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要約

我々は、軟質ヒドロゲル上の細胞外マトリックスタンパク質のドットアレイの単一の減法パターニングステップによるマイクロコンタクト印刷に基づく、細胞牽引力を測定するための標準的な方法の改善を説明する。この方法は、細胞クラスター形状を制御するために不可欠な島パターンのより簡単でより一貫した作製を可能にする。

要約

マイクロパターン牽引顕微鏡は、単一細胞および細胞集塊の形状の制御を可能にする。さらに、マイクロメートルの長さスケールでパターニングする能力は、各マイクロパターン化されたドットが、次に柔らかい、下層のヒドロゲルを変形させる単一焦点接着の形成を可能にするので、牽引力の測定のためにこれらのパターン化された接触ゾーンの使用を可能にする。このアプローチは、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、血小板、および上皮細胞を含む広範囲の細胞型に使用されている。

このレビューは、細胞外マトリックスタンパク質を、予め指定されたサイズおよび間隔のドットの規則的な配列でポリアクリルアミドヒドロゲルに印刷することを可能にする技術の進化を説明する。マイクロメートルスケールのパターンは柔らかい基板に直接印刷することは困難であるため、最初に硬いガラスカバースリップ上にパターンが生成され、次いでゲル化中にパターンをヒドロゲルに転写するために使用される。まず、カバースリップ上に小さなドットの配列を生成するためのオリジナルのマイクロコンタクト印刷アプローチについて説明する。パターンの大部分を削除して小さなドットの島を残す 2 番目のステップは、このようなパターン化されたドットの配列上のセルとセル クラスターの形状を制御するために必要です。

次に、単一の減法パターニングステップを使用してドットの島を生成することを可能にするこのアプローチの進化について説明する。このアプローチは、ユーザーにとっては非常に単純化されていますが、パターンの作成に必要なマスターモールドの寿命が短くなるという欠点があります。最後に、変位ドットの画像とその後の細胞生成牽引場の解析のために開発された計算アプローチが説明され、これらの解析パッケージの更新バージョンが提供されます。

概要

ほとんどの細胞表現型は、その環境に牽引力を発揮する。これらの牽引力は、アクチンおよびミオシンのネットワークである細胞の収縮性細胞骨格、ならびに他の糸状生体高分子および架橋タンパク質1、2、3、4によって生成される。細胞内で生成された力は、主にインテグリンおよびカドヘリンなどの膜貫通タンパク質を介して、細胞外環境または隣接する細胞に伝達され得る5、6。細胞がどのように広がり、収縮するか、およびそれらの動きに関連する牽引力の大きさは、その環境との親密な会話の結果であり、これは細胞外マトリックス(ECM)7,8に存在するタンパク質の種類と量、およびECMの剛性に大きく依存する。実際、牽引力顕微鏡は、基質の剛性、機械的応力やひずみ、または他の細胞との接触などの局所刺激に対する細胞の応答性を理解するための非常に貴重なツールとなっています。この情報は、癌や喘息などの疾患の理解に直接関連しています9,10,11,12。

既知の材料特性の基板の力誘起変形を測定するために使用できるシステムは、牽引力を計算するために必要とされる。これらの変化は時間の経過とともに追跡する必要があり、イメージング技術と画像処理技術の両方が必要です。細胞牽引力を決定するために使用された最初の方法の1つは、細胞を播種したコラーゲンヒドロゲルの収縮の観察および分析であったが、この方法は半定量的であった13。別の、より洗練された方法は、シリコーン14の薄いシートの変形から生じる力を決定することによって単一細胞によって加えられる牽引力を測定することであった。その後、より定量的な測定技術が開発され、これらの方法はポリアクリルアミド(PAA)12,15,16などの軟質ヒドロゲルの使用も可能になりました。これらの軟質材料を使用する場合、牽引力は、ヒドロゲルに埋め込まれたランダムに変位したビーズの力誘発変位とゲル16、17の機械的特性から決定することができた。別の進歩は、柔らかいポリジメチルシロキサン(PDMS)で作られたマイクロポストアレイの開発とともにもたらされ、それらのたわみを測定し、ビーム理論18を使用して力に変換することができる。

最後に、軟質ヒドロゲルをマイクロパターニングする方法が、これらのアプローチが細胞接着のための接触領域の制御を可能にするように開発された。細胞の接触領域内のマイクロパターンの変形を測定することにより、力のない基準画像を必要としないため、牽引力を容易に計算することができた19。この方法は、細胞牽引力20の測定のためにPAAゲル上にミクロンサイズの離散蛍光タンパク質接着点の規則的な配列の間接的なパターニングを可能にするため、広く採用されている。これらの力を計算するために、ユーザ入力を必要とせずに各マイクロパターンドットの動きを追跡できる画像処理アルゴリズムが開発された21。

この方法は、ドットパターンのグリッド全体を作成するのは簡単ですが、ドットの孤立したパッチ(またはアイランド)のパターンが必要な場合は、より複雑になります。マイクロパターンの島は、細胞のクラスターの形状やある程度の大きさの制御が必要な場合に便利です。これらの島を作成するために、前述のマイクロコンタクト印刷の方法は、2つの異なるステップを必要とする:i)カバースリップ上にドットの忠実度の高いパターンを作成するために1つのPDMSスタンプを使用し、次いでii)2番目の異なるPDMSスタンプを使用してそれらのドットのほとんどを除去し、ドット21の孤立した島を残す。この独自の方法で島を作成する難しさは、プロセスの最初のステップで一貫したグリッドパターンを作成すること自体が困難であるという事実によってさらに悪化します。マイクロプリントスタンプは、円形マイクロポストのアレイで構成され、その直径は所望のドットサイズに対応する。次に、これらのスタンプを均一なタンパク質層でコーティングし、処理されたカバースリップに正確な量の圧力でスタンプして、所望のパターンを作成します。一方では、スタンプに過度の圧力をかけると、ピラー間の座屈やたるみによる不均一なタンパク質転写やパターン忠実度の低下が生じ、ガラスとの接触につながる可能性があります。一方、圧力が少なすぎると、タンパク質の転写がほとんどまたはまったくなく、パターンの忠実度が低下します。これらの理由から、離島状のドットのマイクロパターンを1ステップで一貫して作成できる転写プロセスが望まれている。

本明細書では、以前に開発された方法よりも一貫性があり汎用性の高いPAAゲル上のミクロンサイズの蛍光タンパク質接着点の島の間接的なマイクロパターニングのための方法が記載されている。古い間接マイクロパターニング法は、PDMSスタンプから中間基板へのタンパク質パターンの転写に依存しているのに対し、ここで紹介する方法は、添加ではなくタンパク質除去のための容器として代わりにPDMSスタンプを使用する。これは、まず使用するPDMSスタンプの構造を根本的に変更することによって行われます。この方法では、等間隔の円形の柱のパターンで構成されるスタンプを作成するのではなく、スタンプは等間隔の円形の穴のパターンで構成されています。

この新しい構造により、これらのPDMSスタンプの表面は、前述のようにグルタルアルデヒドで処理することができ、20、29、30、スタンプをタンパク質と共有結合させることができる。蛍光タンパク質で均等にコーティングされたガラスカバースリップに使用する場合、これらのグルタルアルデヒド処理PDMSスタンプは、カバースリップの表面上のタンパク質の大部分を除去するために使用され、スタンプ上のミクロンサイズの穴の位置によって所定のドットの所望のパターンのみを残す。この変更により、ほぼ連続したドットのグリッドで構成されるパターンを生成し、1 つのステップで孤立したドットの島を作成するための成功率が向上します。

プロトコル

1. シリコーンマスターの創製

メモ:PDMSスタンプの繰り返し成形のためのシリコンマスターの設計、作成、およびトラブルシューティングのプロセスの大部分は、以前に21で説明されているため、この新しいアプローチの主な違いについてのみ説明します。

  1. AutoCAD または同様の設計ソフトウェアを使用して、フォトマスクのデザインを作成します。フォトマスクの片側、薄いガラス片をクロムの薄い層でコーティングして、UV光散乱を制御します。選択したフォトレジストにUV光を照射すると、最終的なPDMSスタンプに必要な機能の逆数を持つシリコーンマスターが作成されるようにフォトマスクを設計します。このマスクの設計については、 図 1 を参照してください。
    注:フォトマスク上で目的の機能またはそれらの外側の領域を透明にするかどうかは、選択したフォトレジストによって異なります。ここで使用されるフォトレジストはSU-8 2005(注意:可燃性、皮膚および眼の刺激性;熱/炎/火花から遠ざけ、取り扱い時には保護手袋および眼鏡を使用する)であり、ほぼ垂直な側壁を有する5μmの高さの特徴を作ることができるネガ型フォトレジストである。
    1. ネガ型フォトレジストをUV光に露光し、未硬化のSU-8を化学溶剤で除去して硬化させる。したがって、マスクの周囲が不透明である間、マスクの主な特徴を透明に設計してください。
    2. この新しい除去方法では、フォトマスクを1.5 x 1.5 cmの2つの正方形(図1A)、1つは中心から中心まで6 μm間隔の2 μmの円の偶数グリッドでいっぱい、もう1つは同じグリッドパターンのより小さく孤立したバージョンである多くの正方形の島で構成されるように設計します(図1B)。6 x 6 ドット、12 x 12 ドット、25 x 25 ドット、42 x 42 ドットの島を作ります。
      注:接着点の直径(2μm)は、細胞牽引力22、23を測定した以前の研究に基づいて選択した。ここで使用されるマスクは101.6 x 101.6 mmで、片側に厚さ0.06 μmのクロム層でコーティングされていますが、これはマスターの小さな特徴のために推奨されます。ここで使用したフォトマスクは、外部のフォトマスク印刷会社から委託を受けたものです。
  2. クリーンルーム内で、選択したシリコンウェーハをフォトレジストで均等にコーティングします。オプションのステップとして、レジストでコーティングする前に、ウェーハをプラズマアッシャーで表面処理します。
    注:ここでは、直径100mmのウェーハが使用されています。プラズマアッシャーでの処理は、ウェーハをSU-8に結合しやすくし、ウェーハからのSU-8の層間剥離を防ぐのに役立ちます。
  3. フォトレジストの製造元の指示に従って、次の手順を実行します。
    1. 塗布されたウェハをスピンさせて所望の特徴厚さを作成し、所望の厚さおよびレジストの種類に基づいてスピン時間を変化させる。厚さ5μmのSU-8 2005の場合、推奨スピンプログラムを次の3つのステップに分けます。
      1. ウェーハをフォトレジストでコーティングするには、500 RPM で 10 秒間回転させ、ランプを 100 RPM/s にします。
      2. 300 RPM/秒のランプで30秒間、ウェーハを3,000 RPMで回転させることで、レジストの厚さを約5 μmに減らします。
      3. 回転後のウェーハをゆっくりと減速させ、500 RPM/s のランプで速度を 0 RMP に下げて 1 秒間減速します。
    2. UV露光用レジストを95°Cのホットプレート上で短時間ベークして準備する。レジストの所望の厚さに従ってホットプレートに費やされる時間を変更する。ベーキング時間は、厚さ5μmのSU-8 2005で2分です。
    3. レジストをUV光にさらして、必要な機能を完全に硬化させます。SU-8を脆くし、結果として得られるマスターの全体的な品質に影響を与える可能性があるため、露出過多に注意してください。
      1. 厚さ5μmのSU-8 2005に105mJ/cm2の露光エネルギーを使用してください。利用可能なUVランプの電力に基づいて、露光エネルギーをランプの電力(mW)で割ることによって露光時間を計算する。
        メモ:ここで使用するランプの電力は8 mWであるため、露光時間は13.1秒にする必要があります。
    4. 現像後にSU-8の特徴を設定するには、95°Cのホットプレートでもう一度3分間焼きます。レジストが適切に露出していれば、このベーキングステップ中にマスターの所望の機能が1分以内に現れるのを待ちます。
    5. SU-8現像液を用いてシリコンウェーハから未硬化のSU-8を除去した。未硬化のSU-8を取り外すときは、ウェーハ上のミクロンサイズと間隔を空けた機能の間に詰まる可能性があるため、徹底してください。
      注意: SU-8 現像剤は可燃性の皮膚および眼刺激性物質です。熱/炎/火花から遠ざけ、取り扱い時には保護手袋と眼鏡を使用してください。
    6. 現像後、アセトンですすぎ、ウェーハ上の余分な現像液を除去し、窒素スプレーガンで完全に乾燥させます。
      警告: アセトンは可燃性の皮膚および眼の刺激性物質です。炎や火花から遠ざけ、取り扱い時には保護手袋と眼鏡を使用してください。
    7. 必要に応じて、SU-8 2005の場合、200°Cのホットプレートで10分間焼く。
      注:このハードベークは、フォトレジストに機械的強度を追加します。
  4. 放冷後、ウェーハをウェーハキャリアトレイに入れ、PDMSで鋳造する。まず、ウェーハのシラン化処理を完了して、シリコンマスターのSU-8機能がPDMSに結合しにくくなり、ウェーハの表面から除去されにくくなります。
    1. シラン化表面処理を完了するには、マスターと小さなガラスカバースリップをシランのみで使用するように指定されたデシケーター内に置きます。トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シランを1〜2滴カバースリップの上に置き、デシケーターを閉じ、4,500Pa24の圧力で30分間真空下で実行します。
      注意:トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シランは可燃性の皮膚および眼の刺激剤です。熱/炎/火花から遠ざけ、取り扱い時には保護手袋と眼鏡を使用し、ヒュームフードの下で作業してください。
    2. 真空をオフにし、マスターとカバースリップをデシケーターにさらに30分間放置します。
      メモ: これで、マスターは PDMS でキャストする準備ができました。

2. 減法マイクロコンタクト印刷

  1. 製造元の指示に従って、硬化剤と主剤の正しい比率でPDMSを混合します。室温と圧力で15分間座らせてください。その後、真空下で15分間脱気する。
  2. PDMSをマスターに注ぎ、37°Cに設定したインキュベーターに一晩入れて硬化させます。
  3. マスターをインキュベーターから取り出し、室温まで冷却します。
  4. マスターが冷却されている間、超音波処理25 mmはエタノール中のカバースリップを10分間処理します。準備する切手の数だけカバースリップを使用してください。
  5. 25 mm のカバースリップをイオン交換 (DI) 水で十分にすすぎ、ろ過したエアガンを使用して乾燥させます。
  6. プラズマは、高真空下でプラズマクリーナーを使用してカバースリップを1分間処理します(30Wの無線周波数電力)。カバースリップがチャンバー内で移動するのを防ぐために、処理後はゆっくりと真空を解放してください。
    注:ガラス表面のプラズマ処理は、2つの目的を果たす:それは汚染物質を除去するためにガラスの表面を洗浄し、それを疎水性にするためにガラスの表面に酸素ベースの極性基を生成する25。この疎水性により、ガラスの表面はタンパク質結合により適したものになります。
  7. 直射日光/頭上の照明のない部屋で、各カバースリップに少なくとも100μg/mLの濃度の蛍光標識タンパク質溶液100μLをコーティングし、光からの保護を強化するために覆い、20分間放置します。
    注:ここでは、ヒト血漿から単離し、AlexaFluor 488で染色したフィブロネクチンが使用される。
    1. フィブロネクチンを色素化するには、既知の濃度および体積の非標識フィブロネクチンを1.5mLチューブ内の適量の蛍光色素と組み合わせる。チューブをアルミホイルで覆い、染料を光から保護し、室温で1時間インキュベートし、チューブを5〜10回逆さまにして10分ごとに穏やかに混合する。
      注:必要な色素の量は、使用される色素および使用されているタンパク質の質量によって異なります。Alexa 488で標識されたフィブロネクチンの色素の適切な量を決定するために使用される計算機については、 補足ファイル1 を参照してください。製造業者の指示に従って、脱塩カラムを使用して過剰な染料を濾過することができる( 材料表を参照)。
  8. 各カバースリップをDI水で十分にすすぎ、各カバースリップの側面をペーパータオルまたは同様の吸収材に軽く叩いて、余分な水分を表面から取り除きます。カバースリップを少なくとも30分間暗闇の中で覆い隠したままにして、完全に乾燥させます。
  9. タンパク質でコーティングされたカバースリップが乾いたら、メスやその他の鋭利な刃で切断して、マスターからPDMSスタンプを取り外します。
    注:最初の試行でPDMSを切断しようとしないことをお勧めします。これだけの圧力をかけるとシリコンウェーハに亀裂が入り、マスターが損傷するためです。
  10. プラズマは、PDMSスタンプを高真空下で2分間処理します(30Wの無線周波数電力)。
  11. ヒュームフード内で、スタンプを蓋付きの容器に入れ、各スタンプを100%エタノールで希釈した10%(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン(3-APTMS)の非常に薄い層(<100μL)でコーティングする。
    注意: 3-APTMS は可燃性の皮膚および眼の刺激性物質です。炎や火花から遠ざけ、取り扱い時には保護手袋と眼鏡を使用し、ヒュームフードの下で作業してください。3-APTMS溶液の過剰なコーティングは、このプロセスの後半でオレンジ色の膜を形成する原因となる。この3-APTMS表面処理は、アミン官能基をPDMSスタンプの表面に組み込んでおり、26の後半でスタンプの表面をさらに誘導体化することができます。
  12. 容器をスタンプで覆い、室温で5分間座らせます。
  13. DI水を使用して、両面の各スタンプを十分にすすいでください。
  14. スタンプを清潔な容器に入れ、DI水中の2.5%グルタルアルデヒドで自由にコーティングします。
    注意: グルタルアルデヒドは有毒です;取り扱い時には保護手袋と眼鏡を使用し、ヒュームフードの下で作業してください)。このグルタルアルデヒド処理は、以前の3−APTMS処理と並んで、PDMSスタンプの表面にアルデヒド官能基を提供し、これはタンパク質中のアミン基と反応して二次アミン結合を作り出すことができ、これはタンパク質除去プロセス27にとって重要である。
  15. スタンプを覆い、室温で30分間放置してから、再びDI水で十分にすすいでください。カバースリップと同じ方法でスタンプの表面から余分な水分を取り除き、スタンプを約30分間乾燥させます。
  16. 30分後、タンパク質コーティングされたカバースリップとスタンプの両方が乾燥しているかどうかを確認します。どちらかが完全に乾燥していない場合は、フィルターをかけたエアガンを使用して完全に乾燥させ、カバースリップが長時間光にさらされないようにします。
  17. カバースリップとスタンプの両方が乾いたら、スタンプがカバースリップの表面に完全に接触するように、スタンプパターンをカバースリップに横向きに押し込みます。スタンプをカバースリップに接触させて15分間放置します。
    注:グルタルアルデヒドスタンプとガラスカバースリップ上のタンパク質層との間の共有結合アミド結合は、タンパク質層とガラスカバースリップとの間の弱い疎水性相互作用よりもはるかに強いため、タンパク質は、PDMSスタンプ上のパターンに従ってガラスを剥離する必要があります一度除去する必要があります。
  18. 15分後、PDMSスタンプをカバースリップから慎重に剥がします。
    メモ:取り外しプロセスが正しく機能した場合、スタンプは抵抗なくカバースリップから外れるべきではありませんが、過度の力なしでは取り外せないほどカバースリップにしっかりとくっついていてはなりません。
  19. 蛍光顕微鏡の適切なフィルターを使用して、パターン化されたカバースリップの忠実度を確認します(タンパク質にマークされている蛍光色素によって異なります)。
  20. パターン化されたカバースリップをすぐに使用するか、直接光から離して保存して保管してください。

3. アクティブカバースリップ

注:PAAゲルの実験チャンバーで使用するためのボトムカバースリップは、このステップで作られる。このボトムカバースリップは、パターニングプロセス中にトップパターン付きカバースリップが除去される際にPAAゲルがしっかりと接着したままになるように特別に処理されています。同様の技術は、他の場所10、12、15、28にも記載されている。

  1. 超音波処理30 mmカバースリップを100%エタノールで10分間、DI水ですすぎ、ろ過したエアガンで十分に乾燥させます。6ウェルプレートにバッチあたり一度に最大6つのカバースリップを準備します。
  2. プラズマは、カバースリップを高(30Wの無線周波数電力)で1分間処理し、次に各カバースリップを6ウェルプレートのウェルに置きます。
  3. 各カバースリップをヒュームフード内のエタノール中の5%APTMSの非常に薄い層でコーティングする。
    注:このプロセスで過度のコーティングを行うと、オレンジ色の残留物が形成されます。
  4. 6ウェルプレートを覆い、カバースリップを5分間放置します。
  5. カバースリップ(両面)と各井戸の内部をDI水で十分にすすぎ、井戸内の余分な水分を取り除きます。
  6. カバースリップを6ウェルプレートに戻し、DI水に約2mLの0.5%グルタルアルデヒドを加えます。
  7. 6ウェルプレートを覆い、カバースリップをグルタルアルデヒド溶液に30分間座らせます。次に、各プレートのカバースリップとウェルの両方をDI水で十分にすすいでください。
  8. 処理したカバースリップを6ウェルプレート内のDI水に最大2週間保管するか、すぐに使用してください。使用前にカバースリップが完全に乾いていることを確認してください。

4. PAAゲル作製とパターン転写

注:パターン化されたカバースリップが作成されたら、すぐに(<24時間)1、29、30でそれらのタンパク質パターンをPAAヒドロゲルに転写するためにそれらを使用しなければなりません。次のレシピは、ヤング率が3.6kPaのPAAゲル用です。ビスアクリルアミド、アクリルアミド、およびDI水の量は、PAAゲル12の剛性を調整するために変化させることができる。

  1. PAAヒドロゲル前駆体の製造を開始する直前に、アクリル酸 N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)-エステルを冷蔵庫から取り出して、開封前に室温に達することができるようにする。交換可能なカバースリップ皿セットを用意するには、70%エタノールで滅菌し、使用前にバイオセーフティキャビネット内のUV光の下に少なくとも30分間放置します。
    注意:NHSは有毒な皮膚および眼の刺激剤です。取り扱い時には保護手袋と眼鏡を使用し、ヒュームフードの下で作業してください。
    1. DI水中の40%アクリルアミド1.25 mLを15 mL円錐管に加える。
      注意: アクリルアミドは有毒な皮膚および眼の刺激性物質です;取り扱い時には保護手袋と眼鏡を使用し、ヒュームフードの下で作業してください。
    2. DI水中のビスアクリルアミド溶液175 μLを同じチューブに加える(ステップ4.1.1)。
      注意: ビスアクリルアミドは有毒な皮膚および眼の刺激物です。取り扱い時には保護手袋と眼鏡を使用し、ヒュームフードの下で作業してください。
    3. 500 μL の 10x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を追加します。
      注意: PBS は目の刺激物です。取り扱い時には保護手袋と眼鏡を使用してください。
    4. 2.915 mL の DI 水を加えます。
  2. この前駆体のピペット969 μLを1.5 mL微量遠心チューブに入れ、残りを4°Cで最大2週間保存した。
  3. 別の微量遠心管で過硫酸アンモニウム(APS)〜50〜100mgを測定し、DI水で100mg / mLまで希釈する。後で使用するために取っておきます。フード内のNHSエステル(現在は室温)を開き、微量遠心チューブで最大3mgのNHSを慎重に測定します。NHSエステルを1x PBS中で1mg/mLに希釈する。
    注意: APS は皮膚および眼の刺激物です。取り扱い時には保護手袋と眼鏡を使用し、ヒュームフードの下で作業してください。APSとNHSエステルの両方が時間の経過とともに加水分解し、原液中の化学物質の活性が変化します。したがって、これらの溶液は両方とも、毎回新鮮に調製されなければならない(残りの前駆体とは異なり)。
  4. ヒュームフードで次の3つのステップを実行します。
    1. 2 μL のテトラメチルエチレンジアミン (TEMED) を、PAA 前駆体の 969 μL アリコートを含む微量遠心管に加えます。
      警告: TEMED は可燃性の皮膚および眼の刺激剤です。熱/炎/火花から遠ざけ、取り扱い時には保護手袋と眼鏡を使用し、ヒュームフードの下で作業してください。TEMEDは、PAAヒドロゲルの重合に重要な2つの架橋剤のうちの1つであり、もう1つはAPSである。
    2. 15μLの1M塩酸を加えて、ヒドロゲル溶液のpHを低下させ、NHSエステルの加水分解を避ける。
      警告: 塩酸は腐食性の皮膚および眼の刺激性物質です。取り扱い時には保護手袋と眼鏡を使用し、ヒュームフードの下で作業してください。
    3. NHSエステル溶液10 μLをチューブに加える。
      メモ: NHS はパターニングプロセスにとって重要です。パターン化されたカバースリップ上のタンパク質中のアミン基と反応して安定したアミド結合を形成し、パターンが重合するにつれてパターンをガラスカバースリップからPAAゲルの表面に転写することを可能にする31。
  5. バイオセーフティキャビネットでこれらの最終ステップを実行します。
    1. 30 mm のカバースリップをカバースリップ セットの金属部分 (3-APTMS およびグルタルアルデヒド処理された側面を上にして) に慎重に置き、プラスチック リングを上にねじ込みます。パターン化されたカバースリップは、次のステップで簡単に手が届くようにセットアップし、可能な限り光から保護します。
    2. 5 μLのAPS溶液を微量遠心管内の残りのPAA前駆体にピペットし、それを反転させて混合し、次いで直ちにその溶液の35 μLを30 mmカバースリップ上にピペットする。
    3. パターン化されたカバースリップタンパク質の側面を溶液の上に落とし、ヒドロゲル中に気泡を生じさせないように注意してください。ヒドロゲルを光から保護し、90分間重合させる。
    4. ヒドロゲルが重合したら、カミソリの刃またはメスを使用して上部カバースリップを取り外し、カバースリップがゲルから滑り落ちたり、ゲルが取り除かれた後にゲルの上に落ちたりしないようにします。
      メモ:空気の流れが著しい場所(バイオセーフティキャビネットなど)にゲルを露出させたままにしないでください。
    5. ヒドロゲル中に残存するNHSエステルを不動態化するために、2mLの滅菌PBSをゲルに加え、37°Cで45分間インキュベートする。直ちに実験用のゲルを調製するか、使用時まで4°Cの滅菌PBS中で一晩保存する。

5. イメージング

  1. 細胞を用いた実験の準備をするには、計画された実験の前の午後に顕微鏡内の熱(37°C)と湿度(70%)をオンにして、顕微鏡チャンバ内の機器をより高い温度に平衡化させます。
    メモ: この手順では、温度変動によって引き起こされる Z ドリフトが最小限に抑えられます。
  2. 実験開始の直前に、チャンバーのCO2 源をオンにします。
  3. 実験中の顕微鏡ステージの繰り返し移動によるx-yドリフトを防止するために、細胞播種ハイドロゲルを保持した交換可能なカバースリップ皿セットを両面テープでステージに固定する。
  4. ゲルを見渡して画像化する対象のフレームを見つけ、画像化するセクションの各ステージ位置を保存します。
  5. 標識タンパク質に対応する明視野図と蛍光図の両方で、顕微鏡ソフトウェアをセットして、各フレームを5分に1回、2時間画像化する。

6. 画像解析

注: 牽引点の位置を決定し、変形点の初期位置を補間し、各位置における細胞の牽引力を計算することによって、パターン化されたPAAゲルの変形を測定できるシステムが開発されました。画像処理および数値計算を行うことができる任意のソフトウェアシステムを使用することができる。このプログラムは、牽引力を迅速に決定し、ユーザー関連のエラーの原因となるユーザー入力と前処理手順を排除することを目的としています。ここで使用したコードは 、補足ファイル 2 ~ 10 としてここで入手でき、これらのファイルは、練習画像のペアと共に、www.bu.edu/mml/downloads でアクセスできます。

  1. 画像処理ソフトウェアでは、タイムラプス実験中に撮影されたすべての画像を、最初にキャプチャされた画像から最後にキャプチャされた各顕微鏡ビューから順番に開き、それらを単一の画像スタックに変換します( 画像|スタック|画像を積み重ねる)。2つの別々の画像スタックがあることを確認します:1つは細胞の明視野図、もう1つはそれらが付着しているパターンの蛍光図です。
    1. 蛍光画像にドリフトがある場合(つまり、目的の島が各フレーム間でx方向および/またはy方向に>1〜2μm移動する場合)、まずStackRegプラグイン(P. Thévenaz、スイス連邦工科大学ローザンヌ)を使用して画像スタックを処理し、最初の画像の位置に基づいてスタック内の各画像を再センタリングします( プラグインをクリック|スタックレッグ|翻訳|わかりました)。
      注: μm 未満のドリフトであっても、牽引力の最終計算、特にこの x-y ドリフトが予想されるノイズの範囲外にある硬いゲルでは、これが重要な意味を持ちます。このコードは、ドリフトが削除された後に画像を保存し、分析する新しい画像スタックにすることができます。
  2. 明視野と蛍光画像のスタックをCTFTimelapse.m(補足ファイル2)に入力します。
    1. イメージ・スタックが 7 行目にあるファイル・ディレクトリーを指定します。
    2. 8 行目と 9 行目で、蛍光画像スタックと対応する明視野蛍光スタックの名前をそれぞれ指定します。
    3. PAA ゲル剛性 (Pa) を指定します。
      1. 最も頻繁に使用されるPAAヒドロゲルのいくつかの異なる弾性率を含むライン11〜14では、分析中の画像中のゲルの弾性率を除くすべてをコメントアウト(ラインの開始時に%と入力 する)する。または、弾性率がまだ存在しない場合は弾性率を追加し、残りをコメントアウトします (テスト画像の場合は 3658.19 Pa)。
    4. 15 行目にドット半径 (m) を指定します (テスト画像の場合は 1 × 10 ~ 6 m)。
    5. ライン16に可能な最大ドット径(μm)を指定します(テスト画像の場合は2.5μm)。
    6. ピクセル比(μm/ピクセル)を指定します。
      1. 17 行目から 20 行目では、以前に使用したイメージング設定に基づいていくつかの異なる画像ピクセル比が含まれていますが、分析対象の画像のピクセル比を除くすべての画像をコメントアウトします (行の先頭に「% 」と入力します)。または、まだ存在しない場合に使用されるピクセル比を追加し、残りをコメントアウトします(テスト画像の場合は0.1613 μm/ピクセル)。
    7. 35 行目と 87 行目で、必要な画像処理ファイルが配置されているファイル・ディレクトリーを指定します。
      注:蛍光画像スタックから、コードは、各蛍光ドットの位置を決定し、スタック20内の各画像間の各ドットの動きを追跡する。マイクロコンタクト印刷点の初期位置は、ヒドロゲル32に適切に転写しても変形しないため既知である。
  3. プログラムがドットを見つけたら、2つの図と1つのダイアログボックスが表示されるのを待ちます。 図 1 を使用して、プログラムが正しいドットを見つけ、ドットがまったく見つからなかったことを確認します。 図 2 を使用して、プログラムがセルラーの牽引力を見つけて計算するのに役立つ長方形のグリッドを選択します。
    メモ: 図 1 は、プログラムによって検出されたドット (赤色になります) が重なったセルの明視野画像です ( 図 3A を参照)。図 2 は、 図1 に示すのと同じドットを表示する画像であるが、背景に明視野画像はない。
    1. ポイント の選択後に Enter キーを押すようにダイアログ ボックスが開くのを待ちます (各ポイントはプログラムによって見つかった赤い点の 1 つで、その中に Enter というラベルの付いた大きなボタンが 1 つあります)。
    2. 図 2 の 4 つの異なるドットを選択して、そのパターンのセル/クラスターを周囲に含めて、四角形のグリッドを作成します。マウスの左クリックで各ドットを1つずつ選択し、前述のダイアログボックスのボタンでEnterキーを押して確定します。4 つの角のドットがすべて選択されると、プログラムはこれらの値を要求するため、1 番目と 2 番目のドット、および 1 番目と 3 番目のドットの間にあるドットの数をカウントします。これらの値をコマンド・ウィンドウに入力します (ドット数を入力し、プロンプトが表示されたらキーボードの Enter ボタンをクリックします)。
  4. 長方形のグリッドを選択したら、スクリプトが蛍光ドットの位置に基づいてグリッド内で検出した牽引力を計算するのを待ちます。スクリプトは、最初に各ドットの幾何学的中心の変位ベクトル(u)を見つけ、次にEq(1)を使用して対応する牽引力ベクトル(F)を計算することに注意してください。
    figure-protocol-13614(1)
    ここで、EはPAA基板のヤング率、aは蛍光ドットマーカーの半径、νはPAA基板32のポアソン比である。Eq(1)は、基板が無限の弾性半空間であり、各円形ドットマーカーの中心に牽引力が加えられ、ドットマーカー間の間隔が十分に大きいと仮定して、それらのそれぞれの変位が互いに相互作用しないようにする23。
    注:ここで説明する実験では、半径a=1μmおよび6μmの中心間間隔のドットマーカーが使用されている。セル/クラスターの内側を向いた牽引力矢印はセルの中心に向かって配置する必要がありますが、セル/クラスターの外側の領域には牽引矢印が存在してはなりません (図 3C-E を参照)。セル/クラスターの内側から外側を指す牽引矢印、またはセルの外側に存在する多くの大きな牽引矢印は、選択が不十分な長方形のグリッドを示しています。
  5. 正しい牽引フィールドが見つかったら、セル/クラスターを囲む適切な関心領域 (ROI) を選択します。この領域には、カーソルを使用してセル内のすべての牽引矢印が含まれます。
    1. ROIを描画するには、必要な回数 だけ 左クリックして、必要な数の辺を持つポリゴン形状を描画し、形状を調整するか、または描画後にROIを移動させて、それぞれ角または辺を 左クリック する。ROIが描画されたら、左クリックを 2回クリック してスタック内の次の画像に進みます。明視野スタック内のすべての画像について、これを繰り返します。
      注: このコードでは、各タイム ポイントの牽引力と変位のデータが元の画像スタックと同じフォルダに保存され、さらに解析できます。

結果

ヤング率がE=3.6kPaでポアソン比がν=0.445のPAAヒドロゲルが、この減法マイクロパターニング法によって使用されるように作製された。ヒドロゲルの厚さは約100μmに作られており、ここで使用したイメージング設定で画像化できると同時に、細胞がゲルの下の硬いカバースリップを感知するのを防ぎ、細胞の剛性感知に焦点を当てた研究で問題を引き起こす23,33

ディスカッション

PAAヒドロゲルを間接的にパターニングする改良された方法が、この論文に記載されている。このアプローチは、以前に20,35,36,37,38,39,40,41,42で使用されていた方法に基づいています。

開示事項

著者らは、開示する利益相反はありません。

謝辞

著者らは、ボストン大学機械工学科のPaul Barbone博士に、データ分析に関する有益な議論と支援に感謝したい。この研究は、NSF助成金CMMI-1910401によって支援された。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-aminopropyl)trimethoxysilaneSigma Aldrich#281778
1.5 mL Microcentrifuge tubeFisher Scientific#05-408-129
15 mL conical tubeFisher Scientific#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome PhotomaskAdvance Reproductions CorporationN/ACustom-designed mask
6 Well PlatesFisher Scientific#07-200-83
AcetoneFisher Scientific#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%Sigma Aldrich#A4058
AlexaFluor 488Thermo Fisher#A20000
Aminonium PersulfateFisher Scientific#BP179-25
BisacrylamideFisher Scientific#PR-V3141
EthanolGreenfield Global#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm roundFisher Scientifc#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm roundWarner#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 CameraHamamatsu#C10600-10B
Human PlasmaValley Biomedical#HP1051PUsed to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 NMillipore Sigma#1.09057
ImageJWayne Rasband#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish SetBioptechs#190310-35
Kim WipesFisher Scientific#06-666-11C
Mask AlingerKarl Suss#MA6
Matlab 2021Mathworks#R2021a
MetaMorph BasicMolecular Devices#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide esterSigma Aldrich#130672-5G
NucBlue Live Cell StainThermo Fisher#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted MicroscopeOlympus#IX81
PD-10 Desalting ColumnsGE Healthcare#52-1308-00
Photoresist Spinner HoodHeadway Research#PWM32
Plasma CleanerHarrick#PDC-001
Plasma EtcherTePla#M4L
Prior Lumen 200Pro Light SourcePrior Scientific#L200
Silicon Wafers, 100 mmUniversity Wafer#809
SU-8 2005Kayaku Advanced Materials Inc.#NC9463827
SU-8 DeveloperKayaku Advanced Materials Inc.#NC9901158
Sylgard 184 Silicone ElastomerEssex Brownell#DC-184-1.1
TetramethylethylenediamineFisher Scientific#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaneSigma Aldrich#448931
UAPON-40XW340 ObjectiveOlympus#N2709300
UV Flood ExposureNewport#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mmTed Pella, Inc.#19395-40

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