere utilizzati per trasferire tali modelli proteici all'idrogel PAA subito dopo (<24 h)^1,29,30. La seguente ricetta è per un gel PAA con un modulo di Young di 3,6 kPa. Le quantità di bis-acrilammide, acrilammide e acqua DI possono essere variate per regolare la rigidità dei gel PAA¹².

1. Poco prima di iniziare a produrre il precursore dell'idrogel PAA, rimuovere l'estere di acido acrilico N-idrossisuccinimide (NHS) dal frigorifero in modo che possa raggiungere la temperatura ambiente prima di essere aperto. Preparare un set di piatti intercambiabili sterilizzandolo con etanolo al 70% e lasciandolo riposare sotto la luce UV in un armadietto di biosicurezza per almeno 30 minuti prima dell'uso.
   ATTENZIONE: NHS è un irritante tossico per la pelle e gli occhi; utilizzare guanti protettivi e occhiali quando lo si maneggia e lavorare sotto un cappa aspirante.
   1. Aggiungere 1,25 mL di acrilammide al 40% in acqua DI a un tubo conico da 15 mL.
      ATTENZIONE: L'acrilammide è un irritante tossico per la pelle e gli occhi; utilizzare guanti protettivi e occhiali quando lo si maneggia e lavorare sotto un cappa aspirante.
   2. Aggiungere 175 μL di soluzione di bis-acrilammide in acqua DI allo stesso tubo (punto 4.1.1).
      ATTENZIONE: La bis-acrilammide è un irritante tossico per la pelle e gli occhi; utilizzare guanti protettivi e occhiali quando lo si maneggia e lavorare sotto un cappa aspirante.
   3. Aggiungere 500 μL di 10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
      ATTENZIONE: PBS è irritante per gli occhi; utilizzare guanti protettivi e occhiali durante la manipolazione.
   4. Aggiungere 2.915 ml di acqua DI.
2. Pipettare 969 μL di questo precursore in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e conservare il resto a 4 °C per un massimo di due settimane.
3. Misurare ~ 50-100 mg di persolfato di ammonio (APS) in un altro tubo di microcentrifuga e diluirlo in acqua DI fino a 100 mg / mL; metterlo da parte per l'uso in seguito. Aprire l'estere NHS (ora a temperatura ambiente) nel cofano e misurare attentamente fino a 3 mg di NHS in un tubo di microcentrifuga. Diluire l'estere NHS a 1 mg / mL in 1x PBS.
   ATTENZIONE: APS è un irritante per la pelle e gli occhi; utilizzare guanti protettivi e occhiali quando lo si maneggia e lavorare sotto un cappa aspirante. Sia l'APS che l'estere NHS si idrolizzeranno nel tempo, causando la variazione dell'attività delle sostanze chimiche nella soluzione madre. Pertanto, entrambe queste soluzioni devono essere preparate fresche ogni volta (a differenza del resto del precursore).
4. Eseguire i tre passaggi successivi in una cappa aspirante:
   1. Aggiungere 2 μL di tetrametiletilendiammina (TEMED) al tubo microcentrifuga contenente l'aliquota di 969 μL del precursore paa.
      ATTENZIONE: TEMED è un irritante infiammabile per la pelle e gli occhi; tenerlo lontano da calore / fiamme / scintille, utilizzare guanti protettivi e occhiali durante la manipolazione e lavorare sotto un cappa aspirante. TEMED è uno dei due agenti reticolanti critici per la polimerizzazione dell'idrogel PAA, l'altro è aPS.
   2. Aggiungere 15 μL di acido cloridrico 1 M per ridurre il pH della soluzione idrogel ed evitare l'idrolisi dell'estere NHS.
      ATTENZIONE: L'acido cloridrico è un irritante corrosivo per la pelle e gli occhi; utilizzare guanti protettivi e occhiali quando lo si maneggia e lavorare sotto un cappa aspirante.
   3. Aggiungere 10 μL della soluzione di estere NHS al tubo.
      NOTA: Il NHS è fondamentale per il processo di patterning. Reagirà con i gruppi amminici nelle proteine sul coverslip modellato per formare un legame ammidico stabile, che consentirà al modello di essere trasferito dal coverslip di vetro alla superficie del gel PAA mentre polimerizza³¹.
5. Eseguire questi passaggi finali in un armadio di biosicurezza:
   1. Posizionare con attenzione il coperchio da 30 mm all'interno della parte metallica del set di piatti coverslip (3-APTMS e lato trattato con glutaraldeide verso l'alto) e avvitare l'anello di plastica sulla parte superiore. Imposta il coperchio modellato in modo che possa essere facilmente raggiunto nella fase successiva, proteggendolo il più possibile dalla luce.
   2. Pipettare 5 μL di soluzione di APS nel resto del precursore PAA nel tubo microcentrifuga, capovolgerlo per miscelarlo e quindi pipettare immediatamente 35 μL di quella soluzione sul coperchio da 30 mm.
   3. Far cadere la proteina coverslip modellata verso il basso sulla soluzione, facendo attenzione a non creare bolle d'aria nell'idrogel. Proteggere l'idrogel dalla luce e lasciarlo polimerizzare per 90 minuti.
   4. Una volta che l'idrogel si è polimerizzato, utilizzare una lama di rasoio o un bisturi per rimuovere il coverslip superiore, assicurandosi che il coverslip non scivoli via dal gel o ricada sul gel una volta rimosso, in quanto ciò rovinerà il modello sulla superficie del gel.
      NOTA: non lasciare il gel scoperto in un'area con un flusso d'aria significativo (ad esempio un armadio di biosicurezza).
   5. Per passivare l'estere NHS rimanente nell'idrogel, aggiungere 2 ml di PBS sterile al gel e incubare a 37 °C per 45 minuti. Preparare immediatamente i gel per gli esperimenti o conservarli durante la notte in PBS sterile a 4 °C fino all'uso.

5. Imaging

1. Per prepararsi agli esperimenti con le cellule, accendere il calore (37 °C) e l'umidità (70%) al microscopio il pomeriggio prima di un esperimento pianificato per consentire all'apparecchiatura all'interno della camera del microscopio di equilibrarsi alla temperatura più elevata.
   NOTA: questo passaggio riduce al minimo la deriva z causata dalle fluttuazioni di temperatura.
2. Poco prima dell'inizio dell'esperimento, accendere la fonte di CO₂ della camera.
3. Per evitare la deriva x-y causata dal movimento ripetuto dello stadio del microscopio durante l'esperimento, fissare il set di piatti coverslip intercambiabili che tiene l'idrogel con semi cellulari sul palco con nastro biadesivo.
4. Guarda oltre il gel per trovare i fotogrammi di interesse per l'immagine, salvando ogni posizione di fase delle sezioni da visualizzare.
5. Sia nella vista a campo luminoso che nella vista fluorescente corrispondente alla proteina etichettata, impostare il software del microscopio per l'immagine di ogni fotogramma una volta ogni 5 minuti per 2 ore.

6. Analisi delle immagini

NOTA: È stato sviluppato un sistema in grado di misurare la deformazione dei gel PAA modellati determinando la posizione dei punti di trazione, interpolando le posizioni iniziali dei punti deformati e quindi calcolando le forze di trazione cellulare in ogni posizione. È possibile utilizzare qualsiasi sistema software in grado di eseguire l'elaborazione delle immagini e calcoli numerici. Il programma mira a determinare rapidamente le forze di trazione, eliminando l'input dell'utente e le procedure di pre-elaborazione che contribuirebbero agli errori relativi all'utente. Il codice utilizzato qui è disponibile qui come file supplementari 2-10 e questi file, insieme a un paio di immagini di pratica, sono accessibili all'www.bu.edu/mml/downloads.

1. In un software di elaborazione delle immagini, apri tutte le singole immagini scattate durante un esperimento timelapse da ogni vista del microscopio utilizzata in ordine, dalla prima all'ultima immagine catturata, e trasformale in una singola pila di immagini (facendo clic su Image | Stack | Immagini da impilare). Assicurarsi che siano presenti due pile di immagini separate: una della vista a campo luminoso delle celle e una della vista fluorescente del modello a cui sono collegate.
   1. Se c'è una deriva nelle immagini fluorescenti (cioè, l'isola di interesse si muove nella direzione x e / o y tra ogni fotogramma di >1-2 μm), prima elabora lo stack di immagini con il plugin StackReg (P. Thévenaz, Istituto Federale Svizzero di Tecnologia di Losanna) per ricentrare ogni immagine nello stack in base alla posizione del primo (cliccando su Plugin | | StackReg | di traduzione Va bene).
      NOTA: Questo è fondamentale perché anche la deriva sub-μm può influenzare in modo significativo il calcolo finale delle forze di trazione, specialmente su gel più rigidi in cui questa deriva x-y è al di fuori dell'intervallo di rumore previsto. Questo codice salverà le immagini dopo che la deriva è stata rimossa, che può quindi essere trasformata in una nuova pila di immagini da analizzare.
2. Immettere gli stack di immagini brightfield e fluorescenti in CTFTimelapse.m (File supplementare 2).
   1. Specificare la directory di file in cui si trovano gli stack di immagini nella riga 7.
   2. Sulle righe 8 e 9, specificare rispettivamente i nomi dello stack di immagini fluorescenti e dello stack fluorescente brightfield corrispondente.
   3. Specificare la rigidità del gel PAA (Pa):
      1. Nelle righe 11-14, che includono alcuni diversi moduli elastici di idrogel PAA usati più spesso, commenta (digita % all'inizio della linea) tutti tranne il modulo elastico del gel nelle immagini analizzate. In alternativa, aggiungere il modulo elastico se non già presente e commentare il resto (3658.19 Pa per le immagini di prova).
   4. Specificare il raggio del punto (m) sulla riga 15 (1 × ^10-6 m per le immagini di prova).
   5. Specificare il diametro massimo possibile del punto (μm) sulla riga 16 (2,5 μm per le immagini di prova).
   6. Specificare il rapporto pixel (μm/pixel):
      1. Nelle righe 17-20, che includono alcuni diversi rapporti pixel dell'immagine in base alle impostazioni di imaging utilizzate in precedenza, commenta (digita % all'inizio della riga) tutti tranne il rapporto pixel delle immagini analizzate. In alternativa, aggiungere il rapporto pixel utilizzato se non già presente e commentare il resto (0,1613 μm/pixel per le immagini di prova).
   7. Nelle righe 35 e 87, specificare la directory dei file in cui si trovano i file di elaborazione delle immagini necessari.
      NOTA: dalla pila di immagini fluorescenti, il codice determina la posizione di ciascun punto fluorescente e tiene traccia del movimento di ciascun punto tra ogni immagine nello stack²⁰. La posizione iniziale dei punti stampati a microcontatto è nota perché non si deformano se correttamente trasferiti all'idrogel³².
3. Attendi che appaiano due figure e una finestra di dialogo una volta che il programma trova i punti. Utilizzare la Figura 1 per assicurarsi che il programma abbia trovato i punti corretti e non abbia trovato molti punti dove non ce n'erano. Utilizzare la Figura 2 per scegliere la griglia rettangolare che consente al programma di individuare e calcolare le forze di trazione cellulare.
   NOTA: la Figura 1 è l'immagine in campo luminoso della cella con i punti trovati dal programma (che saranno rossi) sovrapposti su di essa (vedere la Figura 3A). La Figura 2 è un'immagine che mostra gli stessi punti mostrati nella Figura 1 ma senza l'immagine in chiaro sullo sfondo.
   1. Attendere che la finestra di dialogo richieda di premere Invio dopo aver selezionato il punto, in cui ogni punto è uno dei punti rossi trovati dal programma e ha un pulsante grande al suo interno con l'etichetta Invio.
   2. Scegliere quattro punti diversi nella Figura 2 per creare una griglia rettangolare attorno alla cella/cluster in tale modello. Seleziona ogni punto uno per uno con un clic sinistro del mouse e confermalo premendo Invio sul pulsante nella finestra di dialogo di cui sopra. Tieni il conto di quanti punti ci sono tra il primo e il secondo punto e il primo e il terzo punto, poiché il programma chiederà questi valori una volta selezionati tutti i punti a quattro angoli. Immettere questi valori nella finestra di comando (digitare il numero di punti e fare clic sul pulsante Invio sulla tastiera quando richiesto).
4. Una volta scelta la griglia rettangolare, attendere che lo script calcoli le forze di trazione che trova all'interno della griglia in base alle posizioni dei punti fluorescenti. Si noti che lo script trova prima il vettore di spostamento (u) del centro geometrico di ciascun punto e quindi calcola il vettore della forza di trazione corrispondente (F) usando Eq (1):
   (1)
   Dove E è il modulo di Young del substrato PAA, a è il raggio dei marcatori a punti fluorescenti e ν è il rapporto di Poisson del substrato PAA³². Eq (1) presuppone che il substrato sia un semispazio elastico infinito, che le forze di trazione siano applicate al centro di ogni marcatore di punti circolari e che la spaziatura tra i marcatori di punti sia sufficientemente grande in modo che i loro rispettivi spostamenti non interagiscano tra loro²³.
   NOTA: negli esperimenti qui descritti, vengono utilizzati marcatori di punti di raggio a = 1 μm e spaziatura centro-centro di 6 μm. Le frecce della forza di trazione all'interno della cellula/cluster che puntano verso l'interno verso il centro della cellula dovrebbero essere presenti, mentre l'area esterna alla cellula/cluster non dovrebbe avere frecce di trazione presenti (vedere Figura 3C-E). Le frecce di trazione che puntano verso l'esterno dall'interno della cellula/cluster o molte grandi frecce di trazione presenti all'esterno della cella sono indicative di una griglia rettangolare scelta male.
5. Una volta trovato il campo di trazione corretto, selezionare una regione di interesse (ROI) appropriata che circonda la cella/cluster, che include tutte le frecce di trazione all'interno della cella utilizzando il cursore.
   1. Per disegnare il ROI, fare clic con il pulsante sinistro del mouse tutte le volte necessarie per disegnare una forma poligonale con tutti i lati desiderati, regolare la forma o spostare il ROI dopo che è stato disegnato facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sugli angoli o sui bordi, rispettivamente. Una volta disegnato il ROI, fai doppio clic con il pulsante sinistro del mouse per passare all'immagine successiva nello stack. Ripeti questa operazione per tutte le immagini nello stack brightfield.
      NOTA: il codice salverà i dati sulla forza di trazione e sullo spostamento per ogni punto temporale nella stessa cartella degli stack di immagini originali, che possono quindi essere analizzati ulteriormente.

Risultati

Gli idrogel PAA con il modulo di Young di E = 3,6 kPa e il rapporto di Poisson di ν = 0,445 sono stati fatti per l'uso con questo metodo di micropatterning sottrattivo. Gli idrogel sono stati realizzati per avere uno spessore di ~ 100 μm, il che consente loro di essere ripresi con la configurazione di imaging utilizzata qui, impedendo allo stesso tempo alle cellule di rilevare il coverslip rigido sotto il gel, il che causerebbe problemi negli studi incentrati sul rilevamento della rigidità cellulare<...

Discussione

Un metodo migliorato per modellare indirettamente gli idrogel PAA è descritto in questo articolo. Questo approccio si basa su metodi che sono stati utilizzati in precedenza 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Il cambiamento princ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-aminopropyl)trimethoxysilane	Sigma Aldrich	#281778
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	#05-408-129
15 mL conical tube	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask	Advance Reproductions Corporation	N/A	Custom-designed mask
6 Well Plates	Fisher Scientific	#07-200-83
Acetone	Fisher Scientific	#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Aminonium Persulfate	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrylamide	Fisher Scientific	#PR-V3141
Ethanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round	Fisher Scientifc	#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round	Warner	#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera	Hamamatsu	#C10600-10B
Human Plasma	Valley Biomedical	#HP1051P	Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set	Bioptechs	#190310-35
Kim Wipes	Fisher Scientific	#06-666-11C
Mask Alinger	Karl Suss	#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Live Cell Stain	Thermo Fisher	#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope	Olympus	#IX81
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	#52-1308-00
Photoresist Spinner Hood	Headway Research	#PWM32
Plasma Cleaner	Harrick	#PDC-001
Plasma Etcher	TePla	#M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source	Prior Scientific	#L200
Silicon Wafers, 100 mm	University Wafer	#809
SU-8 2005	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9463827
SU-8 Developer	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine	Fisher Scientific	#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Objective	Olympus	#N2709300
UV Flood Exposure	Newport	#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40