将人类牙齿中的类器官确立为机械研究和再生疗法的有力工具

摘要

我们提出了一种从人类牙齿开始开发上皮类器官培养物的方案。类器官具有强大的可膨胀性，可重现牙齿的上皮干细胞，包括其阿美巴分化能力。独特的类器官模型为研究人类牙齿（干细胞）生物学提供了一种有前途的工具，并为牙齿再生方法提供了前景。

摘要

牙齿在生活中不仅对食物咀嚼和言语至关重要，而且对心理健康也至关重要。关于人类牙齿发育和生物学的知识很少。特别是，人们对牙齿的上皮干细胞及其功能知之甚少。我们成功地开发了一种从人类牙齿组织（即从拔出的智齿中分离出来的牙齿毛囊）开始的新型类器官模型。类器官具有稳健和长期可扩展性，并在标记表达和功能活性方面概括所提出的人类牙齿上皮干细胞区室。特别是，类器官能够展开在变色过程中 在体内 发生的阿美母细胞分化过程。这种独特的类器官模型将提供一种强大的工具，不仅可以研究人类牙齿发育，还可以研究牙齿病理学，并可能为牙齿再生疗法铺平道路。用基于这种新的类器官模型的生物牙齿替换丢失的牙齿可能是当前合成材料标准植入的一种有吸引力的替代方案。

引言

牙齿在食物咀嚼，言语和心理健康（自我形象）中起着至关重要的作用。人牙由不同密度和硬度的高度矿化组织组成¹.牙釉质是牙冠的主要成分，是人体内矿化程度最高的组织。在牙釉质形成（amelogenesis）期间，当牙齿发育时，牙齿上皮干细胞（DESCs）分化成牙釉质形成细胞（ameloblasts）。一旦形成，由于在牙齿萌出开始时，阿米伯父细胞凋亡性丧失，珐琅质很少修复或更新¹。由创伤或细菌性疾病引起的受损牙釉质组织的修复目前使用合成材料完成;然而，这些都存在重要的缺点，例如微裂，下骨整合和锚固，有限的寿命以及缺乏功能齐全的修复²。因此，具有产生阿米母细胞能力和产生矿化组织潜力的人类DEC的稳健可靠的培养将是牙科再生领域向前迈出的重要一步。

关于人类DESC表型和生物学功能的知识稀缺^3，4，5。有趣的是，人类牙齿的DESC已被提出存在于Malassez的上皮细胞休息（ERM）中，该细胞簇存在于牙齿卵泡（DF）内，其周围是未脱出的牙齿，并且一旦牙齿萌出，它们仍然存在于根部周围的牙周韧带^中1。已经发现与牙髓共培养的ERM细胞分化成阿美母细胞样细胞并产生牙釉质样组织⁶。然而，由于缺乏可靠的研究模型⁷，对ERM细胞在牙釉质（再）生成中的特异性作用的深入研究受到限制。目前的ERM体外培养系统受到有限的寿命和标准使用的2D条件下表型快速丧失的阻碍^8，9，^10，11，12。因此，迫切需要一个易于处理的体外系统来忠实地扩展，研究和区分人类DESC。

在过去的十年中，一种 在体外 生长上皮干细胞的强大技术已成功应用于几种类型的（人类）上皮组织，以研究其生物学以及疾病^{13，14，15，16}。该技术使组织上皮干细胞能够自我发育成3D细胞结构（即类器官），当接种到细胞外基质（ECM）模拟支架（通常为Matrigel）中并在定义的培养基中培养，复制组织的干细胞位信号传导和/或胚胎发生。类器官发育所需的典型生长因子包括表皮生长因子（EGF）和无翼型MMTV整合位点（WNT）激活剂^14，15，16。所得类器官的特征在于模仿组织原始上皮干细胞的持久保真度，以及高可膨胀性，同时保持其表型和功能特性，从而克服了从诊所获得的通常有限的原代人体组织可用性。为了建立类器官，不需要在培养之前从异质组织（即包含其他细胞类型，如间充质细胞）中分离上皮干细胞，因为间充质细胞不附着或在ECM中茁壮成长，最终导致纯上皮类器官^{13，16，17，18，19}.这种有前途的多功能技术导致了来自各种人体上皮组织的歧管类器官模型的发展。然而，对于深入研究牙齿发育，再生和疾病有价值的人类牙齿衍生类器官尚未建立^20，21。我们最近成功地开发了这样一种新的类器官模型，从从青少年患者中提取的第三磨牙（智齿）的DF组织开始¹⁹。

在这里，我们描述了从成人人类牙齿（即从第三磨牙的DF）开发上皮类器官培养物的方案（图1A）。所得类器官表达ERM相关的干性标志物，同时具有长期可扩展性。有趣的是，与大多数其他类器官模型相反，通常需要的EGF对于健壮的类器官发育和生长是多余的。有趣的是，茎性类器官显示出阿美母细胞的分化特性，从而模仿 了体内发生的ERM / DESC特征和过程。这里描述的新的和独特的类器官模型允许探索DESC生物学，可塑性和分化能力，并为迈出牙齿再生方法的第一步打开了大门。

研究方案

此处描述的所有方法均已获得鲁汶伦理委员会研究（13/0104U）的批准。提取的第三磨牙（智齿）是在患者知情同意后获得的。

1. 准备工作

1. 在37°C的1.9%CO 2培养箱中预热48孔培养板_15-20 小时。
2. 液化一种基质胶等分试样（生长因子还原;无酚红;进一步称为基底膜基质;BMM）在步骤2.1之前在冰上（4°C）上至少2小时。
   注意:避免 BMM 的冻融循环。将BMM在冰上液化15-20小时，并在微量离心管中以1mL等分试样，并在-20°C下储存。
3. 将离心机冷却至4°C。
4. 制备培养基并通过0.22μm过滤器过滤溶液。以下体积基于通常同时提取的所有四个第三磨牙的DF的集合。
   1. 准备20mLDF收集培养基（表1）:含有10%胎牛血清（FBS），0.5%两性霉素B和1%青霉素 - 链霉素的最小必需培养基（αMEM）。将4 mL DF收集培养基转移到15 mL管中，并将管转移到冰上。
      注意:每位患者一个15 mL的试管足以收集样本（即，对于四个第三磨牙）。
   2. 制作20毫升牙齿类器官培养基（进一步称为TOM; 表 2）使用无血清定义培养基（SFDM; 表 3）。将TOM储存在4°C下最多2周。
   3. 准备8mL解离培养基（表4），即含有胶原酶VI（3mg / mL）和dispase II（4mg / mL）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。使用前在37°C水浴中预热解离培养基至少10分钟，并将其转移到两个15mL管中（每管4mL）以解离四个DF组织。
   4. 准备一个洗涤板（12孔），其中包含:三个具有70%EtOH的孔，三个具有PBS的孔和三个具有DF收集培养基的孔。
   5. 每个样品制作15 mL培养基A（即，每个患者每两个DF产生5 mL; 表 5）。
      注意:以下步骤应在无菌条件下进行。

2. 牙囊解离

1. 一旦将具有相关DF的第三磨牙收集在收集培养基中（在冰上），将管的内容物转移到培养皿中。
2. 用镊子握住牙齿，并使用手术刀片小心地隔离DF。
   注意:此步骤需要练习;小心刀片。
3. 为了洗净DFs上剩余的血液，将DF组织短暂地放在70%EtOH（洗涤板）的第一个孔中20秒，然后转移到下一个EtOH孔20秒，然后进一步转移到第三个EtOH孔（总共70%EtOH中最大1分钟;较长的孵育时间将导致细胞活力降低）。
4. 接下来，继续在三个PBS孔中冲洗（总共最多2分钟）。
5. 在剩余的三个DF收集培养孔中冲洗DFs（总共最多20分钟）。
6. 将冲洗过的DFs转移到新的培养皿中。
7. 切一小块DF（约5mm²）用于多聚甲醛（PFA）固定（见第7节），并将其储存在冰上（最多6小时）在含有500μLDF收集培养基的微量离心管中，直到PFA固定。
8. 将其余的DF切成小块（〜1 mm²）。
   注意:建议立即处理新鲜分离的DF组织，以获得最佳的类器官形成和生长效率，而不是从冷冻保存的组织开始，这会导致效率降低。然而，可以在该步骤中冷冻保存原代DF组织（参见第5节的冷冻保存培养基和方案）。
9. 将切碎的DFs转移到含有4mL预热解离培养基的15mL管中，并在37°C水浴中孵育2小时。
   注意:每4 mL预热解离培养基（一管）添加两个DF，以确保最佳解离。
10. 每15分钟，使用玻璃巴斯德移液管上下移液DF解离培养基混合物以加速组织分解。当不再观察到DF片时（通常在1小时后），使用狭窄的火抛光巴斯德移液管进行DF解离。
    注意:为了获得最佳的DF解离，请切换到巴斯德移液管，通过火抛光在不迟于1小时的DF分离中缩小。
    1. 同时，制备10mL含有50μL脱氧核酸酶（0.2mg / mL; 表 5）。
11. 向具有解离DF的每个管中加入5mL培养基A（含有DNA酶），并在室温（RT）下孵育1分钟。
12. 通过40μm细胞过滤器过滤细胞悬浮液（含有单细胞和小细胞团块）以除去剩余的大碎片和（大部分）纤维组织。
    1. 在此步骤中，将几根管与一名患者的解离DF组合。
13. 用1mL培养基A冲洗过滤器，在4°C下以200× g 离心过滤的细胞悬浮液10分钟。
14. 除去上清液，将沉淀重悬于1mL SFDM中（表3），并将细胞悬浮液转移到1.5mL微量离心管中。
15. 使用自动细胞计数器计算细胞浓度。忽略残留的细胞团块。
16. 在4°C下以200× g 离心5分钟。

3.建立牙齿类器官培养物（图1A 和 图2A）

1. 根据获得的细胞数，计算可以接种的孔数。一个20μL液滴应包含20，000个细胞。最终的混合物由细胞悬浮液和BMM组成，比例为30:70。
2. 除去适量的上清液，重悬于冰冷的BMM中，得到70∶30比例的BMM:细胞悬浮液进行电镀。例如，当获得200，000个细胞时，平板10滴20μL。因此，除去上清液直至留下60μL细胞悬浮液，加入140μL冰冷的BMM并重悬。
   1. 缓慢重悬以避免形成气泡。一旦重悬于BMM中，将微量离心管保持在冰上。
      注意:将微量离心管保持在冰上对于避免BMM凝固至关重要。
3. 移液到预热的48孔培养板孔中心的20μL BMM液滴。
4. 将板倒置，将其放入1.9%CO₂ 培养箱（根据SFDM缓冲液的%CO₂ ）中，并使其在37°C下固化至少20分钟。
5. 向TOM中加入ROCK抑制剂（RI;10μM）和两性霉素B（0.1%），并在37°C水浴中预热培养基。
   注意:两性霉素B对光敏感。
6. 从培养箱中取出48孔板，直立放置并将250μL制备的预热培养基与BMM液滴/细胞一起加入每个孔中，并将板返回到1.9%CO₂ 培养箱中。
7. 要刷新培养基（最好每2-3天一次），以45°角倾斜48孔板，轻轻取出先前的培养基，同时避免接触BMM液滴，并加入250μL新的预热TOM培养基。
   注意:建议每周至少刷新三次，以避免关键营养素和生长因子的消耗。RI只需要在初始播种和每次传代的第一天（见第4节）添加到TOM中，以防止细胞因无花果而死亡并增强类器官的生长。两性霉素B仅在通过0（P0）期间添加到培养基中以阻断可能的真菌污染。

4.牙齿类器官培养物的扩增和传代（图1B 和 图2B）

1. 在培养10至14天之间通过类器官。
   注意:避免长时间培养，因为长时间培养可能会限制类器官的再生和可传代性。只有在初始发育（P0）时，根据其生长速率，类器官可以培养长达20天（直到达到最大直径±200μm）。
2. 用需要通过的类器官从孔中取出培养基。在一个培养条件下，汇集多达四个汇合孔（见 图2C）。
3. 为了收集类器官，每孔直接在BMM液滴上加入400μL冰冷的SFDM，并反复上下移液培养基，直到整个BMM液滴被移出。
   1. 如果孔被池化，将400μL从第一个孔转移到下一个孔（依此类推），以清除需要池化的所有孔的含有类器官的BMM液滴。
4. 将脱落的BMM-类器官组件转移到1.5mL微量离心管中，并再次重复步骤4.3，直到从孔中收集所有类器官结构。
5. 在4°C下以200× g 离心5分钟。
6. 在37°C水浴中预热等分试样的TrypLE Express（在5μM处补充RI）。每个类器官的微量离心管，需要400μLTrypLE Express的体积。
7. 离心后，除去上清液并将沉淀重悬于400μLTrypLE中。将悬浮液在37°C水浴中孵育12分钟。
8. 加入400μL冰冷的SFDM以灭活酶，并在4°C下以200× g 离心5分钟。 取出上清液。
9. 用冰冷的SFDM预涂上尖端（体积见下文），然后重悬于类器官颗粒。
   1. 为避免类器官损失，请尽可能重复使用相同的（预涂覆）尖端，而不会危及无菌。
      注意:重悬沉淀所需的SFDM体积取决于获得的类器官结构的数量和当前的通过数量。
   2. 根据经验，对于传代，P0至P2-3（通常仍在生长少量的类器官）使用200μL SFDM的体积。从传代中，P3-4或更高（通常产生大量类器官）使用体积为700μL的SFDM。
      注意:这两个程序分别称为"低通道"和"高通道"方法（见步骤4.10和4.11）。正确应用不同的方法对于类器官的有效传代至关重要。使用高通道方法，类器官更容易丢失，不应应用于少量的类器官（即，在P0至P2-3处）。然而，需要更高的通道方法来有效地解离大量类器官。
10. 低通过方法:将沉淀重悬于200μL冰冷的SFDM中。将完全清空的移液器尖端推向微量离心管的底部，以减小其直径。检查直径是否足够小（抽吸速度较慢，流量偏斜但不堵塞）。上下移液5分钟，以机械方式破坏类器官。
11. 更高的通过方法:将沉淀重悬于700μL冰冷的SFDM中，并带有P1000尖端。在此 P1000 吸头顶部添加一个 P200 吸头（无过滤器），并用冰冷的 SFDM 进行预涂。通过调整移液器的体积设置来防止气泡形成，以便至少90%的培养基体积（使用类器官）。上下移液5分钟，以机械方式破坏类器官。
12. 在光学显微镜下（在4倍放大倍率下）检查是否主要获得具有（仅）几个未分散结构的单细胞。
13. 向微量离心管中加入500μL冰冷的SFDM，并通过移液将解离的细胞混合物与新鲜的SFDM轻轻混合。
14. 通过将微量离心管垂直放置在冰上，让大型未分散的结构沉淀10分钟。
    注意:有必要去除未分散的结构，因为它们会对类器官的可通行性产生负面影响。对于类器官起始（P0），不需要该沉降步骤。
15. 收集含有单细胞和小细胞簇的上清液（约500-1，000μL，取决于传代方法）;转移到新的微量离心管中，并在4°C下以190× g 离心10分钟。
16. 使用自动细胞计数器计算细胞浓度。忽略残留的细胞团块。
17. 计算可以接种的孔数，并如上所述计算适当的细胞悬浮液/ BMM比率（第3节）。
18. 向细胞沉淀中加入70%的BMM，并将微量离心管保持在冰上。
    注意:将微量离心管保持在冰上以避免BMM凝固至关重要。
19. 继续步骤3.3直到3.7，并在培养的第10天和第14天之间再次通过。

5. 牙齿类器官的冷冻保存

1. 如上所述收集和解离类器官以进行传代（步骤4）。在4°C下以200× g 离心细胞悬浮液5分钟。
2. 弃去上清液并将沉淀重悬于1mL含有SFDM（70%），FBS（20%）和DMSO（10%）的冷冻保存培养基中。
3. 将悬浮液转移到冷冻室中并将其放在冰上。将冷冻管置于冷冻箱中并转移到-80°C（至少4小时）。
4. 在1个月内，将冷冻样品转移到液氮中进行长期（>12个月）储存。

6. 冷冻保存的牙齿类器官解冻

1. 在开始解冻程序之前，将每个冷冻管一个15 mL管放在含有10 mL SFDM和20%FBS的冰上。
2. 从液氮中取出冷冻管并将其放在冰上。
   注意:尽可能快地执行以下步骤，避免解冻时间过长（>5分钟）以及步骤之间的间隔过长（>5分钟），因为这种延长会降低细胞存活率。
3. 将冷冻管置于温水浴（37°C）中直至解冻（约1-2分钟）。
4. 立即将冷冻管的内容物转移到冰冷的15mL管中，并在4°C下以200× g 离心5分钟。
5. 除去9mL上清液，并在4°C下以200× g 离心剩余的1mL5分钟。 除去上清液并用1mL冰冷的SFDM洗涤沉淀。
6. 将细胞悬浮液转移到1.5 mL微量离心管中，并使用自动细胞计数器对细胞进行计数。
7. 计算可以接种的孔数，并如上所述计算适当的细胞悬浮液/ BMM比率（第3节）。
8. 在4°C下以200× g 离心5分钟。 以70:30的比例重悬颗粒BMM:TOM并保持在冰上。
9. 继续步骤3.3至3.7，并在培养的第10天和第14天之间通过。

7. 牙齿类器官的固定和石蜡包埋

注意:该过程（包括第8节和第9节）也可以应用于原代DF组织。

1. 在PFA中固定牙齿类器官
   1. 从每个孔中取出培养基，如步骤4.2所示。
   2. 通过移位BMM液滴来收集类器官（步骤4.3）。将BMM-类器官混合物转移到1.5 mL微量离心管中。
   3. 在4°C下以200× g 离心5分钟。
   4. 除去上清液并加入500μL4%PFA，并在室温下孵育至少30分钟（最大1小时），在轨道振荡器上轻轻混合。
      注意:使用 PFA 时，请使用化学罩。
   5. 在4°C下以200× g 离心5分钟。 除去上清液，用PBS冲洗类器官沉淀，在室温下轻轻摇动10分钟。
   6. 将类器官沉淀（步骤7.1.5）另外洗涤两次。在4°C下以200× g 旋转固定的类器官5分钟。
   7. 将沉淀重悬于500μL70%EtOH（去离子水中）中。将类器官在4°C的70%EtOH中储存长达1个月。
2. 琼脂糖和石蜡包埋牙齿类器官
   注意:为了有效地将类器官包埋在石蜡中，需要一个额外的步骤来包埋琼脂糖。
   1. 在4°C下以200× g 在70%EtOH中离心PFA固定的类器官5分钟。 取出上清液。
   2. 在玻璃瓶中制备30 mL PBS中的2%琼脂糖溶液。在微波炉中加热琼脂糖 - PBS混合物，直到观察到凝胶状结构（在600 W下约2.5分钟）。
   3. 同时，将30 mL PBS加入另一个玻璃瓶中，并在微波炉中加热（在600 W下约2.5分钟）。让琼脂糖溶液冷却1分钟。
   4. 切割P200尖端的末端，以便精确地使用琼脂糖溶液并避免气泡。
   5. 在温暖的PBS中预热P200吸头，方法是上下移液几次。
   6. 向类器官沉淀中加入150μL预热琼脂糖溶液，并轻轻移液至类器官琼脂糖混合物（重悬最小），同时避免气泡。
      注意:最小的重悬将允许在切片机切片时更好地定位琼脂糖凝胶中的类器官，因为类器官彼此更靠近。
   7. 立即将类器官 - 琼脂糖混合物转移到相同的微量离心管盖上，水平放置管，让琼脂糖凝固（在室温下约20分钟）。同时，为盒式磁带贴上标签。
   8. 凝固后，使用镊子从微量离心机盖上取出琼脂糖凝胶并将其转移到标记的盒中。
   9. 将含琼脂糖的盒转移到含有50%EtOH的烧杯中去离子水中。用薄膜覆盖烧杯，以避免EtOH蒸发。
      注:烧杯的体积取决于暗盒的数量。
   10. 在组织处理器中处理样品过夜。
       注意:由于石蜡在室温下凝固，必须快速执行以下步骤。
   11. 在包埋工作站中预热加热块15分钟。
   12. 取出盒中封闭的含类器官琼脂糖凝胶，并将其置于预热加热块中。从暗盒中取出盖子，放在一边供以后使用。
   13. 用石蜡填充剩余的加热块。
       注意:用镊子检查含类器官琼脂糖凝胶是否仍位于加热块的底部。由于其重量轻，它可能会开始漂浮，导致样品损失。
   14. 将盒式磁带盖放在加热块的顶部。让它在冷板上固化30分钟。取出加热块并将石蜡块储存在4°C。

8.切片机切片和牙齿类器官染色（图2B 和 图3A-C）

1. 含类器官石蜡阻滞的切片机切片
   1. 使用切片机在石蜡块中切片5μm切片的牙齿类器官。
   2. 将石蜡片放在显微镜载玻片的顶部。将显微镜载玻片放在37°C的温板上，并使用巴斯德移液管用去离子水覆盖。
   3. 让显微镜载玻片干燥过夜。
2. 牙齿类器官部分的染色
   1. 在58°C下在烤箱中脱蜡类器官切片（在显微镜载玻片上）1小时。
   2. 按以下顺序在化学罩内以递减的EtOH系列重新水化类器官切片（在显微镜载玻片上）:
      二甲苯 2x，每次 3 分钟
      100%乙氧乙烷醇，每次2次，每次3分钟
      95%乙氧乙烷，每次2次，每次3分钟
      90%乙氧乙烷2x，每次3分钟
      70%乙氧烷3x，每次3分钟
      注意:使用二甲苯时使用化学罩。
   3. 在室温下用自来水冲洗显微镜载玻片5分钟。然后，在室温下在PBS中冲洗5分钟。
   4. 通过将类器官切片（在显微镜载玻片上）置于预热的柠檬酸盐缓冲液（10mM柠檬酸在pH 6的去离子水中;在塑料容器中;在95°C水浴中预热10分钟）中在95°C水浴中预热30分钟来进行抗原检索。
   5. 让显微镜载玻片在室温下冷却20分钟，在室温下在PBS中冲洗显微镜载玻片5分钟，然后在含有0.1%Triton-X（PBT）的PBS中在室温下冲洗5分钟。
   6. 使用记号笔在每张幻灯片的边界处创建疏水屏障。
   7. 在封闭缓冲液（含有1.5mg / mL甘氨酸，溶解在PBT中的2mg / mL白蛋白牛血清（BSA））加10%驴血清中放疗至少1小时。
      注意:通常，每个显微镜载玻片需要300μL封闭缓冲液加10%驴血清。
   8. 将显微镜载玻片置于潮湿的室内。使用所有载玻片都适合的气密盒子，用水打湿一些纸巾，放在盒子的底部。这将防止载玻片在随后的染色步骤中变干。
   9. 除去封闭缓冲液，加入在封闭缓冲液中制备的一抗（表6）加1%驴血清，并将覆盖有抗体溶液的载玻片在4°C的潮湿室中孵育过夜。 如果需要，请重做标记笔边框。
   10. 在室温下在PBT中洗涤显微镜载玻片三次，在轨道振荡器（75-150rpm）上轻轻混合10分钟。
   11. 加入二抗（表6），在封闭缓冲液加1%驴血清中制备，并在室温室中孵育1小时。
   12. 取出封闭缓冲液，在室温下在PBT中洗涤显微镜载玻片三次，在轨道振荡器上轻轻混合10分钟。
   13. 在玻璃盖玻片上添加带有DAPI（1至3滴）的防褪色安装介质，并将其安装在类器官部分的顶部（在显微镜载玻片上）。继续进行成像;在4°C下储存载玻片最多1周。

9. 牙齿类器官的RNA提取和RT-qPCR（图2B 和 图3D）

1. 牙齿类器官的RNA提取
   1. 从每个孔中取出培养基（步骤4.2）。
   2. 通过移位BMM液滴（步骤4.3）收集类器官，将BMM - 类器官混合物转移到1.5mL微量离心管中，并在4°C下以200× g 离心5分钟。
   3. 除去上清液，重悬于350μL溶解在裂解缓冲液中的1%β巯基乙醇中（材料表），并置于冰上。
      注意:在化学罩中使用β巯基乙醇执行所有步骤。
      注意:样品可以在-80°C下在此步骤中储存长达1个月。 在继续步骤9.1.4之前，在冰上解冻样品。
   4. 涡旋样品，直到不再观察到类器官结构。
   5. 根据制造商的说明，使用RNA提取试剂盒（材料表）进行RNA提取。
2. 牙齿类器官的RT-qPCR（表7）
   1. 根据制造商的说明，使用逆转录试剂盒（材料表）反向转录（RT）RNA¹⁹。
   2. 使用实时荧光定量 PCR 系统（材料表）使用基于 SYBR Green 的定量 PCR （qPCR）¹⁹ 分析所得 cDNA 样品。

结果

牙齿类器官发育
我们提供了一个详细的方案，用于从智齿拔除后获得的人类DF组织中建立类器官培养物（图1A）。分离的DF被酶促和机械解离。获得的细胞在BMM中培养，这些培养基根据经验被定义为最佳的类器官发育和生长（牙齿类器官培养基;汤姆）¹⁹.

类器官通常在DF细胞接种后2周内发育（P0; 图 2A...

讨论

该协议描述了从人类牙齿开始的类器官的高效和可重复的产生。据我们所知，这是从人类牙齿组织开始建立当前概念（上皮）类器官的第一种方法。类器官可长期扩张，并显示牙齿上皮干性表型，与先前在DF⁷的ERM室中报道的DSC重复。此外，类器官复制了功能性DESC / ERM特征，包括展开阿美巴分化过程^7，25，26。...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge tube	Eppendorf	30120.086
15 mL Centrifuge tube	Corning	430052
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-6250
48-well flat bottom plates	Corning	3548
50 mL Centrifuge tube	Corning	430290
A83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Agarose	Lonza	50004
Albumin Bovine (cell culture grade)	Serva	47330.03
AMELX antibody	Santa Cruz	sc-365284
Amphotericin B	Gibco	15200018
B27 (without vitamin A)	Gibco	12587-010
Cassette	VWR	7202191
Catalase from bovine liver	Sigma-Aldrich	C100
CD44 antibody	Abcam	ab34485
Cell strainer, 40 µm	Falcon	352340
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Citric acid	Sigma-Aldrich	C0759
CK14 antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-11599
Collagenase IV	Gibco	17104-019
Cover glass	VWR	6310146
Cryobox	Thermo Scientific	5100-0001
Cryovial	Thermo Fisher Scientific	375353
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMEM 1:1 F12 without Fe	Invitrogen	074-90715A
DMEM powder high glucose	Gibco	52100039
Dnase	Sigma-Aldrich	D5025-15KU
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663 - 10ML
Embedding workstation, 220 to 240 Vac	Thermo Fisher Scientific	12587976
Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH)	Fisher Chemical	E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
FGF10	Peprotech	100-26
FGF2 (= basic FGF)	R&D Systems	234-FSE-025
FGF8	Peprotech	AF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit	Sigma-Aldrich	RTN350-1KT	Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer
Glass Pasteur pipette	Niko Mechanisms	170-40050
Glycine	VWR	101194M
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
IGF-1	PeproTech	100-11
InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI)	Sigma-Aldrich	688001
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I6634
ITGA6 antibody	Sigma-Aldrich	HPA012696
L-Glutamine	Gibco	25030024
Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free)	Corning	15505739
Microscope slide	Thermo Fisher Scientific	J1800AMNZ
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm	Millipore	SLGV033R
Minimum essential medium eagle (αMEM)	Sigma-Aldrich	M4526
mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-31570
N2	Gibco	17502-048
N-acetyl L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	120-10C
P63 antibody	Abcam	ab124762
Pap Pen	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	Marking pen
Paraformaldehyde (PFA), 16%	Merck	8.18715
Penicillin G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032
Penicillin-streptomycin (Pen/Strep)	Gibco	15140-122
Petri dish	Corning	353002
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-015
Pipette (P20, P200, P1000)	Eppendorf or others	2231300006
Plastic transfer pipette (3.5 mL)	Sarstedt	86.1171.001
Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A21206
RSPO1	PeproTech	120-38
SB202190 (p38i)	Biotechne (Tocris)	1264
Scalpel (surgical blade)	Swann-Morton	207
SHH	R&D Systems	464-SH-200
Silicone molds (Heating block)	VWR	720-1918
Sodium Chloride (NaCl)	BDH	102415K
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)	Merck	106329
Sodium-pyruvate (C3H3NaO3)	Sigma-Aldrich	P-5280
SOX2 antibody	Abcam	ab92494
StepOnePlus	Thermo Fisher Scientific		Real-Time PCR System
Stericup-GP, 0.22 µm	Millipore	SCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm	Millipore	SCGP00525
Sterile 1000 μL pipette tips with filter	Greiner	740288
Sterile 20 μL pipette tips with filter	Greiner	774288
Sterile 200 μL pipette tips with and without filter	Greiner	739288
Sterile H2O	Fresenius	B230531
Streptomycin sulfate salt	Sigma-Aldrich	S6501
Superscript III first-strand synthesis supermix	Invitrogen	11752-050	Reverse transcription kit
Tissue processor	Thermo Scientific	12505356
Transferrin	Serva	36760.01
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
TrypLE express	Gibco	12605-010
Vectashield mounting medium+DAPI	Labconsult NV	H-1200	Antifade mounting medium with DAPI
WNT3a	Biotechne (Tocris)	5036-WN-500
Xylenes, 99%, for biochemistry and histology	VWR	2,89,75,325