Génération de motifs pour la microscopie de traction à micromotifs

Résumé

Nous décrivons les améliorations apportées à une méthode standard de mesure des forces de traction cellulaire, basée sur l’impression par microcontact avec une seule étape de motif soustractif de réseaux de points de protéines de matrice extracellulaire sur des hydrogels mous. Cette méthode permet une fabrication plus simple et plus cohérente de motifs d’îlots, essentiels pour contrôler la forme des amas de cellules.

Résumé

La microscopie de traction à micromotifs permet de contrôler la forme des cellules individuelles et des amas de cellules. En outre, la capacité de modeler à l’échelle de longueur micrométrique permet l’utilisation de ces zones de contact à motifs pour la mesure des forces de traction, car chaque point micromotif permet la formation d’une seule adhérence focale qui déforme ensuite l’hydrogel sous-jacent mou. Cette approche a été utilisée pour un large éventail de types de cellules, y compris les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, les fibroblastes, les plaquettes et les cellules épithéliales.

Cette revue décrit l’évolution des techniques qui permettent l’impression de protéines de matrice extracellulaire sur des hydrogels de polyacrylamide dans un tableau régulier de points de taille et d’espacement prédéfinis. Comme les motifs à l’échelle micrométrique sont difficiles à imprimer directement sur des substrats souples, les motifs sont d’abord générés sur des couvercles en verre rigide qui sont ensuite utilisés pour transférer le motif à l’hydrogel pendant la gélification. Tout d’abord, l’approche originale d’impression par microcontact pour générer des tableaux de petits points sur le couvercle est décrite. Une deuxième étape qui supprime la majeure partie du motif pour laisser des îlots de petits points est nécessaire pour contrôler les formes des cellules et des amas de cellules sur de tels tableaux de points à motifs.

Ensuite, une évolution de cette approche qui permet la génération d’îlots de points à l’aide d’une seule étape de motif soustractif est décrite. Cette approche est grandement simplifiée pour l’utilisateur mais présente l’inconvénient d’une durée de vie réduite pour le moule maître nécessaire à la fabrication des motifs. Enfin, les approches informatiques qui ont été développées pour l’analyse des images de points déplacés et des champs de traction générés par des cellules ultérieures sont décrites, et des versions mises à jour de ces packages d’analyse sont fournies.

Introduction

La plupart des phénotypes cellulaires exercent des forces de traction sur leur environnement. Ces forces de traction sont générées par le cytosquelette contractile d’une cellule, qui est un réseau d’actine et de myosine, et d’autres biopolymères filamenteux et protéines de réticulation 1,2,3,4. Les forces générées à l’intérieur de la cellule peuvent être transmises à l’environnement extracellulaire ou aux cellules adjacentes, principalement via des protéines transmembranaires telles que les intégrines et les cadhérines, respectivement ^5,6. La façon dont une cellule se propage ou se contracte - et l’ampleur des forces de traction associées à ces mouvements - est le résultat d’une conversation intime avec son environnement, qui dépend en grande partie du type et de la quantité de protéines présentes dans la matrice extracellulaire (ECM)^7,8 et de la rigidité de l’ECM. En effet, la microscopie à force de traction est devenue un outil inestimable pour comprendre la réactivité cellulaire aux stimuli locaux tels que la rigidité du substrat, les contraintes et déformations mécaniques imposées, ou le contact avec d’autres cellules. Cette information est directement pertinente pour la compréhension de maladies telles que le cancer et l’asthme 9,10,11,12.

Un système pouvant être utilisé pour mesurer la déformation induite par la force d’un substrat aux propriétés connues d’un matériau est nécessaire pour calculer les forces de traction. Ces changements doivent être suivis au fil du temps, ce qui nécessite à la fois des techniques d’imagerie et de traitement d’image. L’une des premières méthodes utilisées pour déterminer les forces de traction cellulaire a été l’observation et l’analyse de la contraction des hydrogels de collagène ensemencés avec des cellules, bien que cette méthode n’ait été que semi-quantitative¹³. Une autre méthode, plus raffinée, consistait à mesurer les forces de traction exercées par des cellules individuelles en déterminant les forces résultant de la déformation d’une fine feuille de silicone¹⁴. Plus tard, des techniques de mesure plus quantitatives ont été développées, et ces méthodes ont également permis l’utilisation d’hydrogels mous tels que le polyacrylamide (PAA)12,15,16. Lors de l’utilisation de ces matériaux mous, les forces de traction ont pu être déterminées à partir du déplacement induit par la force des billes déplacées aléatoirement incorporées dans l’hydrogel et des propriétés mécaniques du gel^16,17. Une autre avancée est venue avec le développement de réseaux de micropostes en polydiméthylsiloxane mou (PDMS) afin que leur déviation puisse être mesurée et convertie en force en utilisant la théorie du faisceau¹⁸.

Enfin, des méthodes de micromotifs d’hydrogels mous ont été développées car ces approches permettent de contrôler les zones de contact pour l’adhésion cellulaire. En mesurant la déformation du micromotif dans la zone de contact d’une cellule, les forces de traction pourraient facilement être calculées car une image de référence sans force n’est pas nécessaire¹⁹. Cette méthode a été largement adoptée car elle permet la modélisation indirecte d’un réseau régulier de points d’adhésion de protéines fluorescentes discrètes de la taille d’un micron sur des gels PAA pour la mesure des forces de traction cellulaire²⁰. Pour calculer ces forces, un algorithme de traitement d’image, qui permet de suivre les mouvements de chaque point micromotif sans nécessiter l’intervention de l’utilisateur, a été développé²¹.

Bien que cette méthode soit simple pour créer des grilles entières de motifs de points, elle est plus compliquée lorsque des motifs de taches isolées (ou d’îlots) de points sont souhaités. Les îlots à micromotifs sont utiles lorsque le contrôle de la forme et, dans une certaine mesure, de la taille des amas de cellules est nécessaire. Pour créer ces îlots, la méthode d’impression par microcontact susmentionnée nécessite deux étapes distinctes : i) l’utilisation d’un tampon PDMS pour créer un motif haute fidélité de points sur un couvercle, puis ii) l’utilisation d’un deuxième tampon PDMS différent pour enlever la plupart de ces points, laissant derrière eux des îlots isolés de points²¹. La difficulté de créer des îlots avec cette méthode originale est aggravée par le fait que la création de modèles de grille cohérents dans la première étape du processus est difficile en soi. Les timbres de micro-impression sont composés d’un ensemble de micro-poteaux circulaires, dont le diamètre correspond à la taille de point souhaitée. Ces tampons sont ensuite recouverts d’une couche uniforme de protéines, puis estampés avec une pression précise sur les couvercles traités pour créer le motif souhaité. D’une part, l’application d’une pression excessive sur le tampon peut entraîner un transfert de protéines inégal et une mauvaise fidélité du motif en raison du flambement des piliers ou de l’affaissement entre les piliers, entraînant un contact avec le verre. D’autre part, l’application de trop peu de pression entraîne peu ou pas de transfert de protéines et une mauvaise fidélité du modèle. Pour ces raisons, un processus de transfert pouvant être utilisé pour créer de manière cohérente des micromotifs de haute qualité d’îlots de points isolés en une seule étape est souhaité.

Ici, une méthode est décrite pour le micromotif indirect d’îlots de points d’adhésion de protéines fluorescentes de taille micronique sur un gel PAA qui est plus cohérent et polyvalent que les méthodes précédemment développées. Alors que les anciennes méthodes de micromodélisme indirect reposent sur le transfert de motifs protéiques d’un tampon PDMS à un substrat intermédiaire, la méthode présentée ici utilise plutôt des tampons PDMS comme récipient pour l’élimination des protéines, et non pour l’addition. Cela se fait d’abord en changeant fondamentalement la structure des timbres PDMS utilisés. Plutôt que de fabriquer des timbres composés d’un motif de piliers circulaires uniformément espacés, les timbres sont constitués d’un motif de trous circulaires uniformément espacés dans cette méthode.

Avec cette nouvelle structure, la surface de ces tampons PDMS peut ensuite être traitée avec du glutaraldéhyde comme décrit précédemment 20,29,30, ce qui rend le tampon capable de se lier de manière covalente avec la protéine. Lorsqu’ils sont utilisés sur un couvercle en verre recouvert uniformément de protéines fluorescentes, ces tampons PDMS traités au glutaraldéhyde sont utilisés pour éliminer la majeure partie de la protéine à la surface du couvercle, ne laissant derrière eux que le motif souhaité de points prédéterminé par l’emplacement des trous de la taille d’un micron sur le tampon. Ce changement augmente le taux de réussite pour générer des modèles constitués d’une grille de points presque continue et pour créer des îlots isolés de points en une seule étape.

Protocole

1. Création de masters en silicone

REMARQUE: La majeure partie du processus de conception, de création et de dépannage des maîtres de silicium pour le moulage répété des tampons PDMS a été couverte précédemment²¹, de sorte que seules les principales différences de cette nouvelle approche seront décrites ici.

1. Créez la conception du photomasque à l’aide d’AutoCAD ou d’un logiciel de conception similaire. Enduisez un côté du photomasque, un mince morceau de verre, d’une fine couche de chrome pour contrôler la diffusion de la lumière UV. Concevez le photomasque de manière à ce que la lumière UV brillante à travers lui sur la résine photosensible choisie crée un maître en silicone avec l’inverse des caractéristiques souhaitées sur les timbres PDMS finaux. Reportez-vous à la figure 1 pour la conception de ce masque.
   REMARQUE: La question de savoir si les caractéristiques souhaitées ou la zone à l’extérieur doivent être rendues transparentes sur le photomasque dépend de la résine photosensible choisie. La résine photosensible utilisée ici est SU-8 2005 (ATTENTION: inflammable, irritant pour la peau et les yeux; tenir à l’écart de la chaleur / flammes / étincelles et utiliser des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation), une résine photosensible négative capable de fabriquer des caractéristiques de 5 μm de haut avec des parois latérales presque verticales.
   1. Durcissez la résine photosensible négative en l’exposant à la lumière UV et en éliminant le SU-8 non durci avec un solvant chimique. Par conséquent, concevez les principales caractéristiques du masque pour qu’elles soient transparentes alors que la zone environnante du masque est opaque.
   2. Pour cette nouvelle méthode d’enlèvement, concevez le photomasque de manière à ce qu’il soit composé de deux carrés de 1,5 x 1,5 cm (Figure 1A), l’un plein d’une grille uniforme de 2 cercles μm espacés de 6 μm du centre au centre, et l’autre composé de nombreuses îles carrées qui sont des versions plus petites et isolées de ce même motif de grille (Figure 1B). Créez des îlots des tailles suivantes : 6 x 6 points, 12 x 12 points, 25 x 25 points et 42 x 42 points.
      NOTE: Le diamètre des points d’adhérence (2 μm) a été choisi sur la base d’études antérieures qui ont mesuré les forces de traction cellulaire^22,23. Le masque utilisé ici mesure 101,6 x 101,6 mm et est recouvert d’un côté d’une couche de chrome de 0,06 μm d’épaisseur, ce qui est recommandé en raison des petites caractéristiques du maître. Le photomasque utilisé ici a été commandé à une société d’impression de photomasque externe.
2. Dans une salle blanche, recouvrez uniformément la plaquette de silicium choisie de résine photosensible. En option, traiter la plaquette en surface dans un asher plasma avant de la recouvrir de résistance.
   REMARQUE: Ici, des plaquettes de 100 mm de diamètre sont utilisées. Le traitement dans un asher plasma rend la plaquette plus apte à se lier au SU-8 et aide à prévenir le délaminage du SU-8 de la plaquette.
3. Effectuez les étapes suivantes conformément aux instructions du fabricant de la résine photosensible :
   1. Faites tourner la plaquette revêtue pour créer l’épaisseur de caractéristique souhaitée, en faisant varier le temps de rotation en fonction de l’épaisseur souhaitée et du type de résistance. Pour un SU-8 2005 de 5 μm d’épaisseur, divisez le programme de spin recommandé en trois étapes :
      1. Enduire la plaquette de résine photosensible en tournant à 500 tr/min pendant 10 s avec une rampe de 100 TR/min.
      2. Réduisez l’épaisseur de la résine à environ 5 μm en faisant tourner la plaquette à 3 000 tr/min avec une rampe de 300 tr/min/s pendant 30 s.
      3. Décélérez lentement la plaquette après la rotation en réduisant la vitesse à 0 RMP avec une rampe de 500 RPM/s pendant 1 s.
   2. Préparez la résine pour l’exposition aux UV en la cuisant brièvement sur une plaque chauffante à 95 °C. Modifier le temps passé sur la plaque chauffante en fonction de l’épaisseur souhaitée de la résine; le temps de cuisson est de 2 min pour un SU-8 2005 de 5 μm d’épaisseur.
   3. Exposez la résistance à la lumière UV pour durcir complètement les caractéristiques souhaitées. Méfiez-vous de la surexposition, car cela peut rendre le SU-8 fragile et affecter la qualité globale du maître résultant.
      1. Utiliser une énergie d’exposition de 105 mJ/^cm2 pour un SU-8 2005 de 5 μm d’épaisseur. En fonction de la puissance de la lampe UV disponible, calculez le temps d’exposition en divisant l’énergie d’exposition par la puissance de la lampe en mW.
         REMARQUE: Comme la lampe utilisée ici a une puissance de 8 mW, le temps d’exposition doit être de 13,1 s.
   4. Pour régler les caractéristiques du SU-8 après le développement, cuire à nouveau sur une plaque chauffante à 95 °C, cette fois pendant 3 min. Attendez que les caractéristiques souhaitées du maître apparaissent dans les 1 minute au cours de cette étape de cuisson si la résistance a été exposée correctement.
   5. Retirez le SU-8 non durci de la plaquette de silicium à l’aide du révélateur SU-8. Soyez minutieux lorsque vous retirez le SU-8 non durci, car il peut rester coincé entre les caractéristiques de taille micronique et espacées sur la plaquette.
      ATTENTION: Le révélateur SU-8 est un irritant inflammable pour la peau et les yeux; gardez-le à l’abri de la chaleur, des flammes ou des étincelles et utilisez des gants et des lunettes de protection lorsque vous le manipulez.
   6. Après le développement, rincez avec de l’acétone pour éliminer l’excès de révélateur sur la plaquette et séchez-la complètement avec un pistolet de pulvérisation d’azote.
      ATTENTION : L’acétone est un irritant inflammable pour la peau et les yeux; gardez-le à l’abri des flammes ou des étincelles et utilisez des gants de protection et des lunettes lorsque vous le manipulez.
   7. En option, pour le SU-8 2005, cuire sur une plaque chauffante à 200 °C pendant 10 min.
      REMARQUE: Cette cuisson dure ajoute une résistance mécanique à la résine photosensible.
4. Après avoir été laissé refroidir, mettez la plaquette dans un plateau de support de plaquette, puis coulez-la dans PDMS. Tout d’abord, effectuez un traitement de silanisation sur la plaquette pour rendre les caractéristiques SU-8 du maître de silicium moins susceptibles de se lier au PDMS et donc moins susceptibles d’être retirées de la surface de la plaquette.
   1. Pour compléter le traitement de surface de silanisation, placez le maître et un petit couvercle en verre à l’intérieur d’un dessiccateur destiné à être utilisé uniquement avec des silanes. Placer 1-2 petites gouttes de Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane sur le couvercle, fermer le dessiccateur et le faire passer sous vide pendant 30 min à une pression de 4 500 Pa²⁴.
      ATTENTION : Le trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane est un irritant inflammable pour la peau et les yeux; gardez-le à l’abri de la chaleur, des flammes ou des étincelles, utilisez des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation et travaillez sous une hotte aspirante.
   2. Éteignez l’aspirateur et laissez le maître et le couvercle dans le dessiccateur pendant encore 30 minutes.
      REMARQUE : Le maître est maintenant prêt pour la coulée dans PDMS.

2. Impression soustractive par microcontact

1. Mélangez le PDMS dans le bon rapport entre l’agent de durcissement et la base en fonction des instructions du fabricant. Laissez-le reposer à température et pression ambiantes pendant 15 min; puis, dégazez sous vide pendant 15 min.
2. Versez le PDMS dans le maître et mettez-le dans un incubateur réglé à 37 ° C pendant la nuit pour durcir.
3. Retirez le maître de l’incubateur et laissez-le refroidir à la température ambiante.
4. Pendant que le maître refroidit, sonicate 25 mm recouvre l’éthanol pendant 10 min. Utilisez autant de couvertures que le nombre de timbres en cours de préparation.
5. Rincer soigneusement les couvercles de 25 mm à l’eau désionisée (DI) et sécher à l’aide d’un pistolet à air filtré.
6. Plasma traiter les couvercles pendant 1 min à l’aide d’un nettoyeur plasma sous vide à haute fréquence (puissance radiofréquence de 30 W). Assurez-vous de libérer l’aspirateur lentement après le traitement pour empêcher les couvercles de se déplacer à l’intérieur de la chambre.
   REMARQUE: Le traitement au plasma de la surface du verre sert à deux fins: il nettoie la surface du verre pour éliminer les contaminants et génère des groupes polaires à base d’oxygène à la surface du verre pour le rendre hydrophobe²⁵. Cette hydrophobicité rend la surface du verre plus propice à la liaison aux protéines.
7. Dans une pièce dépourvue de lumière directe du soleil et d’éclairage aérien, recouvrir chaque couvercle de 100 μL de solution protéique marquée par fluorescence à une concentration d’au moins 100 μg/mL, couvrir pour une protection supplémentaire contre la lumière et laisser reposer pendant 20 min.
   REMARQUE: Ici, la fibronectine isolée du plasma humain et teinte avec AlexaFluor 488 est utilisée.
   1. Pour teindre la fibronectine, combiner la fibronectine non marquée de concentration et de volume connus avec la quantité appropriée de colorant fluorescent dans un tube de 1,5 mL. Couvrez le tube avec du papier d’aluminium pour protéger le colorant de la lumière et incubez-le à température ambiante pendant 1 h, en mélangeant doucement toutes les 10 minutes en retournant le tube à l’envers 5 à 10 fois.
      REMARQUE: La quantité de colorant requise varie en fonction du colorant utilisé et de la masse de protéines utilisées. Voir le fichier supplémentaire 1 pour la calculatrice utilisée pour déterminer la quantité appropriée de colorant pour la fibronectine étiquetée avec Alexa 488. Selon les instructions du fabricant, l’excès de colorant peut être filtré à l’aide de colonnes de dessalement (voir le tableau des matériaux).
8. Rincez soigneusement chaque couvercle avec de l’eau DI et retirez l’excès d’eau de la surface en tapotant doucement les côtés de chaque couvercle sur une serviette en papier ou un matériau absorbant similaire. Laissez les couvercles découverts dans l’obscurité pendant au moins 30 minutes pour leur permettre de sécher complètement.
9. Pendant que les couvercles recouverts de protéines sèchent, retirez le tampon PDMS du maître en le coupant avec un scalpel ou une autre lame tranchante.
   REMARQUE: Il est préférable de ne pas essayer de couper à travers le PDMS à la première tentative, car appliquer autant de pression fissurera la plaquette de silicium et endommagera le maître.
10. Traitement plasma des tampons PDMS pendant 2 min sous vide à haute fréquence (puissance radiofréquence de 30 W).
11. Dans une hotte, placez les tampons dans un récipient avec un couvercle et enduisez chaque tampon d’une très fine couche (<100 μL) de 10% (3-aminopropyl)triméthoxysilane (3-APTMS) diluée dans de l’éthanol à 100%.
    ATTENTION: 3-APTMS est un irritant inflammable pour la peau et les yeux; gardez-le à l’abri des flammes ou des étincelles, utilisez des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation et travaillez sous une hotte aspirante. Un revêtement excessif de la solution de 3-APTMS provoquera la formation d’un film orange plus tard dans ce processus. Ce traitement de surface 3-APTMS intègre la fonctionnalité amine dans la surface du tampon PDMS, ce qui permettra une dérivatisation supplémentaire de la surface du timbre plus tard le²⁶.
12. Couvrez le récipient avec les tampons et laissez-les reposer à température ambiante pendant 5 min.
13. À l’aide d’eau DI, rincez soigneusement chaque tampon des deux côtés.
14. Placez les timbres dans un récipient propre et enduisez-les généreusement de 2,5% de glutaraldéhyde dans de l’eau DI.
    ATTENTION : Le glutaraldéhyde est toxique; utiliser des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation et travailler sous une hotte). Ce traitement au glutaraldéhyde, parallèlement au traitement 3-APTMS précédent, fournit des fonctionnalités aldéhydes à la surface des tampons PDMS, qui peuvent réagir avec les groupes amines dans les protéines pour créer une liaison amine secondaire, ce qui est essentiel au processus d’élimination des protéines²⁷.
15. Couvrez les tampons, laissez-les reposer à température ambiante pendant 30 minutes, puis rincez à nouveau abondamment à l’eau DI. Retirez l’excès d’eau de la surface des timbres de la même manière que les couvercles et laissez les timbres sécher à découvert pendant environ 30 min.
16. Après 30 min, vérifiez si les couvercles recouverts de protéines et les tampons sont secs. Si l’un ou l’autre n’est pas complètement sec, utilisez un pistolet à air filtré pour les sécher complètement, en veillant à ce que les couvercles ne soient pas exposés à la lumière pendant une période prolongée.
17. Une fois que les bordereaux de couverture et les tampons sont secs, poussez le motif de tampons vers le bas sur les couvercles avec une pression suffisante pour que les tampons entrent en plein contact avec la surface du couvercle. Laissez les tampons en contact avec les couvercles pendant 15 min.
    REMARQUE: En raison de la liaison amide covalente entre le tampon de glutaraldéhyde et la couche de protéines sur le couvercle en verre - qui est beaucoup plus forte que les faibles interactions hydrophobes entre la couche de protéines et le couvercle en verre - les protéines doivent se décoller du verre selon le motif sur le tampon PDMS une fois qu’il est retiré.
18. Après 15 minutes, pelez soigneusement les tampons PDMS sur les couvercles.
    REMARQUE: Si le processus de retrait a fonctionné correctement, les tampons ne doivent pas se détacher des couvercles sans résistance, mais ne doivent pas non plus être si fermement collés aux couvercles qu’ils ne peuvent pas être retirés sans force excessive.
19. Vérifiez la fidélité des couvercles à motifs à l’aide du filtre approprié sur un microscope fluorescent (selon le colorant fluorescent avec lequel les protéines sont marquées).
20. Utilisez immédiatement les couvercles à motifs ou enregistrez-les et rangez-les à l’abri de la lumière directe.

3. Couvercles activés

REMARQUE: Les couvercles inférieurs destinés à être utilisés dans la chambre expérimentale pour les gels PAA sont fabriqués à cette étape. Ce couvercle inférieur est spécialement traité pour permettre au gel PAA de rester solidement adhéré lorsque le couvercle à motifs supérieurs est retiré pendant le processus de modelage. Des techniques similaires sont également décrites ailleurs 10,12,15,28.

1. Sonicate 30 mm couvre les couvercles dans de l’éthanol à 100% pendant 10 min, rincer à l’eau DI, puis bien sécher avec un pistolet à air filtré. Préparez jusqu’à 6 couvercles à la fois par lot dans une plaque de 6 puits.
2. Plasma traiter les couvercles pendant 1 min à haute température (puissance radiofréquence de 30 W) puis placer chaque couvercle dans un puits d’une plaque de 6 puits.
3. Enduisez chaque couvercle d’une très fine couche d’APTMS à 5% d’éthanol dans une hotte.
   REMARQUE: Un résidu d’orange se formera en cas de revêtement excessif dans ce processus.
4. Couvrez la plaque à 6 puits et laissez reposer les couvercles pendant 5 min.
5. Rincez soigneusement les couvercles (des deux côtés) et l’intérieur de chaque puits avec de l’eau DI et éliminez l’excès d’eau à l’intérieur des puits.
6. Replacez les couvercles dans la plaque à 6 puits et ajoutez environ 2 mL de glutaraldéhyde à 0,5 % dans l’eau DI.
7. Couvrir la plaque de 6 puits et laisser les couvercles reposer dans la solution de glutaraldéhyde pendant 30 min; ensuite, rincez soigneusement les couvercles et les puits de chaque plaque avec de l’eau DI.
8. Conservez les couvercles traités dans de l’eau DI dans les plaques de 6 puits jusqu’à deux semaines ou utilisez-les immédiatement. Assurez-vous que les couvercles sont complètement secs avant utilisation.

4. Fabrication de gel PAA et transfert de motifs

REMARQUE: Une fois que les couvertures à motifs sont fabriquées, elles doivent être utilisées pour transférer ces modèles de protéines dans l’hydrogel PAA peu de temps après (<24 h)^1,29,30. La recette suivante est pour un gel PAA avec un module de Young de 3,6 kPa. Les quantités de bis-acrylamide, d’acrylamide et d’eau DI peuvent être modifiées pour ajuster la rigidité des gels PAA¹².

1. Juste avant de commencer à fabriquer le précurseur de l’hydrogel PAA, retirez l’ester de l’acide acrylique N-hydroxysuccinimide (NHS) du réfrigérateur afin qu’il puisse atteindre la température ambiante avant d’être ouvert. Préparez un plat à couvercle interchangeable en le stérilisant avec de l’éthanol à 70% et en le laissant reposer sous la lumière UV dans une armoire de biosécurité pendant au moins 30 minutes avant utilisation.
   ATTENTION: NHS est un irritant toxique pour la peau et les yeux; utilisez des gants et des lunettes de protection lorsque vous le manipulez et travaillez sous une hotte aspirante.
   1. Ajouter 1,25 mL d’acrylamide à 40 % dans de l’eau DI dans un tube conique de 15 mL.
      ATTENTION : L’acrylamide est un irritant toxique pour la peau et les yeux; utilisez des gants et des lunettes de protection lorsque vous le manipulez et travaillez sous une hotte aspirante.
   2. Ajouter 175 μL de solution de bis-acrylamide dans de l’eau DI dans le même tube (étape 4.1.1).
      ATTENTION : Le bis-acrylamide est un irritant toxique pour la peau et les yeux; utilisez des gants et des lunettes de protection lorsque vous le manipulez et travaillez sous une hotte aspirante.
   3. Ajouter 500 μL de 10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      ATTENTION : Le PBS est un irritant pour les yeux; utilisez des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation.
   4. Ajouter 2,915 mL d’eau DI.
2. Pipette 969 μL de ce précurseur dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et conserver le reste à 4 °C pendant deux semaines.
3. Mesurer environ 50 à 100 mg de persulfate d’ammonium (APS) dans un autre tube de microcentrifugation et le diluer dans de l’eau DI jusqu’à 100 mg / mL; mettez-le de côté pour une utilisation ultérieure. Ouvrez l’ester NHS (maintenant à température ambiante) dans la hotte et mesurez soigneusement jusqu’à 3 mg de NHS dans un tube de microcentrifugation. Diluer l’ester nhs à 1 mg/mL dans 1x PBS.
   ATTENTION: APS est un irritant pour la peau et les yeux; utilisez des gants et des lunettes de protection lorsque vous le manipulez et travaillez sous une hotte aspirante. L’APS et l’ester de NHS s’hydrolysent au fil du temps, ce qui fait varier l’activité des produits chimiques contenus dans la solution mère. Par conséquent, ces deux solutions doivent être préparées fraîches à chaque fois (contrairement au reste du précurseur).
4. Effectuez les trois étapes suivantes dans une hotte :
   1. Ajouter 2 μL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) dans le tube de microcentrifugation contenant l’aliquote de 969 μL de précurseur de PAA.
      ATTENTION : TEMED est un irritant inflammable pour la peau et les yeux; gardez-le à l’abri de la chaleur, des flammes ou des étincelles, utilisez des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation et travaillez sous une hotte aspirante. TEMED est l’un des deux agents de réticulation essentiels à la polymérisation de l’hydrogel PAA, l’autre étant l’APS.
   2. Ajouter 15 μL d’acide chlorhydrique 1 M pour diminuer le pH de la solution d’hydrogel et éviter l’hydrolyse de l’ester NHS.
      ATTENTION : L’acide chlorhydrique est un irritant corrosif pour la peau et les yeux; utilisez des gants et des lunettes de protection lorsque vous le manipulez et travaillez sous une hotte aspirante.
   3. Ajouter 10 μL de la solution d’ester NHS au tube.
      REMARQUE: Le NHS est essentiel au processus de modélisation. Il réagira avec les groupes amines dans les protéines sur le couvercle à motifs pour former une liaison amide stable, ce qui permettra au motif d’être transféré du couvercle en verre à la surface du gel PAA au fur et à mesure qu’il polymérise³¹.
5. Effectuez ces dernières étapes dans une armoire de biosécurité :
   1. Placez soigneusement le couvercle de 30 mm dans la partie métallique de l’ensemble de plats à couvercle (3-APTMS et côté traité au glutaraldéhyde vers le haut) et vissez l’anneau en plastique sur le dessus. Configurez le couvercle à motifs de sorte qu’il puisse être facilement atteint à l’étape suivante, tout en le protégeant autant que possible de la lumière.
   2. Pipette 5 μL de solution APS dans le reste du précurseur PAA dans le tube de microcentrifugation, inverser pour mélanger, puis pipeter immédiatement 35 μL de cette solution sur le couvercle de 30 mm.
   3. Déposez la protéine coverslip à motifs sur la solution, en veillant à ne pas créer de bulles d’air dans l’hydrogel. Protégez l’hydrogel de la lumière et laissez-le polymériser pendant 90 min.
   4. Une fois l’hydrogel polymérisé, utilisez une lame de rasoir ou un scalpel pour retirer le couvercle supérieur, en veillant à ce que le couvercle ne glisse pas du gel ou ne retombe pas sur le gel une fois qu’il a été retiré, car cela ruinerait le motif à la surface du gel.
      REMARQUE: Ne laissez pas le gel à découvert dans une zone avec un flux d’air important (comme une armoire de biosécurité).
   5. Pour passiver tout ester DE NHS restant dans l’hydrogel, ajouter 2 mL de PBS stérile au gel et incuber à 37 °C pendant 45 min. Préparez immédiatement les gels pour les expériences ou conservez-les pendant la nuit dans du PBS stérile à 4 °C jusqu’à utilisation.

5. Imagerie

1. Pour vous préparer à des expériences avec des cellules, allumez la chaleur (37 ° C) et l’humidité (70%) dans le microscope l’après-midi avant une expérience planifiée pour permettre à l’équipement à l’intérieur de la chambre du microscope de s’équilibrer à la température plus élevée.
   REMARQUE: Cette étape minimise la dérive z causée par les fluctuations de température.
2. Juste avant le début de l’expérience, allumez la source de CO₂ de la chambre.
3. Pour éviter la dérive x-y causée par le mouvement répété de l’étape du microscope pendant l’expérience, fixez l’ensemble de plats à couvercle interchangeable contenant l’hydrogel ensemencé à la scène avec du ruban adhésif double face.
4. Regardez sur le gel pour trouver des cadres d’intérêt pour l’image, en sauvegardant chaque position d’étape des sections à imager.
5. Dans la vue en champ clair et la vue fluorescente correspondant à la protéine marquée, réglez le logiciel du microscope pour imager chaque image une fois toutes les 5 minutes pendant 2 h.

6. Analyse d’images

REMARQUE: Un système a été développé qui peut mesurer la déformation des gels PAA à motifs en déterminant l’emplacement des points de traction, en interpolant les emplacements initiaux des points déformés, puis en calculant les forces de traction cellulaire à chaque endroit. Tout système logiciel capable d’effectuer des traitements d’images et des calculs numériques peut être utilisé. Le programme vise à déterminer rapidement les forces de traction, en éliminant les entrées de l’utilisateur et les procédures de prétraitement qui contribueraient aux erreurs liées à l’utilisateur. Le code utilisé ici est disponible ici en tant que fichiers supplémentaires 2-10, et ces fichiers, ainsi qu’une paire d’images de pratique, sont accessibles à www.bu.edu/mml/downloads.

1. Dans un logiciel de traitement d’image, ouvrez toutes les images individuelles prises au cours d’une expérience timelapse à partir de chaque vue de microscope utilisée dans l’ordre, de la première à la dernière image capturée, et transformez-les en une seule pile d’images (en cliquant sur Image | Piles | Images à empiler). Assurez-vous qu’il existe deux piles d’images distinctes : l’une des vues en fond clair des cellules et l’autre de la vue fluorescente du motif auquel elles sont attachées.
   1. S’il y a une dérive dans les images fluorescentes (c’est-à-dire que l’îlot d’intérêt se déplace dans la direction x et/ou y entre chaque image de >1 à 2 μm), traitez d’abord la pile d’images avec le plugin StackReg (P. Thévenaz, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne) pour recentrer chaque image de la pile en fonction de la position de la première (en cliquant sur Plugins | | StackReg | de traduction D’accord).
      REMARQUE: Ceci est essentiel car même une dérive inférieure à μm peut affecter de manière significative le calcul final des forces de traction, en particulier sur les gels plus rigides où cette dérive x-y est en dehors de la plage de bruit attendue. Ce code enregistrera les images après la suppression de la dérive, qui peuvent ensuite être transformées en une nouvelle pile d’images à analyser.
2. Entrez les piles d’images en champ clair et fluorescentes dans CTFTimelapse.m (fichier supplémentaire 2).
   1. Spécifiez le répertoire de fichiers où se trouvent les piles d’images à la ligne 7.
   2. Aux lignes 8 et 9, spécifiez les noms de la pile d’images fluorescentes et de la pile fluorescente en champ lumineux correspondante, respectivement.
   3. Spécifiez la rigidité du gel PAA (Pa):
      1. Dans les lignes 11 à 14, qui comprennent quelques différents modules élastiques d’hydrogels PAA utilisés le plus souvent, commentez (tapez % au début de la ligne) tous sauf le module élastique du gel dans les images analysées. Vous pouvez également ajouter le module élastique s’il n’est pas déjà présent et commenter le reste (3658.19 Pa pour les images de test).
   4. Spécifiez le rayon de point (m) sur la ligne 15 (1 × ^10-6 m pour les images d’essai).
   5. Spécifiez le diamètre maximal possible des points (μm) sur la ligne 16 (2,5 μm pour les images d’essai).
   6. Spécifiez le rapport de pixels (μm/pixel) :
      1. Dans les lignes 17 à 20, qui comprennent quelques rapports de pixels d’image différents basés sur les configurations d’imagerie utilisées précédemment, commentez (tapez % au début de la ligne) tous sauf le rapport de pixels des images analysées. Vous pouvez également ajouter le rapport de pixels utilisé s’il n’est pas déjà présent et commenter le reste (0,1613 μm/pixel pour les images de test).
   7. Aux lignes 35 et 87, spécifiez le répertoire de fichiers dans lequel se trouvent les fichiers de traitement d’image nécessaires.
      REMARQUE: À partir de la pile d’images fluorescentes, le code détermine l’emplacement de chaque point fluorescent et suit le mouvement de chaque point entre chaque image de la pile²⁰. La position initiale des points imprimés en microcontact est connue car ils ne se déforment pas lorsqu’ils sont correctement transférés à l’hydrogel³².
3. Attendez que deux figures et une boîte de dialogue apparaissent une fois que le programme a trouvé les points. Utilisez la figure 1 pour vous assurer que le programme a trouvé les bons points et n’a pas trouvé beaucoup de points là où il n’y en avait pas. Utilisez la figure 2 pour choisir la grille rectangulaire qui aide le programme à localiser et à calculer les forces de traction cellulaire.
   REMARQUE: La figure 1 est l’image en fond clair de la cellule avec les points trouvés par le programme (qui seront rouges) superposés dessus (voir la figure 3A). La figure 2 est une image affichant les mêmes points que ceux de la figure 1 , mais sans l’image en fond clair en arrière-plan.
   1. Attendez que la boîte de dialogue vous invite à appuyer sur Entrée après avoir sélectionné un point - dans lequel chaque point est l’un des points rouges trouvés par le programme - et a un grand bouton à l’intérieur intitulé Entrée.
   2. Choisissez quatre points différents dans la figure 2 pour créer une grille rectangulaire autour et inclure la cellule/grappe sur ce motif. Sélectionnez chaque point un par un avec un clic gauche de la souris et confirmez-le en appuyant sur Entrée sur le bouton dans la boîte de dialogue susmentionnée. Comptez le nombre de points entre le premier et le deuxième point ainsi que le premier et le troisième point, car le programme demandera ces valeurs une fois que tous les points à quatre coins auront été sélectionnés. Entrez ces valeurs dans la fenêtre de commande (tapez le nombre de points et cliquez sur le bouton Entrée du clavier lorsque vous y êtes invité).
4. Une fois la grille rectangulaire choisie, attendez que le script calcule les forces de traction qu’il trouve dans la grille en fonction de l’emplacement des points fluorescents. Notez que le script trouve d’abord le vecteur de déplacement (u) du centre géométrique de chaque point, puis calcule le vecteur de force de traction (F) correspondant en utilisant Eq (1) :
   (1)
   Où E est le module de Young du substrat PAA, a est le rayon des marqueurs de points fluorescents, et ν est le rapport de Poisson du substrat PAA³². Eq (1) suppose que le substrat est un demi-espace élastique infini, que des forces de traction sont appliquées au centre de chaque marqueur de points circulaires et que l’espacement entre les marqueurs de points est suffisamment grand pour que leurs déplacements respectifs n’interagissent pas les uns avec les autres²³.
   REMARQUE: Dans les expériences décrites ici, des marqueurs de points de rayon a = 1 μm et un espacement centre-centre de 6 μm sont utilisés. Des flèches de force de traction à l’intérieur de la cellule/grappe pointant vers l’intérieur vers le centre de la cellule doivent être présentes, tandis que la zone à l’extérieur de la cellule/grappe ne doit pas avoir de flèches de traction présentes (voir Figure 3C-E). Les flèches de traction pointant vers l’extérieur de l’intérieur de la cellule/grappe ou de nombreuses grandes flèches de traction présentes à l’extérieur de la cellule sont révélatrices d’une grille rectangulaire mal choisie.
5. Une fois que le champ de traction correct est trouvé, sélectionnez une région d’intérêt (ROI) appropriée entourant la cellule/le cluster, qui inclut toutes les flèches de traction dans la cellule à l’aide du curseur.
   1. Pour dessiner le retour sur investissement, cliquez avec le bouton gauche autant de fois que nécessaire pour dessiner une forme de polygone avec autant de côtés que vous le souhaitez, ajuster la forme ou déplacer le retour sur investissement après qu’il a été dessiné en cliquant avec le bouton gauche sur les coins ou les bords, respectivement. Une fois le retour sur investissement dessiné, double-cliquez avec le bouton gauche de la souris pour passer à l’image suivante dans la pile. Répétez cette opération pour toutes les images de la pile de champs lumineux.
      REMARQUE: Le code enregistrera les données de force de traction et de déplacement pour chaque point temporel dans le même dossier que les piles d’images d’origine, qui peuvent ensuite être analysées plus en détail.

Résultats

Des hydrogels PAA avec le module de Young de E = 3,6 kPa et le rapport de Poisson de ν = 0,445 ont été fabriqués pour être utilisés par cette méthode de micromotif soustractif. Les hydrogels ont été conçus pour avoir une épaisseur d’environ 100 μm, ce qui leur permet d’être imagés avec la configuration d’imagerie utilisée ici tout en empêchant les cellules de détecter le couvercle rigide sous le gel, ce qui poserait des problèmes dans les études axées sur la détection de rigid...

Discussion

Une méthode améliorée de modelage indirect des hydrogels PAA est décrite dans cet article. Cette approche s’appuie sur des méthodes qui ont été utilisées précédemment 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Le principal ch...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-aminopropyl)trimethoxysilane	Sigma Aldrich	#281778
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	#05-408-129
15 mL conical tube	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask	Advance Reproductions Corporation	N/A	Custom-designed mask
6 Well Plates	Fisher Scientific	#07-200-83
Acetone	Fisher Scientific	#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Aminonium Persulfate	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrylamide	Fisher Scientific	#PR-V3141
Ethanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round	Fisher Scientifc	#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round	Warner	#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera	Hamamatsu	#C10600-10B
Human Plasma	Valley Biomedical	#HP1051P	Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set	Bioptechs	#190310-35
Kim Wipes	Fisher Scientific	#06-666-11C
Mask Alinger	Karl Suss	#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Live Cell Stain	Thermo Fisher	#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope	Olympus	#IX81
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	#52-1308-00
Photoresist Spinner Hood	Headway Research	#PWM32
Plasma Cleaner	Harrick	#PDC-001
Plasma Etcher	TePla	#M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source	Prior Scientific	#L200
Silicon Wafers, 100 mm	University Wafer	#809
SU-8 2005	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9463827
SU-8 Developer	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine	Fisher Scientific	#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Objective	Olympus	#N2709300
UV Flood Exposure	Newport	#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40