JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.

Abstract

מיקרוסקופיית מתיחה מיקרו-פטרן מאפשרת שליטה על הצורה של תאים בודדים ואשכולות תאים. יתר על כן, היכולת לעצב בסולם אורך המיקרומטר מאפשרת שימוש באזורי מגע מעוצבים אלה למדידת כוחות מתיחה, שכן כל נקודה מיקרו-פטרנטית מאפשרת היווצרות של הידבקות מוקדית אחת המעוותת את ההידרוג'ל הרך והבסיסי. גישה זו שימשה למגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאי אנדותל, תאי שריר חלקים, פיברובלסטים, טסיות דם ותאי אפיתל.

סקירה זו מתארת את האבולוציה של טכניקות המאפשרות הדפסה של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים של פוליאקרילאמיד במערך קבוע של נקודות בגודל ובמרווחים שצוינו מראש. מכיוון שקשה להדפיס תבניות בקנה מידה של מיקרומטר ישירות על מצעים רכים, התבניות נוצרות תחילה על כיסויי זכוכית קשיחים המשמשים לאחר מכן להעברת התבנית להידרוג'ל במהלך הג'לציה. ראשית, מתוארת גישת ההדפסה המיקרו-קונטגטית המקורית ליצירת מערכים של נקודות קטנות על הכיסוי. צעד שני שמסיר את רוב התבנית כדי להשאיר איים של נקודות קטנות נדרש כדי לשלוט בצורות של תאים ואשכולות תאים על מערכים כאלה של נקודות מעוצבות.

לאחר מכן, מתוארת אבולוציה של גישה זו המאפשרת יצירת איים של נקודות באמצעות שלב דפוס תת-קרקעי יחיד. גישה זו היא פשוטה מאוד עבור המשתמש, אבל יש את החיסרון של אורך חיים מופחת עבור תבנית האב הדרושה כדי ליצור את הדפוסים. לבסוף, מתוארות הגישות החישוביות שפותחו לניתוח תמונות של נקודות שנעקרו ושדות מתיחה שנוצרו לאחר מכן על ידי תאים, וגרסאות מעודכנות של חבילות ניתוח אלה מסופקות.

Introduction

רוב הפנוטיפים של התא מפעילים כוחות אחיזה על סביבתם. כוחות מתיחה אלה נוצרים על ידי שלד הציטוסקלטון המתכווץ של התא, שהוא רשת של אקטין ומיוזין, וביופולימרים נימיים אחרים וחלבונים צולבים 1,2,3,4. כוחות הנוצרים בתוך התא יכולים להיות מועברים לסביבה החוץ-תאית או לתאים הסמוכים, בעיקר באמצעות חלבוני טרנס-ממברנה כגון אינטגרין וקדרינים, בהתאמה 5,6. האופן שבו תא מתפשט או מתכווץ - וגודל כוחות המתיחה הקשורים לתנועות אלה - הוא תוצאה של שיחה אינטימית עם סביבתו, התלויה במידה רבה בסוג ובכמות החלבון הקיימים במטריצה החוץ-תאית (ECM)7,8 ובנוקשות של ה-ECM. ואכן, מיקרוסקופיית כוח המתיחה הפכה לכלי שלא יסולא בפז להבנת היענות התאים לגירויים מקומיים כגון נוקשות המצע, לחצים מכניים ומוטלים על מתחים, או מגע עם תאים אחרים. מידע זה רלוונטי ישירות להבנת מחלות כגון סרטן ואסתמה 9,10,11,12.

מערכת שיכולה לשמש למדידת דפורמציה המושרה בכוח של מצע של תכונות חומר ידועות נדרשת כדי לחשב את כוחות המתיחה. יש לעקוב אחר שינויים אלה לאורך זמן, הדורשים הן טכניקות הדמיה והן טכניקות עיבוד תמונה. אחת השיטות הראשונות ששימשו לקביעת כוחות המתיחה התאית הייתה תצפית וניתוח של התכווצות של קולגן הידרוג'לים שנזרעו בתאים, אם כי שיטה זו הייתה רק סמי-קוונטיטיבית13. שיטה אחרת, מעודנת יותר, הייתה למדוד את כוחות המתיחה המופעלים על ידי תאים בודדים על ידי קביעת הכוחות הנובעים מעיוות של יריעה דקה של סיליקון14. בהמשך פותחו טכניקות מדידה כמותיות נוספות, ושיטות אלה אפשרו גם שימוש בהידרוג'לים רכים כגון פוליאקרילאמיד (PAA)12,15,16. בעת שימוש בחומרים רכים אלה, ניתן היה לקבוע את כוחות המתיחה מתוך תזוזה המושרה בכוח של חרוזים שנעקרו באופן אקראי המוטמעים בהידרוג'ל והתכונות המכניות של הג'ל16,17. התקדמות נוספת הגיעה עם פיתוח מערכי מיקרופוסטים העשויים מפולידימתילסילוקסן רך (PDMS) כך שניתן יהיה למדוד את סטייתם ולהמירם לכוח באמצעות תורת הקרן18.

לבסוף, פותחו שיטות למיקרו-פטרינג הידרוג'לים רכים מכיוון שגישות אלה מאפשרות שליטה על אזורי המגע להדבקת תאים. על ידי מדידת העיוות של המיקרו-פטרן בתוך אזור המגע של התא, ניתן היה לחשב בקלות את כוחות המתיחה מכיוון שאין צורך בתמונת ייחוס נטולת כוח19. שיטה זו אומצה באופן נרחב מכיוון שהיא מאפשרת דפוס עקיף של מערך קבוע של נקודות הידבקות חלבונים פלואורסצנטיים בדידים בגודל מיקרון על ג'לים PAA למדידת כוחות המתיחה התאית20. כדי לחשב את הכוחות האלה, פותח אלגוריתם לעיבוד תמונה, שיכול לעקוב אחר התנועות של כל נקודה מיקרו-פטרית ללא צורך בקלט משתמש,21.

בעוד ששיטה זו פשוטה ליצירת רשתות שלמות של תבניות נקודות, היא מורכבת יותר כאשר רוצים תבניות של טלאים מבודדים (או איים) של נקודות. איים זעירים שימושיים כאשר יש צורך בשליטה על הצורה, ובמידה מסוימת של גודל, של אשכולות של תאים. כדי ליצור איים אלה, השיטה הנ"ל של הדפסת מיקרו-קונטיקט מחייבת שני שלבים נפרדים: i) שימוש בחותמת PDMS אחת כדי ליצור תבנית של נקודות בנאמנות גבוהה על מכסה, ולאחר מכן ii) שימוש בחותמת PDMS שונה שנייה כדי להסיר את רוב הנקודות הללו, תוך השארת איים מבודדים של נקודות21. הקושי ביצירת איים בשיטה מקורית זו מתווסף לעובדה שיצירת תבניות רשת עקביות בשלב הראשון של התהליך היא מאתגרת בפני עצמה. בולי מיקרו-הדפסה מורכבים ממערך של מיקרו-עמודים עגולים, שקוטרם מתאים לגודל הנקודה הרצוי. לאחר מכן מצופים בולים אלה בשכבה אחידה של חלבון ולאחר מכן מוטבעים בלחץ מדויק על כיסויים מטופלים כדי ליצור את התבנית הרצויה. מצד אחד, הפעלת לחץ רב מדי על החותמת עלולה לגרום להעברת חלבונים לא אחידה ולנאמנות דפוס לקויה עקב אבזם עמודים או נפול בין עמודים, מה שמוביל למגע עם הזכוכית. מצד שני, הפעלת לחץ נמוך מדי גורמת להעברת חלבון מועטה עד אפסית ולנאמנות דפוסים ירודה. מסיבות אלה, רצוי תהליך העברה שניתן להשתמש בו כדי ליצור באופן עקבי מיקרו-פטרנים באיכות גבוהה של איים מבודדים של נקודות בשלב אחד בלבד.

כאן מתוארת שיטה למיקרו-פטרציה עקיפה של איים של נקודות הידבקות חלבונים פלואורסצנטיים בגודל מיקרון על ג'ל PAA שהוא עקבי ורב-תכליתי יותר משיטות שפותחו בעבר. בעוד ששיטות מיקרו-פטרינג עקיפות ישנות יותר מסתמכות על העברת תבניות חלבונים מחותמת PDMS למצע ביניים, השיטה שהוצגה כאן משתמשת בחותמות PDMS במקום זאת ככלי להסרת חלבונים, לא כתוספת. זה נעשה על ידי שינוי יסודי הראשון של המבנה של חותמות PDMS בשימוש. במקום ליצור בולים המורכבים מתבנית של עמודים עגולים במרווחים שווים, הבולים מורכבים מתבנית של חורים עגולים במרווחים שווים בשיטה זו.

עם מבנה חדש זה, ניתן לטפל במשטח של חותמות PDMS אלה באמצעות גלוטארלדהיד כפי שתואר קודם לכן20,29,30, מה שהופך את החותמת מסוגלת להיקשר באופן קוולנטי עם חלבון. כאשר משתמשים בהם על כיסוי זכוכית המצופה באופן שווה בחלבון פלואורסצנטי, חותמות PDMS אלה, שטופלו בגלוטרלדהיד, משמשות להסרת רוב החלבון על פני השטח של הכיסוי, ומותירות אחריהן רק את התבנית הרצויה של נקודות שנקבעו מראש על ידי מיקום החורים בגודל מיקרון על החותמת. שינוי זה מגדיל את שיעור ההצלחה ביצירת תבניות המורכבות מרשת כמעט רציפה של נקודות וביצירת איים מבודדים של נקודות באמצעות צעד אחד בלבד.

Protocol

1. יצירת מאסטרים של סיליקון

הערה: רוב התהליך של העיצוב, היצירה ופתרון הבעיות של מאסטרים של סיליקון עבור יציקה חוזרת ונשנית של חותמות PDMS כוסה בעבר21, כך שרק הבדלים מרכזיים בגישה חדשה זו יתוארו כאן.

  1. צור את העיצוב עבור מסיכת הצילום באמצעות AutoCAD או תוכנת עיצוב דומה. מצפים צד אחד של מסכת הצילום, חתיכת זכוכית דקה, בשכבה דקה של כרום כדי לשלוט בפיזור אורות UV. עצבו את מסכת הצילום כך שאור UV בוהק דרכה אל הפוטורסיסט שנבחר ייצור מאסטר סיליקון עם ההופכי של התכונות הרצויות על חותמות ה-PDMS הסופיות. ראו איור 1 לעיצוב המסכה הזו.
    הערה: השאלה אם התכונות הרצויות או האזור שמחוץ להן צריכים להיות שקופים במסכת הצילום תלויה בפוטורסיסט שנבחר. הפוטורסיסט המשמש כאן הוא SU-8 2005 (זהירות: דליק, עור ומגרה את העין; התרחקו מחום/להבות/ניצוצות והשתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול), פוטורסיסט שלילי המסוגל ליצור תכונות בגובה 5 מיקרומטר עם דפנות צדדיות כמעט אנכיות.
    1. לרפא את הפוטורסיסט השלילי על ידי חשיפתו לאור UV והסרת SU-8 הלא מרוסן עם ממס כימי. לכן, עצבו את המאפיינים העיקריים של המסכה כך שיהיו שקופים בזמן שהסביבה של המסכה אטומה.
    2. עבור שיטת ההסרה החדשה הזו, עצבו את מסיכת הצילום כך שתורכב משני ריבועים בגודל 1.5 על 1.5 ס"מ (איור 1A), אחד מלא ברשת אחידה של 2 μm circles במרווחים של 6 מיקרומטר ממרכז למרכז, והשני מורכב מאיים מרובעים רבים שהם גרסאות קטנות ומבודדות יותר של אותה תבנית רשת (איור 1B). צור איים בגדלים הבאים: 6 x 6 נקודות, 12 x 12 נקודות, 25 x 25 נקודות ו- 42 x 42 נקודות.
      הערה: קוטר נקודות ההדבקה (2 מיקרומטר) נבחר על סמך מחקרים קודמים שמדדו את כוחות המתיחה התאית22,23. המסכה המשמשת כאן היא 101.6 x 101.6 מ"מ והיא מצופה בצד אחד בשכבת כרום בעובי 0.06 מיקרומטר, המומלצת בגלל התכונות הקטנות של המאסטר. מסכת הצילום המשמשת כאן הוזמנה מחברת הדפסת מסכות צילום חיצונית.
  2. בתוך חדר נקי, מצפים את פרוסת הסיליקון שנבחרה באופן שווה עם פוטורסיסט. כצעד אופציונלי, טפלו על פני השטח בוופל בפלסמה אשר לפני שציפו אותה בהתנגדות.
    הערה: כאן נעשה שימוש בוופלים בקוטר 100 מ"מ. טיפול בפלזמה אשר הופך את הוופל לנוח יותר לקשירה ל- SU-8 ומסייע במניעת הפחתה של SU-8 מהופל.
  3. בצע את השלבים הבאים בהתאם להוראות יצרן הפוטורסיסט:
    1. סובבו את הוופל המצופה כדי ליצור את עובי התכונה הרצוי, תוך שינוי זמן הסיבוב בהתאם לעובי הרצוי ולסוג ההתנגדות. עבור SU-8 2005 בעובי 5 מיקרומטר, חלק את תוכנית הספין המומלצת לשלושת השלבים הבאים:
      1. ציפו את הוופל בפוטורסיסט על ידי סיבוב ב-500 סל"ד במשך 10 שניות עם רמפה של 100 סל"ד לשנייה.
      2. הפחיתו את עובי ההתנגדות לכ-5 מיקרומטר על ידי סיבוב הוופל ב-3,000 סל"ד עם רמפה של 300 סל"ד לשנייה למשך 30 שניות.
      3. האטו באיטיות את הוופל לאחר הסיבוב על ידי הפחתת המהירות ל-0 סל"ד עם רמפה של 500 סל"ד לשנייה למשך שנייה אחת.
    2. הכינו את ההתנגדות לחשיפה לקרינת UV על ידי אפייתו לזמן קצר על צלחת חמה של 95 מעלות צלזיוס. לשנות את הזמן בילה על הלוח החם בהתאם לעובי הרצוי של ההתנגדות; זמן האפייה הוא 2 דקות עבור SU-8 בעובי 5 מיקרומטר 2005.
    3. חשוף את ההתנגדות לאור UV כדי לרפא באופן מלא את התכונות הרצויות. היזהר מחשיפת יתר, מכיוון שזה יכול להפוך את SU-8 לשברירי ולהשפיע על האיכות הכוללת של המאסטר המתקבל.
      1. השתמש באנרגיית חשיפה של 105 mJ/cm2 עבור SU-8 2 בעובי 5 מיקרומטר 2005. בהתבסס על ההספק של מנורת ה- UV הזמינה, חשב את זמן החשיפה על ידי חלוקת אנרגיית החשיפה בעוצמת המנורה ב- mW.
        הערה: מכיוון שלמנורה המשמשת כאן יש הספק של 8 mW, זמן החשיפה צריך להיות 13.1 שניות.
    4. כדי להגדיר את התכונות SU-8 לאחר הפיתוח, יש לאפות שוב על פלטה חמה של 95 מעלות צלזיוס, הפעם למשך 3 דקות. המתן עד שתכונות הרצויות של המאסטר יופיעו תוך דקה אחת במהלך שלב אפייה זה אם ההתנגדות נחשפה כראוי.
    5. הסר SU-8 לא מרוסק מתוך פרוסת הסיליקון באמצעות מפתח SU-8. היו יסודיים בעת הסרת ה-SU-8 הלא מחוספס, מכיוון שהוא עלול להיתקע בין התכונות בגודל מיקרון ובמרווחים על הוופל.
      אזהרה: מפתח SU-8 הוא מגרה עור ועיניים דליק; הרחיקו אותו מחום/להבות/ניצוצות והשתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול בו.
    6. לאחר הפיתוח, יש לשטוף עם אצטון כדי להסיר מפתח עודף על הוופל ולייבש אותו לחלוטין עם אקדח ריסוס חנקן.
      אזהרה: אצטון הוא עור דליק ומגרה את העיניים; הרחיקו אותו מלהבות/ניצוצות והשתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול בו.
    7. לחלופין, עבור SU-8 2005, יש לאפות על צלחת חמה של 200 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      הערה: אפייה קשה זו מוסיפה חוזק מכני לפוטורסיסט.
  4. לאחר שהורשו להתקרר, הכניסו את הוופל למגש מנשא פרוסות ואז הטילו אותו ב-PDMS. ראשית, השלם טיפול סילאניזציה על הוופל כדי להפוך את תכונות SU-8 של מאסטר הסיליקון פחות סביר להיקשר PDMS ולכן פחות סביר להסיר את פני השטח של הוופל.
    1. כדי להשלים את הטיפול במשטח הסילאניזציה, הניחו את המאסטר ואת מכסה הזכוכית הקטנה בתוך מייבש המיועד לשימוש עם סילאנים בלבד. מניחים 1-2 טיפות קטנות של טריכלורו (1H,1H,2H,2H,2H-perfluorooctyl)silane על הכיסוי, סוגרים את המפרק ומפעילים אותו תחת ואקום למשך 30 דקות בלחץ של 4,500 Pa24.
      זהירות: טריכלורו (1H,1H,2H,2H,2H-perfluorooctyl)סילאן הוא עור דליק ומגרה את העיניים; הרחיקו אותו מחום/להבות/ניצוצות, השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול, ועבדו מתחת למכסה אדים.
    2. כבו את הוואקום והשאירו את המאסטר וכיסוי במייבש למשך 30 דקות נוספות.
      הערה: המאסטר מוכן כעת לליהוק ב- PDMS.

2. הדפסה זעירה תת-קרקעית

  1. ערבב PDMS ביחס הנכון של חומר ריפוי לבסיס בהתבסס על הוראות היצרן. תן לו לשבת בטמפרטורת החדר ולחץ במשך 15 דקות; לאחר מכן, דגה תחת ואקום במשך 15 דקות.
  2. שפכו את ה-PDMS לתוך המאסטר והכניסו אותו לחממה שנקבעה ל-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לרפא.
  3. הסר את המאסטר מהאינקובטור ואפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
  4. בזמן שהמאסטר מתקרר, sonicate כיסויים 25 מ"מ באתנול במשך 10 דקות. השתמש בכיסויים רבים כמו מספר הבולים המוכנים.
  5. יש לשטוף היטב כיסויים בקוטר 25 מ"מ במים שעברו דה-יוניזציה (DI) ויבשו באמצעות אקדח אוויר מסונן.
  6. פלזמה מטפלת בכיסויים למשך דקה אחת באמצעות שואב פלזמה תחת ואקום בעוצמה גבוהה (תדר רדיו של 30 W). הקפידו לשחרר את הוואקום באיטיות לאחר הטיפול כדי למנוע מהכיסויים לנוע בתוך התא.
    הערה: טיפול פלזמה במשטח הזכוכית משרת שתי מטרות: הוא מנקה את פני השטח של הזכוכית כדי להסיר מזהמים ומייצר קבוצות קוטביות מבוססות חמצן על פני השטח של הזכוכית כדי להפוך אותה להידרופובית25. הידרופוביות זו הופכת את פני השטח של הזכוכית ליותר נוחים לקשירת חלבונים.
  7. בחדר נטול תאורת שמש/תקורה ישירה, מצפים כל כיסוי ב-100 μL של תמיסת חלבון עם תווית פלואורסצנטית בריכוז של לפחות 100 מיקרוגרם/מ"ל, מכסים להגנה נוספת מפני אור ומניחים לו לשבת במשך 20 דקות.
    הערה: כאן נעשה שימוש בפיברונקטין שבודד מפלזמה אנושית וצבוע ב-AlexaFluor 488.
    1. כדי לצבוע פיברונקטין, שלבו פיברונקטין ללא תווית של ריכוז ונפח ידועים עם הכמות המתאימה של צבע פלואורסצנטי בצינור של 1.5 מ"ל. מכסים את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן על הצבע מפני אור ומדגרים אותו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, תוך ערבוב עדין כל 10 דקות על ידי הפיכת הצינור הפוך 5-10 פעמים.
      הערה: כמות הצבע הנדרשת משתנה בהתאם לצבע שבו נעשה שימוש ומסת החלבון שבה נעשה שימוש. ראה קובץ משלים 1 למחשבון המשמש לקביעת כמות הצבע המתאימה לפיברונקטין המסומן באלקסה 488. על פי הוראות היצרן, ניתן לסנן צבע עודף באמצעות שימוש בעמודות התפלה (ראו טבלת חומרים).
  8. יש לשטוף כל כיסוי ביסודיות במי DI, ולהסיר את עודפי המים מהמשטח על ידי הקשה עדינה על דפנות כל כיסוי על מגבת נייר או על חומר סופג באופן דומה. השאירו את הכיסויים חשופים בחושך למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר להם להתייבש לחלוטין.
  9. בזמן שהכיסויים המצופים בחלבון מתייבשים, הסירו את חותמת ה-PDMS מהמאסטר על ידי חיתוך שלה עם אזמל או להב חד אחר.
    הערה: עדיף לא לנסות לחתוך את ה- PDMS בניסיון הראשון, שכן הפעלת לחץ רב כל כך תפצח את פרוסת הסיליקון ותפגע במאסטר.
  10. פלזמה מטפלת בחותמות PDMS במשך 2 דקות תחת ואקום על גבוה (הספק תדר רדיו של 30 W).
  11. בתוך מכסה אדים, מניחים את הבולים במיכל עם מכסה ומצפים כל בול בשכבה דקה מאוד (<100 μL) של 10% (3-אמינופרופיל)טרימתוקסיסיליאן (3-APTMS) מדולל ב-100% אתנול.
    אזהרה: 3-APTMS הוא מגרה עור ועיניים דליק; הרחיקו אותו מלהבות/ניצוצות, השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול, ועבדו מתחת למכסה אדים. ציפוי מוגזם של תמיסת 3-APTMS יגרום להיווצרות סרט כתום בהמשך תהליך זה. טיפול זה במשטח 3-APTMS משלב את פונקציונליות האמין על פני השטח של חותמת PDMS, מה שיאפשר גזירה נוספת של פני השטח של הבול בהמשך26.
  12. מכסים את המיכל בבולים ומאפשרים להם לשבת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  13. באמצעות מי DI, יש לשטוף ביסודיות כל חותמת משני הצדדים.
  14. מניחים את הבולים במיכל נקי ומצפים אותם בנדיבות ב-2.5% גלוטארלדהיד במי DI.
    אזהרה: גלוטארלדהיד רעיל; השתמש בכפפות מגן ומשקפיים בעת טיפול ועבודה מתחת למכסה אדים). טיפול זה בגלוטארלדהיד לצד הטיפול הקודם של 3-APTMS מספק פונקציונליות של אלדהיד על פני השטח של בולי ה-PDMS, שיכולים להגיב עם קבוצות האמין בחלבונים כדי ליצור קישור אמין משני, שהוא קריטי לתהליך הסרת החלבון27.
  15. מכסים את הבולים, מניחים להם לשבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ואז שוטפים היטב במי DI שוב. מוציאים עודפי מים מפני השטח של הבולים באותו אופן כמו הכיסויים, ומאפשרים לבולים להתייבש חשופים במשך כ-30 דקות.
  16. לאחר 30 דקות, בדקו אם גם הכיסויים המצופה בחלבון וגם הבולים יבשים. אם אחד מהם אינו יבש לחלוטין, השתמש באקדח אוויר מסונן כדי לייבש אותם לחלוטין, כדי לוודא שהכיסויים אינם חשופים לאור למשך תקופה ממושכת.
  17. לאחר שגם הכיסויים וגם הבולים יבשים, דחפו את תבנית הבולים לצד כלפי מטה אל הכיסויים בלחץ מספיק, כך שהבולים יבואו במגע מלא עם פני השטח של הכיסוי. השאירו את הבולים במגע עם הכיסויים למשך 15 דקות.
    הערה: בשל קשר האמיד הקוולנטי בין חותמת הגלוטרלדהיד עם שכבת החלבון על כיסוי הזכוכית - שהיא חזקה בהרבה מהאינטראקציות ההידרופוביות החלשות בין שכבת החלבון לכיסוי הזכוכית - החלבונים צריכים לקלף את הזכוכית בהתאם לתבנית שעל חותמת ה- PDMS לאחר הסרתה.
  18. לאחר 15 דקות, קלפו בזהירות את חותמות ה-PDMS מהכיסויים.
    הערה: אם תהליך ההסרה עבד כראוי, הבולים לא צריכים לרדת מהכיסויים ללא התנגדות, אלא גם לא צריכים להיות דבוקים כל כך חזק לכיסויים שלא ניתן להסיר אותם ללא כוח מופרז.
  19. בדקו את הנאמנות של הכיסויים המעוצבים באמצעות המסנן המתאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי (תלוי באיזה צבע פלואורסצנטי מסומנים החלבונים).
  20. השתמשו מיד בכיסויים המעוצבים או שמרו ואחסנו אותם הרחק מאור ישיר.

3. כיסויים מופעלים

הערה: הכיסויים התחתונים לשימוש בתא הניסוי עבור ג'לים PAA מיוצרים בשלב זה. כיסוי תחתון זה מטופל במיוחד כדי לאפשר לג'ל PAA להישאר דבוק היטב כאשר הכיסוי בעל הדוגמאות העליונות מוסר במהלך תהליך הדוגמה. טכניקות דומות מתוארות גם במקומות אחרים 10,12,15,28.

  1. Sonicate 30 מ"מ מכסה כיסויים ב 100% אתנול במשך 10 דקות, לשטוף עם מים DI, ולאחר מכן יבש ביסודיות עם אקדח אוויר מסונן. הכן עד 6 כיסויים בכל פעם לכל אצווה בצלחת של 6 בארות.
  2. פלזמה מטפלת בכיסויים למשך דקה אחת על גבי תדר רדיו גבוה (הספק תדר רדיו של 30 W) ולאחר מכן מניחה כל כיסוי לתוך באר של צלחת 6 באר.
  3. מצפים כל מכסה בשכבה דקה מאוד של 5% APTMS באתנול במכסה אדים.
    הערה: שאריות תפוזים ייווצרו במקרה של ציפוי מוגזם בתהליך זה.
  4. מכסים את הצלחת בת 6 הבארות ומניחים לכיסויים לשבת במשך 5 דקות.
  5. יש לשטוף את הכיסויים (משני הצדדים) ואת החלק הפנימי של כל באר ביסודיות במי DI ולהסיר מים עודפים בתוך הבארות.
  6. מניחים את הכיסויים בחזרה בלוח בעל 6 הבארות ומוסיפים כ-2 מ"ל של 0.5% גלוטארלדהיד במי DI.
  7. מכסים את צלחת 6 הבארות ומניחים לכיסויים לשבת בתמיסת הגלוטראלדהיד למשך 30 דקות; לאחר מכן, לשטוף ביסודיות הן את הכיסויים והן את הבארות של כל צלחת עם מי DI.
  8. אחסנו את הכיסויים המטופלים במי DI בתוך לוחות 6 הבארות למשך עד שבועיים או השתמשו בהם באופן מיידי. ודאו שהכיסויים יבשים לחלוטין לפני השימוש.

4. ייצור ג'ל PAA והעברת דוגמאות

הערה: לאחר יצירת כיסויים בתבנית, יש להשתמש בהם כדי להעביר את תבניות החלבונים הללו להידרוג'ל PAA זמן קצר לאחר מכן (<24 שעות)1,29,30. המתכון הבא הוא לג'ל PAA עם מודולוס יאנג של 3.6 kPa. ניתן לגוון את הכמויות של ביס-אקרילאמיד, אקרילאמיד ומי DI כדי להתאים את הנוקשות של ג'לים PAA12.

  1. רגע לפני שתתחילו לייצר את מבשר ההידרוג'ל PAA, הסירו את החומצה האקרילית N-hydroxysuccinimide (NHS) -אסטר מהמקרר כדי שתוכל להגיע לטמפרטורת החדר לפני פתיחתה. הכינו צלחת כיסוי להחלפה על ידי עיקור שלה עם 70% אתנול ותנו לו לשבת תחת אור UV בארון בטיחות ביולוגית לפחות 30 דקות לפני השימוש.
    אזהרה: NHS הוא מגרה עור ועיניים רעיל; השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול בו, ועבדו מתחת למכסה אדים.
    1. הוסיפו 1.25 מ"ל של 40% אקרילאמיד במי DI לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
      אזהרה: אקרילאמיד הוא מגרה עור ועיניים רעיל; השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול בו, ועבדו מתחת למכסה אדים.
    2. הוסף 175 μL של תמיסת bis-acrylamide במי DI לאותו צינור (שלב 4.1.1).
      אזהרה: ביס-אקרילאמיד הוא מגרה עור ועיניים רעיל; השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול בו, ועבדו מתחת למכסה אדים.
    3. הוסיפו 500 μL של 10x מלח בעל מאגר פוספט (PBS).
      אזהרה: PBS הוא מגרה עיניים; השתמש בכפפות מגן ומשקפיים בעת הטיפול.
    4. הוסף 2.915 מ"ל של מי DI.
  2. Pipette 969 μL של מבשר זה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, ולאחסן את השאר ב 4 °C (74 °F) למשך עד שבועיים.
  3. יש למדוד כ-50-100 מ"ג אמוניום פרסולפט (APS) בצינור מיקרו-צנטריפוג' אחר ולדלל אותו במי DI עד ל-100 מ"ג/מ"ל; הניחו אותו בצד לשימוש מאוחר יותר. פתחו את האסטר NHS (כעת בטמפרטורת החדר) במכסה המנוע ומדדו בזהירות עד 3 מ"ג NHS בצינור מיקרו-סנטריפוג'. דיללו את ה-NHS-ester ל-1 מ"ג/מ"ל ב-1x PBS.
    אזהרה: APS הוא מגרה עור ועיניים; השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול בו, ועבדו מתחת למכסה אדים. גם APS וגם NHS-ester יעברו הידרוליזה לאורך זמן, מה שיגרום לפעילות של הכימיקלים בתמיסת המלאי להשתנות. לכן, שני הפתרונות הללו חייבים להיות מוכנים טריים בכל פעם (בניגוד לשאר המבשרים).
  4. בצע את שלושת השלבים הבאים במכסה אדים:
    1. הוסיפו 2 μL של טטרה-מתיל-אתילנדיאמין (TEMED) לצינור המיקרו-צנטריפוגה המכיל את האליקוט 969 μL של מבשר PAA.
      זהירות: TEMED הוא עור דליק ומגרה את העיניים; הרחיקו אותו מחום/להבה/ניצוצות, השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול, ועבדו מתחת למכסה אדים. TEMED הוא אחד משני סוכני קישור צולבים הקריטיים לפולימריזציה של הידרוג'ל PAA, השני הוא APS.
    2. הוסף 15 μL של 1 M חומצה הידרוכלורית כדי להפחית את ה- pH של תמיסת ההידרוג'ל ולמנוע הידרוליזה של ה- NHS-ester.
      אזהרה: חומצה הידרוכלורית היא עור קורוזיבי ומגרה את העיניים; השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול בו, ועבדו מתחת למכסה אדים.
    3. הוסף 10 μL של פתרון NHS-ester לצינור.
      הערה: ה- NHS הוא קריטי לתהליך התבנית. הוא יגיב עם קבוצות אמינים בחלבונים על הכיסוי המעוצב כדי ליצור קשר אמידים יציב, שיאפשר להעביר את התבנית מכיסוי הזכוכית אל פני השטח של ג'ל PAA תוך כדי פולימריזציה של31.
  5. בצע את השלבים האחרונים הבאים בארון בטיחות ביולוגית:
    1. יש למקם בזהירות את מכסה ה-30 מ"מ בתוך החלק המתכתי של ערכת הכלים לכיסויים (3-APTMS ו-glutaraldehyde-מטופלים בצד למעלה) ולהברג את טבעת הפלסטיק למעלה. הגדר את הכיסוי המעוצב כך שניתן יהיה להגיע אליו בקלות בשלב הבא, ועדיין להגן עליו מפני אור ככל האפשר.
    2. פיפטה 5 μL של תמיסת APS לתוך שאר מבשר PAA בצינור microcentrifuge, להפוך אותו כדי לערבב, ולאחר מכן מיד pipette 35 μL של תמיסה זו על כיסוי 30 מ"מ.
    3. הורידו את הכיסויים המעוצבים לצד החלבון אל התמיסה, תוך היזהרו שלא ליצור בועות אוויר בהידרוג'ל. הגן על ההידרוג'ל מפני אור ואפשר לו להתפלמר במשך 90 דקות.
    4. לאחר שההידרוג'ל עבר פולימריזציה, השתמשו בסכין גילוח או באזמל כדי להסיר את הכיסוי העליון, מה שמבטיח כי הכיסוי לא יחליק מהג'ל או ייפול בחזרה על הג'ל לאחר שהוסר, שכן הדבר יהרוס את התבנית על פני השטח של הג'ל.
      הערה: אין להשאיר את הג'ל חשוף באזור עם זרימת אוויר משמעותית (כגון ארון בטיחות ביולוגית).
    5. כדי להעביר כל NHS-ester הנותרים בהידרוג'ל, להוסיף 2 מ"ל של PBS סטרילי לג'ל ולדגירה ב 37 °C (76 °F) למשך 45 דקות. מכינים מיד את הג'לים לניסויים או מאחסנים אותם למשך הלילה ב-PBS סטרילי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

5. הדמיה

  1. כדי להתכונן לניסויים עם תאים, הפעילו את החום (37 מעלות צלזיוס) והלחות (70%) במיקרוסקופ אחר הצהריים לפני ניסוי מתוכנן כדי לאפשר לציוד שבתוך תא המיקרוסקופ להתיישב לטמפרטורה הגבוהה יותר.
    הערה: שלב זה ממזער את סחף z הנגרם על ידי תנודות טמפרטורה.
  2. רגע לפני תחילת הניסוי, הפעילו את מקור ה-CO2 של החדר.
  3. כדי למנוע סחף x-y הנגרם על ידי תנועה חוזרת ונשנית של שלב המיקרוסקופ במהלך הניסוי, תקן את ערכת הכלים הניתנת להחלפה המכסה את ההידרוג'ל שנזרע בתא לשלב עם סרט הדבקה דו-צדדי.
  4. הסתכלו על הג'ל כדי למצוא מסגרות מעניינות לתמונה, ושמרו על כל מיקום שלב של המקטעים שיש להצטלם.
  5. הן בתצוגת שדה הבהיר והן במבט הפלואורסצנטי המתאים לחלבון המסומן, הגדר את תוכנת המיקרוסקופ לצלם כל מסגרת אחת ל-5 דקות במשך 2 שעות.

6. ניתוח תמונות

הערה: פותחה מערכת שיכולה למדוד את העיוות של ג'ל ה-PAA המעוצב על ידי קביעת המיקום של נקודות המתיחה, אינטרפולציה של המיקומים ההתחלתיים של הנקודות המעוותות, ולאחר מכן חישוב כוחות המתיחה התאית בכל מיקום. ניתן להשתמש בכל מערכת תוכנה המסוגלת לבצע עיבוד תמונה וחישובים מספריים. התוכנית שואפת לקבוע כוחות אחיזה במהירות, תוך ביטול קלט משתמש והליכי עיבוד מקדים שיתרמו לשגיאות הקשורות למשתמש. הקוד המשמש כאן זמין כאן כקבצים משלימים 2-10, וניתן לגשת לקבצים אלה, יחד עם זוג תמונות תרגול, www.bu.edu/mml/downloads.

  1. בתוכנת עיבוד תמונה, פתח את כל התמונות הבודדות שצולמו במהלך ניסוי בהילוך מהיר מכל תצוגת מיקרוסקופ שנעשה בה שימוש לפי הסדר, מהתמונה הראשונה ועד האחרונה שצולמה, והפוך אותן לערימת תמונות בודדת (לחיצה על תמונה | ערימות | תמונות לערימה). ודא שיש שתי ערימות תמונה נפרדות: אחת מתצוגת השדה הבהיר של התאים ואחת מהתצוגה הפלואורסצנטית של התבנית שאליה הם מחוברים.
    1. אם יש סחיפה בתמונות הפלורסנטיות (כלומר, האי המעניין נע בכיוון x ו/או y בין כל פריים על ידי >1-2 מיקרומטר), תחילה לעבד את ערימת התמונות עם תוסף StackReg (P. Thévenaz, המכון הפדרלי השווייצרי לטכנולוגיה בלוזאן) כדי לעדכן כל תמונה בערימה בהתבסס על המיקום של הראשונה (לחיצה על תוספים | סטאקרג | תרגום | בסדר).
      הערה: זה קריטי מכיוון שאפילו סחף תת-מיקרומטר יכול להשפיע באופן משמעותי על החישוב הסופי של כוחות המתיחה, במיוחד בג'לים נוקשים יותר שבהם סחף x-y זה נמצא מחוץ לטווח הרעש הצפוי. קוד זה ישמור את התמונות לאחר הסרת הסחף, ולאחר מכן ניתן להפוך אותן לערימת תמונות חדשה לניתוח.
  2. הזן את ערימות התמונות הבהירות והפלורסנטיות לתוך CTFTimelapse.m (קובץ משלים 2).
    1. ציין את ספריית הקבצים שבה ערימות התמונות ממוקמות בשורה 7.
    2. בשורות 8 ו-9, ציין את השמות של ערימת התמונות הפלואורסצנטיות ואת הערימה הפלואורסצנטית המתאימה בשדה בהיר, בהתאמה.
    3. ציין נוקשות ג'ל PAA (Pa):
      1. בשורות 11-14, הכוללות כמה מודולים אלסטיים שונים של הידרוג'לים PAA המשמשים לרוב, ציין (סוג % בתחילת הקו) את כל המודולוסים האלסטיים של הג'ל בתמונות המנותחות. לחלופין, הוסף את המודולוס האלסטי אם עדיין לא קיים וציין את השאר (3658.19 Pa לתמונות בדיקה).
    4. ציין רדיוס נקודה (m) בשורה 15 (1 × 10-6 מ' עבור תמונות בדיקה).
    5. ציין את קוטר הנקודות המרבי האפשרי (μm) בשורה 16 (2.5 מיקרומטר לתמונות בדיקה).
    6. ציון יחס פיקסלים (μm/pixel):
      1. בשורות 17-20, הכוללות כמה יחסי פיקסלים שונים בתמונה המבוססים על הגדרות הדמיה ששימשו בעבר, ציין (type % בתחילת השורה) את כל התמונות המנותחות מלבד יחס הפיקסלים. לחלופין, הוסף את יחס הפיקסלים שבו נעשה שימוש אם עדיין לא קיים וציין את השאר (0.1613 μm/pixel עבור תמונות בדיקה).
    7. בשורות 35 ו- 87, ציין את ספריית הקבצים היכן נמצאים קבצי עיבוד התמונה הדרושים.
      הערה: מתוך ערימת התמונות הפלואורסצנטיות, הקוד קובע את המיקום של כל נקודה פלואורסצנטית ועוקב אחר התנועה של כל נקודה בין כל תמונה בערימה20. המיקום הראשוני של הנקודות המודפסות במיקרו-קונטיקט ידוע משום שהן אינן מתעוותות כאשר הן מועברות כראוי להידרוג'ל32.
  3. המתן עד ששתי דמויות ותיבת דו-שיח אחת יופיעו ברגע שהתוכנית תמצא את הנקודות. השתמש באיור 1 כדי לוודא שהתוכנית מצאה את הנקודות הנכונות ולא מצאה נקודות רבות שבהן לא היו כאלה. השתמשו באיור 2 כדי לבחור את הרשת המלבנית שעוזרת לתוכנית לאתר ולחשב את כוחות המתיחה של התאים.
    הערה: איור 1 הוא תמונת השדה הבהיר של התא, כאשר הנקודות שנמצאו על-ידי התוכנה (שיהיו אדומות) מכוסות מעליו (ראו איור 3A). איור 2 הוא תמונה המציגה את אותן נקודות המוצגות באיור 1 , אך ללא תמונת השדה הבהיר ברקע.
    1. המתן עד שתיבת הדו-שיח תבקש ללחוץ על Enter לאחר בחירת נקודה - כאשר כל נקודה היא אחת מהנקודות האדומות שנמצאו על-ידי התוכנית - ובתוכו יש לחצן אחד גדול שכותרתו Enter.
    2. בחרו ארבע נקודות שונות באיור 2 כדי ליצור רשת מלבנית מסביב ולכלול את התא/אשכול בתבנית זו. בחר כל נקודה בזו אחר נקודה בלחיצה שמאלית על העכבר ואשר אותה על-ידי לחיצה על Enter בכפתור בתיבת הדו-שיח הנ"ל. תספור כמה נקודות נמצאות בין הנקודה הראשונה לשנייה, כמו גם הנקודה הראשונה והשלישית, מכיוון שהתוכנית תבקש ערכים אלה לאחר שכל הנקודות בארבע הפינות נבחרו. הזן ערכים אלה בחלון הפקודה (הקלד את מספר הנקודות ולחץ על לחצן Enter במקלדת כאשר תתבקש לעשות זאת).
  4. לאחר בחירת הרשת המלבנית, המתן עד שהסקריפט יחשב את כוחות המתיחה שהוא מוצא ברשת בהתבסס על מיקומי הנקודות הפלורסנטיות. שים לב שהסקריפט מוצא תחילה את וקטור התזוזה (u) של המרכז הגיאומטרי של כל נקודה ולאחר מכן מחשב את וקטור כוח המתיחה המתאים (F) באמצעות Eq (1):
    figure-protocol-21729(1)
    כאשר E הוא מודולוס יאנג של מצע PAA, a הוא הרדיוס של סמני הנקודות הפלואורסצנטיות, ו-ν הוא היחס של פואסון למצע PAA32. Eq (1) מניח שהמצע הוא חצי מרחב אלסטי אינסופי, שכוחות המתיחה מופעלים במרכז כל סמן נקודה עגול, ושהריווח בין סמני הנקודות גדול מספיק כדי שהתזוזות שלהם לא יתקשרו זו עם זו23.
    הערה: בניסויים המתוארים כאן, נעשה שימוש בסמני נקודות של רדיוס a = 1 μm ו- 6 μm מרכז למרכז ריווח. חצים של כוח מתיחה בתוך התא/צביר המצביעים פנימה לכיוון מרכז התא צריכים להיות נוכחים, בעוד שבאזור שמחוץ לתא/צביר לא אמורים להיות חצי מתיחה נוכחים (ראו איור 3C-E). חצי מתיחה המצביעים החוצה מתוך התא/אשכול או חצים גדולים רבים הנמצאים מחוץ לתא מעידים על רשת מלבנית שנבחרה בצורה גרועה.
  5. לאחר מציאת שדה המתיחה הנכון, בחר אזור עניין מתאים (ROI) המקיף את התא/אשכול, הכולל את כל חצי המתיחה בתוך התא באמצעות הסמן.
    1. כדי למשוך את ההחזר על ההשקעה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כמה פעמים שצריך כדי לצייר צורת מצולע עם כמה צדדים רצויים, התאם את הצורה או הזז את ההחזר על ההשקעה לאחר שצויר על-ידי לחיצה שמאלית על הפינות או הקצוות, בהתאמה. לאחר ציור ההחזר על ההשקעה, לחץ פעמיים באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לעבור לתמונה הבאה בערימה. חזור על פעולה זו עבור כל התמונות בערימת Brightfield.
      הערה: הקוד יחסוך נתוני כוח מתיחה ותזוזה עבור כל נקודת זמן באותה תיקיה כמו ערימות התמונות המקוריות, ולאחר מכן ניתן לנתח אותם עוד יותר.

תוצאות

הידרוג'לים של PAA עם המודולוס של יאנג של E = 3.6 kPa והיחס של פואסון של ν = 0.445 נעשו לשימוש על ידי שיטת מיקרו-פטרינג תת-קרקעית זו. ההידרוג'לים יוצרו בעובי של כ-100 מיקרומטר, מה שמאפשר להם להיות מצטלם עם מערך ההדמיה שבו נעשה שימוש כאן, תוך מניעת חדירת התאים לכיסוי הנוקשה שמתחת לג'ל, מה שיגרום ל?...

Discussion

שיטה משופרת לדפוס עקיף של הידרוג'לים של PAA מתוארת במאמר זה. גישה זו מתבססת על שיטות ששימשו בעבר 20,35,36,37,38,39,40,41,42. השינוי העיקר...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לד"ר פול ברבון מהמחלקה להנדסת מכונות באוניברסיטת בוסטון על דיונים מועילים וסיוע בניתוח נתונים. מחקר זה נתמך על ידי מענק NSF CMMI-1910401.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-aminopropyl)trimethoxysilaneSigma Aldrich#281778
1.5 mL Microcentrifuge tubeFisher Scientific#05-408-129
15 mL conical tubeFisher Scientific#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome PhotomaskAdvance Reproductions CorporationN/ACustom-designed mask
6 Well PlatesFisher Scientific#07-200-83
AcetoneFisher Scientific#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%Sigma Aldrich#A4058
AlexaFluor 488Thermo Fisher#A20000
Aminonium PersulfateFisher Scientific#BP179-25
BisacrylamideFisher Scientific#PR-V3141
EthanolGreenfield Global#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm roundFisher Scientifc#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm roundWarner#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 CameraHamamatsu#C10600-10B
Human PlasmaValley Biomedical#HP1051PUsed to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 NMillipore Sigma#1.09057
ImageJWayne Rasband#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish SetBioptechs#190310-35
Kim WipesFisher Scientific#06-666-11C
Mask AlingerKarl Suss#MA6
Matlab 2021Mathworks#R2021a
MetaMorph BasicMolecular Devices#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide esterSigma Aldrich#130672-5G
NucBlue Live Cell StainThermo Fisher#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted MicroscopeOlympus#IX81
PD-10 Desalting ColumnsGE Healthcare#52-1308-00
Photoresist Spinner HoodHeadway Research#PWM32
Plasma CleanerHarrick#PDC-001
Plasma EtcherTePla#M4L
Prior Lumen 200Pro Light SourcePrior Scientific#L200
Silicon Wafers, 100 mmUniversity Wafer#809
SU-8 2005Kayaku Advanced Materials Inc.#NC9463827
SU-8 DeveloperKayaku Advanced Materials Inc.#NC9901158
Sylgard 184 Silicone ElastomerEssex Brownell#DC-184-1.1
TetramethylethylenediamineFisher Scientific#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaneSigma Aldrich#448931
UAPON-40XW340 ObjectiveOlympus#N2709300
UV Flood ExposureNewport#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mmTed Pella, Inc.#19395-40

References

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
  4. Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
  5. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  6. Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
  7. Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
  8. Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , 11-22 (2011).
  9. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  10. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
  11. Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
  12. Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
  13. Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
  14. Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
  15. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
  16. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  17. Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
  18. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  19. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  21. Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
  22. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  23. Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), 041923 (2008).
  24. . Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249 Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007)
  25. Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
  26. Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
  27. Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
  28. Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
  29. Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
  30. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
  31. Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
  32. Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
  33. Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  34. Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
  35. Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
  36. Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
  37. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
  38. Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
  39. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
  40. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  41. Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
  42. Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
  43. Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
  44. Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  45. Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
  46. Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved