JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описаны усовершенствования стандартного метода измерения клеточных тяговых сил, основанного на микроконтактной печати с одной стадией субтрактивного паттерна точечных массивов белков внеклеточного матрикса на мягких гидрогелях. Этот метод позволяет упростить и более последовательное изготовление островных узоров, необходимых для контроля формы клеточного кластера.

Аннотация

Микроструктурная тракционная микроскопия позволяет контролировать форму отдельных клеток и клеточных кластеров. Кроме того, способность формировать рисунок на микрометровой шкале длины позволяет использовать эти узорчатые контактные зоны для измерения тяговых сил, поскольку каждая микроструктурированная точка позволяет формировать единую фокальную адгезию, которая затем деформирует мягкий, лежащий в основе гидрогель. Этот подход был использован для широкого спектра типов клеток, включая эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки, фибробласты, тромбоциты и эпителиальные клетки.

В этом обзоре описывается эволюция методов, которые позволяют печатать белки внеклеточного матрикса на полиакриламидных гидрогелях в регулярном массиве точек заранее определенного размера и интервала. Поскольку микрометровые узоры трудно непосредственно напечатать на мягких подложках, узоры сначала генерируются на жестких стеклянных крышках, которые затем используются для переноса рисунка на гидрогель во время гелеобразования. Во-первых, описан оригинальный подход микроконтактной печати для генерации массивов мелких точек на обложке. Второй шаг, который удаляет большую часть узора, чтобы оставить островки маленьких точек, необходим для управления формами клеток и клеточных кластеров на таких массивах узорчатых точек.

Далее описывается эволюция этого подхода, позволяющая генерировать островки точек с помощью одного стадии субтрактивного паттерна. Этот подход значительно упрощен для пользователя, но имеет недостаток в уменьшенном сроке службы для мастер-формы, необходимой для изготовления узоров. Наконец, описаны вычислительные подходы, которые были разработаны для анализа изображений смещенных точек и последующих клеточных тяговых полей, и предоставлены обновленные версии этих пакетов анализа.

Введение

Большинство клеточных фенотипов оказывают тяговые силы на окружающую среду. Эти тяговые силы генерируются сократительным цитоскелетом клетки, который представляет собой сеть актина и миозина, а также другими нитевидными биополимерами и сшивающими белками 1,2,3,4. Силы, генерируемые внутри клетки, могут передаваться во внеклеточную среду или соседние клетки, главным образом через трансмембранные белки, такие как интегрины и кадгерины, соответственно 5,6. То, как клетка распространяется или сжимается, и величины тяговых сил, связанных с этими движениями, является результатом тесного разговора с окружающей средой, который во многом зависит от типа и количества белка, присутствующего во внеклеточном матриксе (ECM)7,8 и жесткости ECM. Действительно, тракционная микроскопия стала бесценным инструментом для понимания реакции клеток на локальные раздражители, такие как жесткость субстрата, наложенные механические напряжения и деформации или контакт с другими клетками. Эта информация имеет непосредственное отношение к пониманию таких заболеваний, как рак и астма 9,10,11,12.

Система, которая может быть использована для измерения вызванной силой деформации подложки с известными свойствами материала, необходима для расчета тяговых сил. Эти изменения должны отслеживаться с течением времени, требуя как визуализации, так и методов обработки изображений. Одним из первых методов, используемых для определения клеточных тяговых сил, было наблюдение и анализ сокращения коллагеновых гидрогелей, засеянных клетками, хотя этот метод был только полуколичественным13. Другой, более совершенный метод заключался в измерении тяговых сил, оказываемых одиночными ячейками, путем определения сил, возникающих в результате деформации тонкого листа силикона14. Позже были разработаны более количественные методы измерения, и эти методы также позволили использовать мягкие гидрогели, такие как полиакриламид (PAA)12,15,16. При использовании этих мягких материалов тяговые силы могут быть определены по вызванному силой смещению случайно смещенных шариков, встроенных в гидрогель, и механическим свойствамгеля 16,17. Еще одним достижением стала разработка микропостовых массивов из мягкого полидиметилсилоксана (PDMS), чтобы их отклонение можно было измерить и преобразовать в силу с использованием теории пучка18.

Наконец, были разработаны методы микроструктурирования мягких гидрогелей, поскольку эти подходы позволяют контролировать контактные зоны для клеточной адгезии. Измеряя деформацию микрошаблона в области контакта ячейки, можно легко рассчитать силы тяги, поскольку не требуется безсиловое опорное изображение19. Этот метод получил широкое распространение, поскольку он позволяет косвенно моделировать регулярный массив дискретных флуоресцентных точек адгезии белка микронного размера на гелях PAA для измерения клеточных тяговых сил20. Для расчета этих сил был разработан алгоритм обработки изображений, который может отслеживать движения каждой микроструктурированной точки, не требуя ввода данных пользователем21.

Хотя этот метод прост для создания целых сеток точечных узоров, он более сложен, когда требуются узоры изолированных участков (или островков) точек. Микроструктурированные острова полезны, когда необходим контроль формы и в некоторой степени размера кластеров клеток. Для создания этих островов вышеупомянутый метод микроконтактной печати требует двух отдельных этапов: i) использование одного штампа PDMS для создания высокоточного рисунка точек на обложке, а затем ii) использование второго другого штампа PDMS для удаления большинства этих точек, оставляя после себя изолированные островкиточек 21. Сложность создания островов с помощью этого оригинального метода усугубляется тем фактом, что создание последовательных шаблонов сетки на первом этапе процесса само по себе является сложной задачей. Микропечатные штампы состоят из массива круглых микропостов, диаметр которых соответствует желаемому размеру точки. Эти штампы затем покрываются ровным слоем белка, а затем штампуются с точным давлением на обработанные крышки для создания желаемого рисунка. С одной стороны, слишком большое давление на штамп может привести к неравномерному переносу белка и плохой точности рисунка из-за изгиба или провисания между столбами, что приводит к контакту со стеклом. С другой стороны, применение слишком малого давления приводит к незначительному или нулевому переносу белка и плохой точности рисунка. По этим причинам желателен процесс переноса, который может быть использован для последовательного создания высококачественных микроструктур изолированных островков точек всего за один шаг.

В настоящем описан способ непрямого микроструктурирования островков флуоресцентных точек адгезии белка микронного размера на геле PAA, который является более последовательным и универсальным, чем ранее разработанные способы. В то время как более старые методы косвенного микроструктурирования полагаются на перенос белковых паттернов от штампа PDMS к промежуточному субстрату, метод, представленный здесь, использует штампы PDMS вместо этого в качестве сосуда для удаления белка, а не для добавления. Это делается путем сначала фундаментального изменения структуры используемых марок PDMS. Вместо того, чтобы делать штампы, которые состоят из узора из равномерно расположенных круглых столбов, штампы состоят из шаблона равномерно расположенных круглых отверстий в этом методе.

С этой новой структурой поверхность этих штампов PDMS затем может быть обработана глутаровым альдегидом, как описано ранее 20,29,30, что делает штамп способным ковалентно связываться с белком. При использовании на стеклянной крышке, равномерно покрытой флуоресцентным белком, эти обработанные глутаральдегидом штампы PDMS используются для удаления большей части белка на поверхности покровного листа, оставляя после себя только желаемый рисунок точек, предопределенный расположением отверстий микронного размера на штампе. Это изменение увеличивает успешность генерации шаблонов, состоящих из почти непрерывной сетки точек, и для создания изолированных островков точек всего за один шаг.

протокол

1. Создание силиконовых мастеров

ПРИМЕЧАНИЕ: Большая часть процесса проектирования, создания и устранения неисправностей кремниевых мастеров для повторного формования штампов PDMS была рассмотрена ранее21, поэтому здесь будут описаны только ключевые различия в этом новом подходе.

  1. Создайте дизайн для фотомаски с помощью AutoCAD или аналогичного программного обеспечения для проектирования. Покройте одну сторону фотомаски, тонкий кусок стекла, тонким слоем хрома, чтобы контролировать рассеяние ультрафиолетового света. Спроектируйте фотомаску таким образом, чтобы свет через нее ультрафиолетовый свет на выбранный фоторезист создал силиконовый мастер с обратными характеристиками, желаемыми на конечных марках PDMS. Дизайн этой маски см. на рисунке 1 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Должны ли нужные объекты или область за их пределами быть прозрачными на фотомаске, зависит от выбранного фоторезиста. Фоторезист, используемый здесь, - СУ-8 2005 (ОСТОРОЖНО: легковоспламеняющийся, раздражающий кожу и глаза; держитесь подальше от тепла / пламени / искр и используйте защитные перчатки и очки при обращении), отрицательный фоторезист, который способен создавать 5 мкм высотой 5 с почти вертикальными боковинами.
    1. Вылечите отрицательный фоторезист, подвергнув его воздействию ультрафиолетового излучения и удалив неотвержденный СУ-8 химическим растворителем. Поэтому при проектировании основные характеристики маски должны быть прозрачными, в то время как окружающая область маски непрозрачна.
    2. Для этого нового метода удаления спроектируйте фотомаску таким образом, чтобы она состояла из двух квадратов размером 1,5 x 1,5 см (рисунок 1A), один из которых полон ровной сетки из 2 мкм кругов, расположенных от центра до центра 6 мкм, а другой состоит из множества квадратных островов, которые являются меньшими, изолированными версиями того же рисунка сетки (рисунок 1B). Сделайте острова следующих размеров: 6 x 6 точек, 12 x 12 точек, 25 x 25 точек и 42 x 42 точки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр точек адгезии (2 мкм) был выбран на основе предыдущих исследований, в которых измерялись клеточные тяговые силы22,23. Используемая здесь маска имеет размеры 101,6 х 101,6 мм и покрыта с одной стороны слоем хрома толщиной 0,06 мкм, что рекомендуется из-за небольших особенностей мастера. Используемая здесь фотомака была заказана у внешней компании по печати фотомаск.
  2. В чистом помещении равномерно покройте выбранную кремниевую пластину фоторезистом. В качестве дополнительного этапа обработайте поверхность пластины плазменным ашером, прежде чем покрыть ее резистом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используются пластины диаметром 100 мм. Лечение в плазменном ашере делает пластину более поддающейся связыванию с СУ-8 и помогает предотвратить расслоение СУ-8 от пластины.
  3. Выполните следующие действия в соответствии с инструкциями производителя фоторезиста:
    1. Открутите пластину с покрытием для создания желаемой толщины, варьируя время отжима в зависимости от желаемой толщины и типа сопротивления. Для СУ-8 2005 толщиной 5 мкм разделите рекомендуемую программу отжима на следующие три этапа:
      1. Покройте пластину фоторезистом, вращаясь со скоростью 500 об/мин в течение 10 с рампой 100 об/мин/с.
      2. Уменьшите толщину сопротивления примерно до 5 мкм, вращая пластину со скоростью 3000 об/мин с рампой 300 об/мин в течение 30 с.
      3. Медленно замедляйте пластину после вращения, уменьшая скорость до 0 RMP с рампой 500 об/мин/с в течение 1 с.
    2. Подготовьте резистент к воздействию ультрафиолета, кратковременно выпекая его на конфорке при температуре 95 °C. Изменяйте время, затрачиваемое на конфорку, в соответствии с желаемой толщиной резистента; Время выпечки 2 мин для СУ-8 толщиной 5 мкм 2005.
    3. Подвергайте сопротивление воздействию ультрафиолетового света, чтобы полностью вылечить желаемые функции. Будьте осторожны с передержкой, так как это может сделать СУ-8 хрупким и повлиять на общее качество получаемого мастера.
      1. Используйте энергию воздействия 105 мДж/см2 для СУ-8 толщиной 5 мкм 2005 года. Исходя из мощности имеющейся УФ-лампы, рассчитайте время экспозиции, разделив энергию экспозиции на мощность лампы в мВт.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку используемая здесь лампа имеет мощность 8 мВт, время экспозиции должно составлять 13,1 с.
    4. Чтобы установить функции СУ-8 после разработки, снова выпекайте на конфорке с температурой 95 °C, на этот раз в течение 3 минут. Подождите, пока желаемые черты мастера появятся в течение 1 минуты во время этого этапа выпечки, если сопротивление было выставлено должным образом.
    5. Извлеките неотвержденный СУ-8 из кремниевой пластины с помощью разработчика СУ-8. Будьте внимательны при удалении неотвержденного СУ-8, так как он может застрять между микронными размерами и расположенными элементами на пластине.
      ВНИМАНИЕ: Разработчик SU-8 является легковоспламеняющимся раздражителем кожи и глаз; держите его подальше от тепла / пламени / искр и используйте защитные перчатки и очки при обращении с ним.
    6. После разработки промойте ацетоном, чтобы удалить избыток на пластине и полностью высушите ее азотным распылителем.
      ВНИМАНИЕ: Ацетон является легковоспламеняющимся раздражителем кожи и глаз; держите его подальше от пламени / искр и используйте защитные перчатки и очки при обращении с ним.
    7. Опционально, для SU-8 2005, выпекайте на конфорке при температуре 200 °C в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта твердая выпечка добавляет механическую прочность фоторезисту.
  4. После того, как пластина остынет, поместите ее в лоток для носителей пластин, а затем отлить ее в PDMS. Во-первых, завершите силанизацию пластины, чтобы сделать функции SU-8 кремниевого мастера менее склонными к связыванию с PDMS и, следовательно, с меньшей вероятностью будут удалены с поверхности пластины.
    1. Чтобы завершить обработку поверхности силанизации, поместите мастер и небольшой стеклянный покров внутрь осушителя, предназначенного для использования только с силанами. Поместите 1-2 небольшие капли трихлор(1H,1H,2H,2H-перфтороктил)силана на крышку, закройте осушитель и запустите его под вакуумом в течение 30 мин при давлении 4,500 Па24.
      ВНИМАНИЕ: Трихлор(1H,1H,2H,2H-перфтороктил)силан является легковоспламеняющимся раздражителем кожи и глаз; держите его подальше от тепла / пламени / искр, используйте защитные перчатки и очки при обращении и работайте под вытяжным капюшоном.
    2. Выключите вакуум и оставьте мастер и крышку в осушителе еще на 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мастер теперь готов к кастингу в PDMS.

2. Субтрактивная микроконтактная печать

  1. Смешайте PDMS в правильном соотношении отверждающего агента к основанию на основании на основании. Дайте ему постоять при комнатной температуре и давлении в течение 15 минут; затем дегазировать под вакуумом в течение 15 мин.
  2. Налейте PDMS в мастер и поместите его в инкубатор, установленный на 37 ° C на ночь, чтобы вылечить.
  3. Выньте хозяина из инкубатора и дайте ему остыть до комнатной температуры.
  4. Пока мастер остывает, ультразвуком 25 мм покрывает этанол в течение 10 мин. Используйте столько обложек, сколько составляет количество подготавливаемых марок.
  5. Тщательно промойте 25-мм крышки деионизированной (DI) водой и высушите с помощью фильтрованного пневматического пистолета.
  6. Плазменно обрабатывают крышки в течение 1 мин с помощью плазмоочистителя под вакуумом на высоком уровне (радиочастотная мощность 30 Вт). Обязательно медленно освобождайте вакуум после обработки, чтобы предотвратить перемещение покровов внутрь камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плазменная обработка поверхности стекла служит двум целям: она очищает поверхность стекла для удаления загрязнений и генерирует полярные группы на основе кислорода на поверхности стекла, чтобы сделать его гидрофобным25. Эта гидрофобность делает поверхность стекла более восприимчивой к связыванию с белками.
  7. В помещении, лишенном прямых солнечных лучей/верхнего освещения, покройте каждую крышку 100 мкл флуоресцентно-меченого белкового раствора в концентрации не менее 100 мкг/мл, накройте крышкой для дополнительной защиты от света и оставьте на 20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется фибронектин, выделенный из плазмы человека и окрашенный AlexaFluor 488.
    1. Чтобы красить фибронектин, комбинируйте немаркированный фибронектин известной концентрации и объема с соответствующим количеством флуоресцентного красителя в пробирке объемом 1,5 мл. Накройте трубку алюминиевой фольгой для защиты красителя от света и высиживайте его при комнатной температуре в течение 1 ч, осторожно перемешивая каждые 10 мин, переворачивая трубку вверх дном 5-10 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество требуемого красителя варьируется в зависимости от используемого красителя и массы используемого белка. Калькулятор, используемый для определения соответствующего количества красителя для фибронектина, помеченного Alexa 488, см. в дополнительном файле 1 . Согласно инструкции производителя, избыток красителя может быть отфильтрован с использованием обессоливающих колонн (см. Таблицу материалов).
  8. Тщательно промойте каждую крышку водой DI и удалите лишнюю воду с поверхности, осторожно постукивая по бокам каждой крышки на бумажное полотенце или аналогичный абсорбирующий материал. Оставьте покровные листы непокрытыми в темноте не менее чем на 30 минут, чтобы они полностью высохли.
  9. Пока покрытые белком покровы высыхают, снимите штамп PDMS с мастера, разрезав его скальпелем или другим острым лезвием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше не пытаться разрезать PDMS с первой попытки, так как применение такого большого давления расколет кремниевую пластину и повредит мастера.
  10. Плазменная обработка штампов PDMS в течение 2 мин под вакуумом на высоком уровне (радиочастотная мощность 30 Вт).
  11. Внутри вытяжного шкафа поместите штампы в контейнер с крышкой и покройте каждую марку очень тонким слоем (<100 мкл) 10% (3-аминопропил)триметоксисилана (3-APTMS), разбавленного в 100% этаноле.
    ВНИМАНИЕ: 3-APTMS является легковоспламеняющимся раздражителем кожи и глаз; держите его подальше от пламени / искр, используйте защитные перчатки и очки при обращении и работайте под вытяжным капюшоном. Чрезмерное покрытие раствором 3-APTMS приведет к образованию оранжевой пленки позже в этом процессе. Эта обработка поверхности 3-APTMS включает в себя аминную функциональность в поверхности штампа PDMS, что позволит продолжить дериватизацию поверхности штампа позже на26.
  12. Накройте контейнер штампами и дайте им постоять при комнатной температуре в течение 5 минут.
  13. Используя воду DI, тщательно промойте каждый штамп с обеих сторон.
  14. Поместите штампы в чистую емкость и обильно покройте их 2,5% глутаровым альдегидом в воде DI.
    ВНИМАНИЕ: Глутаральдегид токсичен; использовать защитные перчатки и очки при обращении и работе под вытяжным капюшоном). Эта обработка глутаральдегидом наряду с предыдущей обработкой 3-APTMS обеспечивает функциональность альдегида на поверхности штампов PDMS, которые могут реагировать с аминными группами в белках с созданием вторичной аминной связи, что имеет решающее значение для процесса удаления белка27.
  15. Накройте штампы, дайте им постоять при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем снова тщательно промойте водой DI. Удалите лишнюю воду с поверхности штампов таким же образом, как и крышки, и дайте штампам высохнуть непокрытыми в течение ~ 30 минут.
  16. Через 30 минут проверьте, сухи ли покрытые белком покровы и штампы. Если они не полностью высохли, используйте фильтрованный воздушный пистолет, чтобы полностью высушить их, гарантируя, что крышки не подвергаются воздействию света в течение длительного периода.
  17. После того, как крышки и штампы высохнут, нажмите узор штампов стороной вниз на крышки с достаточным давлением, чтобы штампы полностью соприкасались с поверхностью крышки. Оставьте штампы в контакте с обложеками на 15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за ковалентной амидной связи между клеймом глутаральдегида и белковым слоем на стеклянном покровном листе, который намного сильнее, чем слабые гидрофобные взаимодействия между белковым слоем и стеклянным покровным листом, белки должны отслаиваться от стекла в соответствии с рисунком на штампе PDMS после его удаления.
  18. Через 15 мин аккуратно снимите штампы PDMS с обложек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если процесс снятия работал правильно, штампы не должны отрываться от обложек без сопротивления, но также не должны быть настолько прочно прикреплены к чехлам, чтобы их нельзя было снять без чрезмерного усилия.
  19. Проверьте точность узорчатых обложек с помощью соответствующего фильтра на флуоресцентном микроскопе (в зависимости от того, каким флуоресцентным красителем отмечены белки).
  20. Немедленно используйте узорчатые крышки или сохраните и храните их вдали от прямого света.

3. Активированные чехлы

ПРИМЕЧАНИЕ: Нижние крышки для использования в экспериментальной камере для гелей PAA изготовлены на этой стадии. Эта нижняя крышка специально обработана, чтобы гель PAA оставался надежно приклеенным, поскольку верхний узорчатый покров удаляется во время процесса моделирования. Подобные методы также описаны в других местах 10,12,15,28.

  1. Ультраникат 30 мм покрывает 100% этанолом в течение 10 мин, смывает водой DI, а затем тщательно высушивает фильтрованным воздушным пистолетом. Подготовьте до 6 обложек за раз на партию в 6-луночной пластине.
  2. Плазмой обрабатывают крышки в течение 1 мин на высоком уровне (радиочастотная мощность 30 Вт), а затем помещают каждый покров в колодец из 6 скважинной пластины.
  3. Покройте каждую крышку очень тонким слоем 5% APTMS в этаноле в вытяжном капюшоне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оранжевый остаток образуется в случае чрезмерного покрытия в этом процессе.
  4. Накройте 6-луночную пластину и дайте обшивкам постоять в течение 5 минут.
  5. Тщательно промойте крышки (с обеих сторон) и внутреннюю часть каждой скважины водой DI и удалите лишнюю воду внутри колодцев.
  6. Поместите крышки обратно в 6-луночную пластину и добавьте примерно 2 мл 0,5% глутарового альдегида в воду DI.
  7. Накройте 6-луночную пластину и дайте обшивкам постоять в растворе глутарового альдегида в течение 30 минут; затем тщательно промойте как крышки, так и колодцы каждой пластины водой DI.
  8. Храните обработанные крышки в воде DI в 6-луночных пластинах в течение двух недель или используйте их немедленно. Убедитесь, что крышки полностью высохли перед использованием.

4. Изготовление геля PAA и перенос рисунка

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как узорчатые покровы сделаны, они должны быть использованы для переноса этих белковых паттернов в гидрогель PAA вскоре после этого (<24 ч)1,29,30. Следующий рецепт предназначен для геля PAA с модулем Юнга 3,6 кПа. Количество бис-акриламида, акриламида и воды DI можно варьировать для регулировки жесткости гелей PAA12.

  1. Непосредственно перед началом изготовления предшественника гидрогеля PAA удалите эфир N-гидроксисукцинимида акриловой кислоты (NHS) из холодильника, чтобы он мог достичь комнатной температуры перед открытием. Приготовьте сменную крышку тарелки, стерилизовав ее 70% этанолом и давая ей постоять под ультрафиолетовым светом в шкафу для биобезопасности в течение не менее 30 минут перед использованием.
    ВНИМАНИЕ: NHS является токсичным раздражителем кожи и глаз; используйте защитные перчатки и очки при обращении с ним, и работайте под вытяжным капюшоном.
    1. Добавьте 1,25 мл 40% акриламида в воду DI в коническую трубку объемом 15 мл.
      ВНИМАНИЕ: Акриламид является токсичным раздражителем для кожи и глаз; используйте защитные перчатки и очки при обращении с ним, и работайте под вытяжным капюшоном.
    2. Добавьте 175 мкл раствора бис-акриламида в воде DI в ту же пробирку (этап 4.1.1).
      ВНИМАНИЕ: Бис-акриламид является токсичным раздражителем кожи и глаз; используйте защитные перчатки и очки при обращении с ним, и работайте под вытяжным капюшоном.
    3. Добавьте 500 мкл 10-кратного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
      ВНИМАНИЕ: PBS является раздражителем глаз; используйте защитные перчатки и очки при обращении.
    4. Добавьте 2,915 мл воды DI.
  2. Пипетка 969 мкл этого прекурсора в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, а остальное хранит при 4 °C до двух недель.
  3. Отмерьте ~50-100 мг персульфата аммония (АФС) в другой микроцентрифужной трубке и разбавьте его в воде DI до 100 мг/мл; отложите его для использования позже. Откройте эфир NHS (теперь при комнатной температуре) в капоте и тщательно отмерьте до 3 мг NHS в микроцентрифужной трубке. Развести NHS-эфир до 1 мг/мл в 1x PBS.
    ВНИМАНИЕ: АФС является раздражителем кожи и глаз; используйте защитные перчатки и очки при обращении с ним, и работайте под вытяжным капюшоном. Как APS, так и NHS-эфир будут гидролизоваться с течением времени, в результате чего активность химических веществ в исходном растворе будет варьироваться. Поэтому оба этих раствора необходимо каждый раз готовить свежими (в отличие от остальных предшественников).
  4. Выполните следующие три шага в вытяжке:
    1. Добавьте 2 мкл тетраметилэтилендиамина (TEMED) в микроцентрифужную трубку, содержащую 969 мкл аликвоты предшественника PAA.
      ВНИМАНИЕ: TEMED является легковоспламеняющимся раздражителем кожи и глаз; держите его подальше от тепла / пламени / искр, используйте защитные перчатки и очки при обращении и работайте под вытяжным капюшоном. TEMED является одним из двух сшивающих агентов, критически важных для полимеризации гидрогеля PAA, другим является APS.
    2. Добавьте 15 мкл 1 М соляной кислоты, чтобы уменьшить рН раствора гидрогеля и избежать гидролиза NHS-эфира.
      ВНИМАНИЕ: Соляная кислота является коррозионным раздражителем для кожи и глаз; используйте защитные перчатки и очки при обращении с ним, и работайте под вытяжным капюшоном.
    3. Добавьте 10 мкл раствора NHS-эфира в пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: NHS имеет решающее значение для процесса моделирования. Он будет реагировать с аминными группами в белках на узорчатом покровном листе с образованием стабильной амидной связи, которая позволит переносить рисунок со стеклянной крышки на поверхность геля PAA при полимеризации31.
  5. Выполните следующие заключительные шаги в шкафу биобезопасности:
    1. Аккуратно поместите 30-миллиметровую крышку в металлическую часть комплекта блюд крышки (3-APTMS и обработанная глутаральдегидом сторона вверх) и прикрутите пластиковое кольцо сверху. Настройте узорчатую крышку так, чтобы до нее можно было легко добраться на следующем шаге, при этом максимально защищая ее от света.
    2. Пипетка 5 мкл раствора APS в остальную часть предшественника PAA в микроцентрифужной трубке, инвертируйте его для смешивания, а затем немедленно пипетку 35 мкл этого раствора на крышку 30 мм.
    3. Опустите узорчатый покровный белок стороной вниз на раствор, стараясь не создавать пузырьки воздуха в гидрогеле. Защитите гидрогель от света и дайте ему полимеризоваться в течение 90 мин.
    4. После того, как гидрогель полимеризовался, используйте лезвие бритвы или скальпель, чтобы удалить верхнюю крышку, гарантируя, что крышка не соскользнет с геля или не упадет обратно на гель после его удаления, так как это испортит рисунок на поверхности геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте гель непокрытым в области со значительным воздушным потоком (например, в шкафу биобезопасности).
    5. Чтобы пассивировать любой оставшийся NHS-эфир в гидрогеле, добавьте 2 мл стерильного PBS в гель и инкубируйте при 37 °C в течение 45 мин. Немедленно подготовьте гели для экспериментов или храните их на ночь в стерильном PBS при 4 °C до использования.

5. Визуализация

  1. Чтобы подготовиться к экспериментам с клетками, включите тепло (37 ° C) и влажность (70%) в микроскопе во второй половине дня перед запланированным экспериментом, чтобы позволить оборудованию внутри камеры микроскопа уравновеситься до более высокой температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг минимизирует z-дрейф, вызванный колебаниями температуры.
  2. Непосредственно перед началом эксперимента включите источник CO2 в камере.
  3. Чтобы предотвратить дрейф x-y, вызванный повторным движением ступени микроскопа во время эксперимента, зафиксируйте сменный комплект подкрыльевых тарелок, удерживающий засеянный клетками гидрогель, на ступень с помощью двусторонней ленты.
  4. Посмотрите на гель, чтобы найти рамки, представляющие интерес для изображения, сохраняя каждое положение этапа разделов, которые будут изображены.
  5. Как в ярком поле, так и в флуоресцентном виде, соответствующем меченому белку, настройте программное обеспечение микроскопа на изображение каждого кадра один раз в 5 минут в течение 2 часов.

6. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Была разработана система, которая может измерять деформацию узорчатых гелей PAA путем определения местоположения точек вытяжения, интерполяции начальных местоположений деформированных точек, а затем расчета клеточных тяговых сил в каждом месте. Может быть использована любая программная система, способная выполнять обработку изображений и численные вычисления. Программа направлена на быстрое определение тяговых сил, устраняя пользовательский ввод и процедуры предварительной обработки, которые будут способствовать ошибкам, связанным с пользователем. Код, используемый здесь, доступен здесь в виде дополнительных файлов 2-10, и эти файлы вместе с парой изображений практики можно получить по www.bu.edu/mml/downloads.

  1. В программном обеспечении для обработки изображений откройте все отдельные изображения, сделанные во время эксперимента с таймлапсом, из каждого используемого вида микроскопа по порядку, от первого до последнего захваченного изображения, и превратите их в единый стек изображений (нажав на Image | Стеки | Изображения в стек). Убедитесь, что есть два отдельных стека изображений: один из ярких полей ячеек и один из флуоресцентного вида рисунка, к которому они прикреплены.
    1. Если флуоресцентные изображения дрейфуют (т.е. интересующий остров перемещается в направлении x и/или y между каждым кадром на >1-2 мкм), сначала обработайте стек изображений с помощью плагина StackReg (P. Thévenaz, Швейцарский федеральный технологический институт Лозанны), чтобы переориентировать каждое изображение в стеке на основе положения первого (нажав на плагины | СтекРег | Перевод | Хорошо).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это имеет решающее значение, потому что даже дрейф ниже мкм может значительно повлиять на окончательный расчет тяговых сил, особенно на более жестких гелях, где этот дрейф x-y находится за пределами диапазона ожидаемого шума. Этот код сохранит изображения после удаления дрейфа, которые затем могут быть преобразованы в новый стек изображений для анализа.
  2. Введите стеки яркого поля и флуоресцентного изображения в CTFTimelapse.m (Дополнительный файл 2).
    1. Укажите каталог файла, в котором расположены стеки изображений, в строке 7.
    2. В строках 8 и 9 укажите названия флуоресцентного стека изображений и соответствующего флуоресцентного стека яркого поля соответственно.
    3. Укажите жесткость геля PAA (Pa):
      1. В строках 11-14, которые включают в себя несколько различных модулей упругости гидрогелей ПАА, используемых чаще всего, комментируйте (тип % в начале линии) все, кроме модуля упругости геля на анализируемых изображениях. В качестве альтернативы можно добавить модуль упругости, если он еще не присутствует, и закомментировать остальные (3658,19 Па для тестовых изображений).
    4. Укажите радиус точки (м) в строке 15 (1 × 10-6 м для тестовых изображений).
    5. Укажите максимально возможный диаметр точки (мкм) в строке 16 (2,5 мкм для тестовых изображений).
    6. Укажите соотношение пикселей (мкм/пиксель):
      1. В строках 17-20, которые включают в себя несколько различных соотношений пикселей изображения, основанных на настройках изображения, используемых ранее, закомментируйте (наберите % в начале строки) все, кроме соотношения пикселей анализируемых изображений. Кроме того, можно добавить используемое соотношение пикселей, если оно еще не присутствует, и закомментировать остальные (0,1613 мкм/пиксель для тестовых изображений).
    7. В строках 35 и 87 укажите каталог файлов, в котором находятся необходимые файлы обработки изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из флуоресцентного стека изображений код определяет местоположение каждой флуоресцентной точки и отслеживает движение каждой точки между каждым изображением в стеке20. Исходное положение микроконтактных печатных точек известно, поскольку они не деформируются при правильном переносе в гидрогель32.
  3. Подождите, пока появятся две цифры и одно диалоговое окно, как только программа найдет точки. Используйте рисунок 1 , чтобы убедиться, что программа нашла правильные точки и не нашла много точек там, где их не было. Используйте рисунок 2 , чтобы выбрать прямоугольную сетку, которая помогает программе находить и вычислять клеточные тяговые силы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 1 представляет собой яркое изображение ячейки с точками, найденными программой (которые будут красными), наложенными на нее (см. Рисунок 3A). Рисунок 2 представляет собой изображение, отображающее те же точки, что и на рисунке 1 , но без изображения яркого поля на заднем плане.
    1. Подождите, пока диалоговое окно предложит нажать клавишу ВВОД после выбора точки, где каждая точка является одной из красных точек, найденных программой, и внутри нее есть одна большая кнопка с надписью Enter.
    2. Выберите четыре разные точки на рисунке 2 , чтобы создать прямоугольную сетку вокруг и включить ячейку/кластер на этом шаблоне. Выделите каждую точку по одной левым щелчком мыши и подтвердите это, нажав Enter на кнопке в вышеупомянутом диалоговом окне. Подсчитайте, сколько точек находится между первой и второй точками, а также первой и третьей точками, так как программа запросит эти значения, как только все четырехугольные точки будут выбраны. Введите эти значения в командное окно (введите количество точек и нажмите кнопку ввода на клавиатуре при появлении соответствующего запроса).
  4. После того, как прямоугольная сетка выбрана, подождите, пока скрипт рассчитает тяговые силы, которые он находит в сетке, на основе расположения флуоресцентных точек. Обратите внимание, что скрипт сначала находит вектор смещения (u) геометрического центра каждой точки, а затем вычисляет соответствующий вектор силы тяги (F), используя Eq (1):
    figure-protocol-28217(1)
    Где E — модуль Юнга подложки PAA, a — радиус флуоресцентных точечных маркеров, а ν — отношение Пуассона к подложке PAA32. Eq (1) предполагает, что подложка представляет собой бесконечное упругое полупространство, что силы тяги приложены в центре каждого круглого точечного маркера и что расстояние между точечными маркерами достаточно велико, чтобы их соответствующие смещения не взаимодействовали друг с другом23.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах, описанных здесь, используются точечные маркеры радиуса a = 1 мкм и 6 мкм между центрами. Стрелки силы тяги внутри ячейки/кластера, указывающие внутрь к центру ячейки, должны присутствовать, в то время как область за пределами ячейки/кластера не должна иметь тяговых стрелок (см. Рисунок 3C-E). Стрелки тяги, указывающие наружу изнутри ячейки/кластера, или множество больших стрелок тяги, присутствующих за пределами ячейки, указывают на плохо выбранную прямоугольную сетку.
  5. После того, как правильное поле тяги найдено, выберите соответствующую интересующую область (ROI), окружающую ячейку/кластер, которая включает в себя все стрелки тяги внутри ячейки с помощью курсора.
    1. Чтобы нарисовать рентабельность инвестиций, щелкните левой кнопкой мыши столько раз, сколько необходимо, чтобы нарисовать полигональную фигуру с таким количеством сторон, как нужно, отрегулируйте фигуру или переместите рентабельность инвестиций после того, как она будет нарисована, щелкнув левой кнопкой мыши по углам или краям соответственно. После того, как рентабельность инвестиций будет нарисована, дважды щелкните левой кнопкой мыши , чтобы перейти к следующему изображению в стеке. Повторите это для всех изображений в стеке brightfield.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Код будет сохранять данные о тяговом усилии и смещении для каждой точки времени в той же папке, что и исходные стеки изображений, которые затем могут быть проанализированы дальше.

Результаты

Гидрогели PAA с модулем Юнга E = 3,6 кПа и отношением Пуассона ν = 0,445 были изготовлены для использования этим методом субтрактивного микроструктурирования. Гидрогели были сделаны толщиной ~ 100 мкм, что позволяет их визуализировать с помощью используемой здесь установки визуализа?...

Обсуждение

В данной работе описан усовершенствованный метод косвенного моделирования гидрогелей ПАА. Этот подход основан на методах, которые использовались ранее 20,35,36,37,38,39,40,41,42.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Пола Барбоуна с факультета машиностроения Бостонского университета за полезные обсуждения и помощь в анализе данных. Это исследование было поддержано грантом NSF CMMI-1910401.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-aminopropyl)trimethoxysilaneSigma Aldrich#281778
1.5 mL Microcentrifuge tubeFisher Scientific#05-408-129
15 mL conical tubeFisher Scientific#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome PhotomaskAdvance Reproductions CorporationN/ACustom-designed mask
6 Well PlatesFisher Scientific#07-200-83
AcetoneFisher Scientific#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%Sigma Aldrich#A4058
AlexaFluor 488Thermo Fisher#A20000
Aminonium PersulfateFisher Scientific#BP179-25
BisacrylamideFisher Scientific#PR-V3141
EthanolGreenfield Global#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm roundFisher Scientifc#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm roundWarner#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 CameraHamamatsu#C10600-10B
Human PlasmaValley Biomedical#HP1051PUsed to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 NMillipore Sigma#1.09057
ImageJWayne Rasband#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish SetBioptechs#190310-35
Kim WipesFisher Scientific#06-666-11C
Mask AlingerKarl Suss#MA6
Matlab 2021Mathworks#R2021a
MetaMorph BasicMolecular Devices#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide esterSigma Aldrich#130672-5G
NucBlue Live Cell StainThermo Fisher#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted MicroscopeOlympus#IX81
PD-10 Desalting ColumnsGE Healthcare#52-1308-00
Photoresist Spinner HoodHeadway Research#PWM32
Plasma CleanerHarrick#PDC-001
Plasma EtcherTePla#M4L
Prior Lumen 200Pro Light SourcePrior Scientific#L200
Silicon Wafers, 100 mmUniversity Wafer#809
SU-8 2005Kayaku Advanced Materials Inc.#NC9463827
SU-8 DeveloperKayaku Advanced Materials Inc.#NC9901158
Sylgard 184 Silicone ElastomerEssex Brownell#DC-184-1.1
TetramethylethylenediamineFisher Scientific#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaneSigma Aldrich#448931
UAPON-40XW340 ObjectiveOlympus#N2709300
UV Flood ExposureNewport#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mmTed Pella, Inc.#19395-40

Ссылки

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
  4. Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
  5. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  6. Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
  7. Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
  8. Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , 11-22 (2011).
  9. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  10. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
  11. Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
  12. Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
  13. Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
  14. Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
  15. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
  16. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  17. Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
  18. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  19. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  21. Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
  22. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  23. Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), 041923 (2008).
  24. . Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249 Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007)
  25. Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
  26. Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
  27. Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
  28. Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
  29. Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
  30. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
  31. Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
  32. Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
  33. Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  34. Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
  35. Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
  36. Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
  37. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
  38. Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
  39. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
  40. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  41. Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
  42. Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
  43. Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
  44. Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  45. Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
  46. Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены