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Resumen

Presentamos un protocolo para desarrollar cultivos de organoides epiteliales a partir de dientes humanos. Los organoides son robustamente expandibles y recapitulan las células madre epiteliales del diente, incluida su capacidad de diferenciación de ameloblastos. El modelo organoide único proporciona una herramienta prometedora para estudiar la biología dental humana (células madre) con perspectivas para enfoques regenerativos de dientes.

Resumen

Los dientes son de importancia clave en la vida no solo para la masticación de los alimentos y el habla, sino también para el bienestar psicológico. El conocimiento sobre el desarrollo de los dientes humanos y la biología es escaso. En particular, no se sabe mucho sobre las células madre epiteliales del diente y su función. Logramos desarrollar un nuevo modelo organoide a partir de tejido dental humano (es decir, folículo dental, aislado de muelas del juicio extraídas). Los organoides son expandibles de forma robusta y a largo plazo y recapitulan el compartimento de células madre epiteliales del diente humano propuesto en términos de expresión de marcadores, así como de actividad funcional. En particular, los organoides son capaces de desplegar un proceso de diferenciación de ameloblastos como ocurre in vivo durante la amelogénesis. Este modelo organoide único proporcionará una herramienta poderosa para estudiar no solo el desarrollo de los dientes humanos, sino también la patología dental, y puede allanar el camino hacia la terapia regenerativa dental. Reemplazar los dientes perdidos con un diente biológico basado en este nuevo modelo de organoides podría ser una alternativa atractiva a la implantación estándar actual de materiales sintéticos.

Introducción

Los dientes tienen funciones esenciales en la masticación de los alimentos, el habla y el bienestar psicológico (autoimagen). El diente humano consiste en tejidos altamente mineralizados de densidad y dureza variables1. El esmalte dental, el componente principal de la corona dental, es el tejido mineralizado más alto del cuerpo humano. Durante la formación del esmalte (amelogénesis), cuando se desarrollan los dientes, las células madre epiteliales dentales (DESC) se diferencian en células formadoras de esmalte (ameloblastos). Una vez formado, el esmalte rara vez se repara o renueva debido a la pérdida apoptótica de los ameloblastos al inicio de la erupción dental1. La restauración del tejido del esmalte dañado, causado por un traumatismo o enfermedad bacteriana, se realiza actualmente utilizando materiales sintéticos; sin embargo, estos están preocupados por deficiencias importantes como la microcongestión, la osteointegración y el anclaje inferiores, la vida útil finita y la falta de reparación completamente funcional2. Por lo tanto, un cultivo robusto y confiable de DESC humanos con la capacidad de generar ameloblastos y el potencial de producir tejido mineralizado sería un gran paso adelante en el campo de la regeneración dental.

El conocimiento sobre el fenotipo DELSC humano y la función biológica son escasos 3,4,5. Curiosamente, se ha propuesto que los DESC de los dientes humanos existen en los restos de células epiteliales de Malassez (ERM), grupos celulares presentes dentro del folículo dental (DF), que rodea los dientes no erupcionados y permanece presente en el ligamento periodontal alrededor de la raíz una vez que el diente entra en erupción1. Se ha encontrado que las células ERM cocultivadas con pulpa dental se diferencian en células similares a los ameloblastos y generan tejido similar al esmalte6. Sin embargo, los estudios profundos sobre el papel específico de las células ERM en la (re)generación de esmalte han sido limitados debido a la falta de modelos de estudio confiables7. Los sistemas actuales de cultivo in vitro ERM se ven obstaculizados por la vida útil limitada y la rápida pérdida de fenotipo en las condiciones 2D utilizadas estándarmente 8,9,10,11,12. Por lo tanto, se necesita un sistema in vitro manejable para expandir, estudiar y diferenciar fielmente los DESC humanos.

Durante la última década, una poderosa técnica para cultivar células madre epiteliales in vitro se ha aplicado con éxito a varios tipos de tejidos epiteliales (humanos) para estudiar su biología, así como la enfermedad 13,14,15,16. Esta tecnología permite que las células madre epiteliales tisulares se desarrollen automáticamente en construcciones de células 3D (es decir, organoides) cuando se siembran en un andamio que imita la matriz extracelular (ECM) (típicamente, Matrigel) y se cultivan en un medio definido que replica la señalización del nicho de células madre del tejido y / o la embriogénesis. Los factores de crecimiento típicos necesarios para el desarrollo de organoides incluyen el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y los activadores del sitio de integración MMTV (WNT) de tipo sin alas 14,15,16. Los organoides resultantes se caracterizan por una fidelidad duradera en la imitación de las células madre epiteliales originales del tejido, así como una alta capacidad de expansión al tiempo que conservan su fenotipo y propiedades funcionales, superando así la disponibilidad de tejido humano primario a menudo limitada adquirida en la clínica. Para establecer organoides, no se requiere el aislamiento de las células madre epiteliales del tejido heterogéneo (es decir, que comprende otros tipos de células, como las células mesenquimales) antes del cultivo, ya que las células mesenquimales no se adhieren o prosperan en la ECM, lo que eventualmente resulta en organoides puramente epiteliales 13,16,17,18,19 . Esta tecnología prometedora y versátil ha llevado al desarrollo de múltiples modelos organoides a partir de diversos tejidos epiteliales humanos. Sin embargo, los organoides derivados de dientes humanos, valiosos para el estudio profundo del desarrollo, la regeneración y la enfermedad de los dientes, aún no se han establecido20,21. Recientemente logramos desarrollar un nuevo modelo organoide a partir de tejido DF a partir de terceros molares (muelas del juicio) extraídos de pacientes adolescentes19.

Aquí, describimos el protocolo para desarrollar cultivos de organoides epiteliales a partir del diente humano adulto (es decir, a partir del DF de terceros molares) (Figura 1A). Los organoides resultantes expresan marcadores de tallo asociados a ERM mientras que son expandibles a largo plazo. Curiosamente, a diferencia de la mayoría de los otros modelos de organoides, el EGF típicamente necesario es redundante para el desarrollo y crecimiento de organoides robustos. Curiosamente, los organoides del tallo muestran propiedades de diferenciación de ameloblastos, imitando así las características y procesos de ERM / DESC que ocurren in vivo. El nuevo y único modelo organoide descrito aquí permite explorar la biología, la plasticidad y la capacidad de diferenciación de DESC y abre la puerta para dar los primeros pasos hacia enfoques regenerativos de los dientes.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Ética de Investigación UZ/KU Leuven (13/0104U). Los terceros molares extraídos (muelas del juicio) se obtuvieron después del consentimiento informado de los pacientes.

1. Preparativos

  1. Precalentar una placa de cultivo de 48 pocillos durante 15-20 h en una incubadora de CO2 al 1,9% a 37 °C.
  2. Licuar una alícuota de Matrigel (factor de crecimiento reducido; libre de rojo de fenol; también conocido como matriz de membrana basal; BMM) sobre hielo (4 °C) durante un mínimo de 2 h antes del paso 2.1.
    NOTA: Evite los ciclos de congelación/descongelación del BMM. Licuar el BMM durante 15-20 h sobre hielo y alícuota a 1 ml en tubos de microcentrífuga y almacenar a -20 °C.
  3. Enfríe la centrífuga a 4 °C.
  4. Prepare el medio y filtre la solución a través de un filtro de 0,22 μm. Los siguientes volúmenes se basan en la colección de los TF de los cuatro terceros molares típicamente extraídos simultáneamente.
    1. Preparar 20 mL de medio de recolección de DF (Tabla 1): águila mediana esencial mínima (αMEM) que contenga 10% de suero fetal bovino (FBS), 0,5% de anfotericina B y 1% de penicilina-estreptomicina. Transfiera 4 ml de medio de recolección de DF a un tubo de 15 ml y transfiera los tubos en hielo.
      NOTA: Un tubo de 15 ml es suficiente por paciente para la recolección de muestras (es decir, para cuatro terceros molares).
    2. Hacer 20 ml de medio organoide dental (también conocido como TOM; Tabla 2) uso de medio definido sin suero (SFDM; Tabla 3). Conservar TOM a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
    3. Preparar 8 ml de medio de disociación (Tabla 4), es decir, solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga colagenasa VI (3 mg/ml) y dispasa II (4 mg/ml). Precalentar el medio de disociación en un baño de agua de 37 °C durante al menos 10 min antes de su uso y transferirlo a dos tubos de 15 ml (4 ml por tubo) para disociar cuatro tejidos de DF.
    4. Prepare una placa de lavado (12 pocillos) que contenga: tres pozos con 70% de EtOH, tres pozos con PBS y tres pozos con medio de recolección de DF.
    5. Hacer 15 ml de medio A por muestra (es decir, 5 ml por dos TF por paciente; Tabla 5).
      NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en condiciones estériles.

2. Disociación del folículo dental

  1. Una vez que los terceros molares con TF asociados se recogen en el medio de recolección (en hielo), transfiera el contenido de los tubos a una placa de Petri.
  2. Sostenga el diente con una pinza y aísle cuidadosamente el DF con una cuchilla quirúrgica.
    NOTA: Este paso requiere práctica; ten cuidado con la cuchilla.
  3. Para lavar la sangre restante de los DF, coloque los tejidos de DF brevemente en el primer pocillo de EtOH (placa de lavado) al 70% durante 20 s, y luego transfiéralos al siguiente pozo de EtOH durante 20 s, y más allá del tercer pozo de EtOH (máximo 1 min en 70% de EtOH en total; un tiempo de incubación más largo dará como resultado una viabilidad celular reducida).
  4. A continuación, continúe enjuagando en los tres pozos de PBS (máximo 2 minutos en total).
  5. Enjuague los SF en los tres pozos medios de recolección de DF restantes (hasta un máximo de 20 minutos en total).
  6. Transfiera los TF enjuagados a una nueva placa de Petri.
  7. Cortar un trozo pequeño de uno de los TF (~5 mm2) para la fijación de paraformaldehído (PFA) (ver sección 7) y almacenarlo en hielo (durante un máximo de 6 h) en un tubo de microcentrífuga que contenga 500 μL de medio de recolección de DF hasta la fijación de PFA.
  8. Picar el resto de los DFs en trozos pequeños (~1 mm2).
    NOTA: Se recomienda procesar inmediatamente los tejidos DF recién aislados para la formación óptima de organoides y la eficiencia del crecimiento, en lugar de comenzar a partir de tejido criopreservado, lo que resulta en una menor eficiencia. Sin embargo, es posible criopreservar tejido primario de DF en este paso (ver medio de criopreservación y protocolo en la sección 5).
  9. Transfiera los TF picados a un tubo de 15 ml que contenga 4 ml de medio de disociación precalentado e incube en un baño de agua a 37 °C durante 2 h.
    NOTA: Agregue dos DF por medio de disociación precalentado de 4 ml (un tubo) para asegurar una disociación óptima.
  10. Cada 15 minutos, pipetee la mezcla del medio de disociación DF hacia arriba y hacia abajo utilizando una pipeta Pasteur de vidrio para acelerar la desintegración del tejido. Cuando las piezas de DF ya no se observen (generalmente después de 1 h), proceda con la disociación de DF utilizando una pipeta Pasteur pulida al fuego estrechada.
    NOTA: Para una disociación óptima de DF, cambie a una pipeta Pasteur estrechada por pulido al fuego a más tardar 1 h de aislamiento de DF.
    1. Mientras tanto, preparar 10 ml de medio A que contenga 50 μL de DNasa (0,2 mg/ml; Tabla 5).
  11. Añadir 5 ml de medio A (que contenga la DNasa) a cada tubo con DF disociado e incubar durante 1 min a temperatura ambiente (RT).
  12. Filtre la suspensión celular (que contiene células individuales y grupos de células pequeñas) a través de un colador de células de 40 μm para eliminar los fragmentos grandes restantes y (la mayoría de) el tejido fibroso.
    1. Combine los varios tubos con DF disociada de un paciente en este paso.
  13. Enjuague el filtro con 1 ml de A medio. Centrífique la suspensión de la celda filtrada a 200 x g durante 10 min a 4 °C.
  14. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 1 ml de SFDM (Tabla 3) y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  15. Calcule la concentración de células utilizando un contador de células automatizado. Descuide los grupos celulares que quedan.
  16. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C.

3. Establecimiento del cultivo de organoides dentales (Figura 1A y Figura 2A)

  1. Con base en el número de celdas obtenido, calcule el número de pozos que se pueden sembrar. Una gota de 20 μL debe contener 20.000 células. La mezcla final se compone de suspensión celular y BMM en una proporción de 30:70.
  2. Retire la cantidad adecuada de sobrenadante y resuspenda en BMM helado para obtener una proporción de 70:30 de BMM: suspensión celular para chapado. Por ejemplo, cuando se obtienen 200.000 células, placa 10 gotas de 20 μL. Por lo tanto, retire el sobrenadante hasta que queden 60 μL de la suspensión celular, agregue 140 μL de BMM helado y resuspenda.
    1. Resuspenda lentamente para evitar la formación de burbujas de aire. Una vez resuspendido en BMM, mantenga el tubo de la microcentrífuga en hielo.
      NOTA: Mantener el tubo de la microcentrífuga en hielo es crucial para evitar la solidificación de BMM.
  3. Pipetear las gotas de BMM de 20 μL en el centro de los pozos de la placa de cultivo precalentada de 48 pocillos.
  4. Voltee la placa boca abajo, colóquela en una incubadora de CO2 al 1,9% (% de CO2 según el tampón SFDM) y deje que se solidifique durante al menos 20 minutos a 37 ° C.
  5. Añadir el inhibidor de ROCK (RI; 10 μM) y la anfotericina B (0,1%) a TOM y precalentar el medio en un baño de agua a 37 °C.
    NOTA: La anfotericina B es sensible a la luz.
  6. Tome la placa de 48 pocillos de la incubadora, colóquela en posición vertical y agregue 250 μL del medio preparado precalentado a cada pozo con gotas / células BMM y devuelva la placa a la incubadora de CO2 al 1.9%.
  7. Para refrescar el medio (preferiblemente cada 2-3 días), incline la placa de 48 pocillos en un ángulo de 45°, retire suavemente el medio anterior mientras evita tocar la gota de BMM y agregue 250 μL de nuevo medio TOM precalentado.
    NOTA: Se recomienda refrescar al menos tres veces a la semana para evitar el agotamiento de nutrientes clave y factores de crecimiento. La RI solo debe añadirse a TOM en la siembra inicial y en los primeros días de cada paso (ver sección 4) para prevenir la muerte celular por anoikis y mejorar el crecimiento organoide. La anfotericina B solo se agrega al medio durante el paso 0 (P0) para bloquear la posible contaminación por hongos.

4. Amplificación y paso a través del cultivo de organoides dentales (Figura 1B y Figura 2B)

  1. Paso de los organoides entre 10 y 14 días de cultivo.
    NOTA: Evite el cultivo durante un período más largo, ya que el cultivo prolongado puede limitar el recrecimiento y la transitabilidad de los organoides. Solo en el desarrollo inicial (P0) los organoides pueden cultivarse durante un máximo de 20 días, dependiendo de su tasa de crecimiento (hasta que se alcance el máximo ±200 μm de diámetro).
  2. Retire el medio de los pocillos con organoides que necesitan ser pasados. Dentro de una condición de cultivo, agrupe hasta cuatro pozos confluentes (ver Figura 2C).
  3. Para recolectar los organoides, agregue 400 μL de SFDM helado por pozo directamente sobre la gota de BMM y pipetee repetidamente el medio hacia arriba y hacia abajo hasta que se desaloje toda la gota de BMM.
    1. En caso de que se estén agrupando pozos, transfiera los 400 μL del primer pozo al siguiente (y así sucesivamente) para desalojar las gotas de BMM que contienen organoides de todos los pozos que deben agruparse.
  4. Transfiera el conjunto de organoides BMM desalojado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y repita el paso 4,3 nuevamente hasta que todas las estructuras organoides se recojan de los pozos.
  5. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
  6. Precalentar una alícuota de TrypLE Express (suplementado con RI a 5 μM) en un baño de agua a 37 °C. Por tubo de microcentrífuga de organoides, se necesita un volumen de 400 μL TrypLE Express.
  7. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 400 μL de TrypLE. Incubar la suspensión en un baño de agua a 37 °C durante 12 min.
  8. Añadir 400 μL de SFDM helado para inactivar la enzima y centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante.
  9. Cubra previamente una punta (para ver el volumen, consulte a continuación) con SFDM helado y vuelva a suspender el gránulo organoide.
    1. Para evitar la pérdida de organoides, reutilice la misma punta (pre-recubierta) tanto como sea posible sin poner en peligro la esterilidad.
      NOTA: El volumen de SFDM requerido para la resuspscripción del pellet depende del número de estructuras organoides obtenidas y del número de paso actual.
    2. Como regla general, para los pasajes, P0 a P2-3 (generalmente todavía creciendo un bajo número de organoides) utilizan un volumen de 200 μL SFDM. A partir de pasajes, P3-4 o superior (generalmente produciendo un mayor número de organoides) utiliza un volumen de 700 μL de SFDM.
      NOTA: Ambos procedimientos se denominan métodos de "paso bajo" y "paso superior", respectivamente (véanse los pasos 4.10 y 4.11). La aplicación correcta de los distintos métodos es crucial para el paso eficiente de los organoides. Con el método de paso más alto, los organoides se pierden más fácilmente y no deben aplicarse a un bajo número de organoides (es decir, en P0 a P2-3). Sin embargo, el método de paso más alto es necesario para disociar eficientemente grandes cantidades de organoides.
  10. Método de paso bajo: Resuspendir el pellet en 200 μL de SFDM helado. Empuje la punta de la pipeta completamente vacía contra la parte inferior del tubo de la microcentrífuga para reducir su diámetro. Compruebe si el diámetro es lo suficientemente pequeño (aspiración más lenta, el flujo está sesgado pero no bloqueado). Pipetee hacia arriba y hacia abajo durante 5 minutos para interrumpir mecánicamente los organoides.
  11. Método de paso superior: Resuspend el pellet en 700 μL de SFDM helado con una punta P1000. Agregue una punta P200 (sin filtro) encima de esta punta P1000 y cubra previamente con SFDM helado. Evite la formación de burbujas de aire ajustando el ajuste de volumen de la pipeta para aspirar al menos al 90% del volumen medio (con organoides). Pipetee hacia arriba y hacia abajo durante 5 minutos para interrumpir mecánicamente los organoides.
  12. Compruebe bajo el microscopio de luz (a un aumento de 4x) si se obtienen principalmente células individuales con (sólo) unas pocas estructuras no dispersas.
  13. Agregue 500 μL de SFDM helado al tubo de la microcentrífuga y mezcle suavemente la mezcla de células disociadas con el SFDM fresco mediante pipeteo.
  14. Deje sedimentar grandes estructuras sin perturbar durante 10 minutos colocando verticalmente el tubo de la microcentrífuga sobre hielo.
    NOTA: Es necesario eliminar las estructuras no perturbadas porque influyen negativamente en la transitabilidad de los organoides. Para la iniciación organoide (P0), este paso de sedimentación no es necesario.
  15. Recoger el sobrenadante (~500-1.000 μL dependiendo del método de paso) que contiene células individuales y grupos de células pequeñas; transferir a un nuevo tubo de microcentrífuga y centrifugar a 190 x g durante 10 min a 4 °C.
  16. Calcule la concentración de células utilizando un contador de células automatizado. Descuide los grupos celulares que quedan.
  17. Cuente cuántos pozos se pueden sembrar y calcule la relación de suspensión celular/BMM apropiada como se describió anteriormente (sección 3).
  18. Agregue el 70% de BMM al pellet celular y mantenga el tubo de la microcentrífuga en hielo.
    NOTA: Es crucial mantener el tubo de la microcentrífuga en hielo para evitar la solidificación de BMM.
  19. Continúe con el paso 3.3 hasta el 3.7 y pase nuevamente entre el día 10 y el día 14 de la cultura.

5. Criopreservación de organoides dentales

  1. Recoja y disocie los organoides como se mencionó anteriormente para el paso (paso 4). Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
  2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de medio de criopreservación que contenga SFDM (70%), FBS (20%) y DMSO (10%).
  3. Transfiera la suspensión a un criovial y póngala en hielo. Coloque los crioviales en una caja criogénica y transfiéralos a -80 °C (durante al menos 4 h).
  4. Dentro de 1 mes, transfiera las muestras congeladas a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo (>12 meses).

6. Descongelación de organoides dentales criopreservados

  1. Antes de comenzar el procedimiento de descongelación, coloque un tubo de 15 ml por criovial sobre hielo que contenga 10 ml de SFDM con 20% de FBS.
  2. Retire el criovial del nitrógeno líquido y póngalo en hielo.
    NOTA: Realice los siguientes pasos lo más rápido posible y evite el tiempo de descongelación demasiado largo (>5 min), así como los intervalos demasiado largos entre los pasos (>5 min), ya que dicha prolongación disminuirá la supervivencia celular.
  3. Coloque el criovial en un baño de agua tibia (37 °C) hasta que se descongele (~1-2 min).
  4. Transfiera inmediatamente el contenido del criovial al tubo helado de 15 ml y a la centrífuga a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
  5. Retire 9 ml del sobrenadante y centrífuga los 1 ml restantes a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y lave el pellet con 1 ml de SFDM helado.
  6. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y cuente las células utilizando un contador de células automatizado.
  7. Cuente cuántos pozos se pueden sembrar y calcule la relación de suspensión celular/BMM apropiada como se describió anteriormente (sección 3).
  8. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspenda el pellet en una proporción de 70:30 de BMM:TOM y manténgalo en hielo.
  9. Continúe con el paso 3.3 hasta el 3.7 y pase entre el día 10 y el día 14 de la cultura.

7. Fijación e incrustación de parafina de organoides dentales

NOTA: Este procedimiento (incluidas las secciones 8 y 9) también se puede aplicar al tejido primario de DF.

  1. Fijación de organoides dentales en PFA
    1. Retire el medio de cada pozo como en el paso 4.2.
    2. Recoge los organoides desalojando la gota de BMM (paso 4.3). Transfiera la mezcla de BMM-organoide a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    3. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
    4. Retire el sobrenadante y agregue 500 μL de PFA al 4% e incube durante un mínimo de 30 min (máximo 1 h) a RT con una mezcla suave en un agitador orbital.
      PRECAUCIÓN: Use la campana química cuando trabaje con PFA.
    5. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y enjuague el gránulo organoide con PBS durante 10 minutos en RT con un suave agitación.
    6. Lave el gránulo organoide (paso 7.1.5) dos veces más. Gire los organoides fijos hacia abajo a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
    7. Resuspendir el pellet en 500 μL de 70% EtOH (en agua desionizada). Almacene los organoides durante un máximo de 1 mes en EtOH al 70% a 4 °C.
  2. Incrustación de agarosa y parafina de organoides dentales
    NOTA: Para incrustar organoides de manera eficiente en la parafina, se necesita un paso adicional de incrustación en la agarosa.
    1. Centrifugar los organoides fijados con PFA en 70% EtOH a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante.
    2. Prepare una solución de agarosa al 2% en 30 ml de PBS en una botella de vidrio. Calentar la mezcla de agarosa-PBS en un microondas hasta que se observe una estructura similar a un gel (aproximadamente 2,5 min a 600 W).
    3. En paralelo, agregue 30 ml de PBS a otra botella de vidrio y caliéntelo en el microondas (aproximadamente 2,5 min a 600 W). Deje que la solución de agarosa se enfríe durante 1 min.
    4. Cortar el extremo de una punta P200 para permitir trabajar con la solución de agarosa con precisión y evitar burbujas de aire.
    5. Precaliente la punta P200 en el PBS caliente mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces.
    6. Agregue 150 μL de solución de agarosa precalentada al gránulo organoide y pipetee suavemente la mezcla organoide-agarosa (con una resuspensión mínima) mientras evita las burbujas de aire.
      NOTA: La resuspensión mínima permitirá ubicar mejor los organoides en el gel de agarosa en la sección del microtomo, ya que los organoides están más cerca unos de otros.
    7. Transfiera inmediatamente la mezcla de organoide-agarosa a la misma tapa del tubo de la microcentrífuga, coloque el tubo horizontalmente y deje que la agarosa se solidifique (~ 20 min en RT). Mientras tanto, etiquete los casetes.
    8. Una vez solidificado, retire el gel de agarosa de la tapa de la microcentrífuga con una pinza y transfiéralo a un casete etiquetado.
    9. Transfiera el casete que contiene agarosa a un vaso de precipitados que contenga 50% de EtOH en agua desionizada. Cubra el vaso de precipitados con parafilm para evitar la evaporación del EtOH.
      NOTA: El volumen del vaso de precipitados depende del número de casetes.
    10. Procese las muestras en un procesador de tejidos durante la noche.
      NOTA: Como la parafina se solidifica en RT, los siguientes pasos deben realizarse rápidamente.
    11. Precalentar un bloque calefactor en la estación de trabajo de incrustación durante 15 minutos.
    12. Retire el gel de agarosa que contiene organoides encerrado en el cassette y colóquelo en el bloque de calentamiento precalentado. Retire la tapa del cassette y déjela a un lado para su uso posterior.
    13. Llene el bloque de calefacción restante con parafina.
      NOTA: Verifique con una pinza si el gel de agarosa que contiene organoides todavía se encuentra en la parte inferior del bloque de calentamiento. Debido a su peso ligero, podría comenzar a flotar, lo que resulta en la pérdida de muestras.
    14. Coloque la tapa del cassette en la parte superior del bloque de calefacción. Deja que se solidifique durante 30 min en un plato frío. Retire el bloque calefactor y guarde los bloques de parafina a 4 °C.

8. Seccionamiento y tinción del microtomo de organoides dentales (Figura 2B y Figura 3A-C)

  1. Seccionamiento microtomático de bloques de parafina que contienen organoides
    1. Cortar secciones de 5 μm de los organoides dentales en los bloques de parafina usando un microtomo.
    2. Coloque las rodajas de parafina sobre un portaobjetos de vidrio para microscopio. Coloque el portaobjetos de vidrio del microscopio sobre una placa caliente a 37 °C y cúbralo con agua desionizada con una pipeta Pasteur.
    3. Deje que el vaso del microscopio se seque durante la noche.
  2. Tinción de secciones organoides dentales
    1. Desparafinar las secciones organoides (en el portaobjetos de vidrio del microscopio) en un horno durante 1 h a 58 °C.
    2. Rehidrate las secciones organoides (en el portaobjetos de vidrio del microscopio) en la serie EtOH decreciente dentro de la campana química en el siguiente orden:
      Xileno 2x durante 3 min cada uno
      100% EtOH 2x durante 3 min cada uno
      95% EtOH 2x durante 3 min cada uno
      90% EtOH 2x durante 3 min cada uno
      70% EtOH 3x durante 3 min cada uno
      PRECAUCIÓN: Use la campana química cuando trabaje con xileno.
    3. Enjuague el portaobjetos de vidrio del microscopio en agua del grifo durante 5 minutos en RT. Luego, enjuáguelo en PBS durante 5 minutos en RT.
    4. Realice la recuperación de antígenos colocando las secciones organoides (en el portaobjetos de vidrio del microscopio) en tampón de citrato precalentado (10 mM de ácido cítrico en agua desionizada con pH 6; en un recipiente de plástico; precalentado durante 10 min en un baño de agua de 95 °C) durante 30 min en un baño de agua de 95 °C.
    5. Deje que el portaobjetos de vidrio del microscopio se enfríe durante 20 minutos en RT. Enjuague el portaobjetos de vidrio del microscopio en PBS durante 5 minutos en RT, y luego en PBS que contenga 0.1% de Tritón-X (PBT) durante 5 minutos en RT.
    6. Utilice una pluma de marcado para crear una barrera hidrofóbica en los bordes de cada diapositiva.
    7. Bloqueo durante un mínimo de 1 h a RT en tampón de bloqueo (que contiene 1,5 mg/ml de glicina, 2 mg/ml de suero bovino de albúmina (BSA) disuelto en PBT) más suero de burro al 10%.
      NOTA: Por lo general, se necesitan 300 μL de tampón de bloqueo más un 10% de suero de burro por portaobjetos de vidrio del microscopio.
    8. Coloque el portaobjetos de vidrio del microscopio en una cámara húmeda. Use una caja hermética donde quepan todos los portaobjetos y moje algunos pañuelos de papel con agua para colocarlos en la parte inferior de la caja. Esto evitará que las diapositivas se sequen durante los pasos de tinción posteriores.
    9. Retire el tampón de bloqueo, agregue el anticuerpo primario (Tabla 6) preparado en tampón de bloqueo más suero de burro al 1% e incube el portaobjetos cubierto con solución de anticuerpos durante la noche en la cámara húmeda a 4 ° C. Vuelva a hacer el borde de la pluma de marcado si es necesario.
    10. Lave el portaobjetos de vidrio del microscopio tres veces en PBT a RT durante 10 minutos con una mezcla suave en un agitador orbital (75-150 rpm).
    11. Añadir el anticuerpo secundario (Tabla 6), preparado en tampón de bloqueo más suero de burro al 1%, e incubar durante 1 h en la cámara húmeda a RT.
    12. Retire el tampón de bloqueo y lave el portaobjetos de vidrio del microscopio tres veces en PBT a RT durante 10 minutos con una mezcla suave en un agitador orbital.
    13. Agregue el medio de montaje antifade con DAPI (1 a 3 gotas) en una cubierta de vidrio y monte esto en la parte superior de las secciones organoides (en el portaobjetos de vidrio del microscopio). Proceda con la toma de imágenes; conservar los portaobjetos durante un máximo de 1 semana a 4 °C.

9. Extracción de ARN y RT-qPCR de organoides dentales (Figura 2B y Figura 3D)

  1. Extracción de ARN de organoides dentales
    1. Retire el medio de cada pocillo (paso 4.2).
    2. Recoger los organoides desalojando la gota de BMM (paso 4.3), transferir la mezcla BMM-organoide a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
    3. Retire el sobrenadante, resuspenda vigorosamente en 350 μL de β-mercaptoetanol al 1% disuelto en tampón de lisis (Tabla de Materiales), y póngalo en hielo.
      PRECAUCIÓN: Realice todos los pasos con β-mercaptoetanol en una campana química.
      NOTA: Las muestras se pueden almacenar en este paso durante un máximo de 1 mes a -80 °C. Descongele las muestras en hielo antes de continuar con el paso 9.1.4.
    4. Vórtice las muestras hasta que ya no se observen estructuras organoides.
    5. Proceda con la extracción de ARN utilizando el kit de extracción de ARN (Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. RT-qPCR de organoides dentales (Tabla 7)
    1. Transcribir inversamente (RT) el ARN19 utilizando el kit de transcripción inversa (Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Analizar las muestras de ADNc resultantes con PCR cuantitativa (qPCR) basada en SYBR Green19 utilizando un Sistema de PCR en Tiempo Real (Tabla de Materiales).

Resultados

Desarrollo de organoides dentales
Proporcionamos un protocolo detallado para establecer cultivos de organoides a partir de tejido DF humano adquirido después de la extracción de muelas del juicio (Figura 1A). La DF aislada se disocia enzimática y mecánicamente. Las células obtenidas se cultivan dentro de BMM en medios que se definieron empíricamente para el desarrollo y crecimiento óptimo de organoides (medio organoide dental; TOM)19.

Discusión

Este protocolo describe la generación eficiente y reproducible de organoides a partir del diente humano. Hasta donde sabemos, esta es la primera metodología para establecer organoides de concepto actual (epitelial) a partir de tejido dental humano. Los organoides son expandibles a largo plazo y muestran un fenotipo de tallo epitelial dental, duplicando los DESC previamente reportados en el compartimiento ERM del DF7. Además, los organoides replican las características funcionales de DESC/ERM, ...

Divulgaciones

El autor correspondiente se asegura de que todos los autores hayan revelado todos y cada uno de los conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a todos los miembros del personal de Cirugía Oral y Maxilofacial (MKA) de UZ Leuven, así como a los pacientes, por su inestimable ayuda en la recolección de terceros molares recién extraídos. También nos gustaría agradecer a la Dra. Reinhilde Jacobs y a la Dra. Elisabeth Tijskens por su ayuda con la recolección de muestras. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de KU Leuven (BOF) y FWO-Flanders (G061819N). L.H. es un FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Microcentrifuge tubeEppendorf30120.086
15 mL Centrifuge tubeCorning430052
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM-6250
48-well flat bottom platesCorning3548
50 mL Centrifuge tubeCorning430290
A83-01Sigma-AldrichSML0788
AgaroseLonza50004
Albumin Bovine (cell culture grade)Serva47330.03
AMELX antibodySanta Cruzsc-365284
Amphotericin BGibco15200018
B27 (without vitamin A)Gibco12587-010
CassetteVWR7202191
Catalase from bovine liverSigma-AldrichC100
CD44 antibodyAbcamab34485
Cell strainer, 40 µmFalcon352340
Cholera ToxinSigma-AldrichC8052
Citric acidSigma-AldrichC0759
CK14 antibodyThermo Fisher ScientificMA5-11599
Collagenase IVGibco17104-019
Cover glassVWR6310146
CryoboxThermo Scientific5100-0001
CryovialThermo Fisher Scientific375353
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dispase IISigma-AldrichD4693
DMEM 1:1 F12 without FeInvitrogen074-90715A
DMEM powder high glucoseGibco52100039
DnaseSigma-AldrichD5025-15KU
Donkey serumSigma-AldrichD9663 - 10ML
Embedding workstation, 220 to 240 VacThermo Fisher Scientific12587976
Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH)Fisher ChemicalE/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF7524
FGF10Peprotech100-26
FGF2 (= basic FGF)R&D Systems234-FSE-025
FGF8PeprotechAF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep KitSigma-AldrichRTN350-1KTIncludes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer
Glass Pasteur pipetteNiko Mechanisms170-40050
GlycineVWR101194M
HEPESSigma-AldrichH4034
IGF-1PeproTech100-11
InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI)Sigma-Aldrich688001
Insulin from bovine pancreasSigma-AldrichI6634
ITGA6 antibodySigma-AldrichHPA012696
L-GlutamineGibco25030024
Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free)Corning15505739
Microscope slideThermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μmMilliporeSLGV033R
Minimum essential medium eagle (αMEM)Sigma-AldrichM4526
mouse IgG (Alexa 555) secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-31570
N2Gibco17502-048
N-acetyl L-cysteineSigma-AldrichA7250
NicotinamideSigma-AldrichN0636
NogginPeproTech120-10C
P63 antibodyAbcamab124762
Pap PenSigma-AldrichZ377821-1EAMarking pen
Paraformaldehyde (PFA), 16%Merck8.18715
Penicillin G sodium saltSigma-AldrichP3032
Penicillin-streptomycin (Pen/Strep)Gibco15140-122
Petri dishCorning353002
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010-015
Pipette (P20, P200, P1000)Eppendorf or others2231300006
Plastic transfer pipette (3.5 mL)Sarstedt86.1171.001
Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibodyThermo Fisher ScientificA21206
RSPO1PeproTech120-38
SB202190 (p38i)Biotechne (Tocris)1264
Scalpel (surgical blade)Swann-Morton207
SHHR&D Systems464-SH-200
Silicone molds (Heating block)VWR720-1918
Sodium Chloride (NaCl)BDH102415K
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)Merck106329
Sodium-pyruvate (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP-5280
SOX2 antibodyAbcamab92494
StepOnePlusThermo Fisher ScientificReal-Time PCR System
Stericup-GP, 0.22 µmMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μmMilliporeSCGP00525
Sterile 1000 μL pipette tips with filterGreiner740288
Sterile 20 μL pipette tips with filterGreiner774288
Sterile 200 μL pipette tips with and without filterGreiner739288
Sterile H2OFreseniusB230531
Streptomycin sulfate saltSigma-AldrichS6501
Superscript III first-strand synthesis supermixInvitrogen11752-050Reverse transcription kit
Tissue processorThermo Scientific12505356
TransferrinServa36760.01
Triton X-100SigmaT8787-50ML
TrypLE expressGibco12605-010
Vectashield mounting medium+DAPILabconsult NVH-1200Antifade mounting medium with DAPI
WNT3aBiotechne (Tocris)5036-WN-500
Xylenes, 99%, for biochemistry and histologyVWR2,89,75,325

Referencias

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