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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per sviluppare colture organoidi epiteliali a partire dal dente umano. Gli organoidi sono robustamente espandibili e ricapitolano le cellule staminali epiteliali del dente, compresa la loro capacità di differenziazione degli ameloblasti. L'esclusivo modello organoide fornisce uno strumento promettente per studiare la biologia dentale umana (cellule staminali) con prospettive per approcci rigenerativi dei denti.

Abstract

I denti sono di fondamentale importanza nella vita non solo per la masticazione alimentare e la parola, ma anche per il benessere psicologico. Le conoscenze sullo sviluppo e la biologia dei denti umani sono scarse. In particolare, non si sa molto sulle cellule staminali epiteliali del dente e sulla loro funzione. Siamo riusciti a sviluppare un nuovo modello organoide a partire dal tessuto dentale umano (cioè follicolo dentale, isolato dai denti del giudizio estratti). Gli organoidi sono espandibili in modo robusto e a lungo termine e ricapitolano il compartimento delle cellule staminali epiteliali del dente umano proposto in termini di espressione del marcatore e attività funzionale. In particolare, gli organoidi sono in grado di dispiegare un processo di differenziazione degli ameloblasti come avviene in vivo durante l'amelogenesi. Questo modello unico di organoidi fornirà un potente strumento per studiare non solo lo sviluppo dei denti umani, ma anche la patologia dentale e potrebbe aprire la strada alla terapia rigenerativa dei denti. La sostituzione dei denti persi con un dente biologico basato su questo nuovo modello organoide potrebbe essere un'alternativa interessante all'attuale impianto standard di materiali sintetici.

Introduzione

I denti hanno ruoli essenziali nella masticazione alimentare, nella parola e nel benessere psicologico (immagine di sé). Il dente umano è costituito da tessuti altamente mineralizzati di varia densità e durezza1. Lo smalto dentale, il componente principale della corona del dente, è il tessuto mineralizzato più alto del corpo umano. Durante la formazione dello smalto (amelogenesi), quando i denti si sviluppano, le cellule staminali epiteliali dentali (DESC) si differenziano in cellule che formano lo smalto (ameloblasti). Una volta formato, lo smalto viene raramente riparato o rinnovato a causa della perdita apoptotica degli ameloblasti all'inizio dell'eruzione dentale1. Il ripristino del tessuto smaltato danneggiato, causato da traumi o malattie batteriche, viene attualmente effettuato utilizzando materiali sintetici; tuttavia, questi sono turbati da importanti carenze come il microleakage, l'osteointegrazione e l'ancoraggio inferiori, la durata della vita finita e la mancanza di riparazione completamente funzionale2. Quindi, una coltura robusta e affidabile di DESC umani con la capacità di generare ameloblasti e il potenziale per produrre tessuto mineralizzato sarebbe un importante passo avanti nel campo rigenerativo dentale.

Le conoscenze sul fenotipo DESC umano e sulla funzione biologica sono scarse 3,4,5. È interessante notare che i DESC dei denti umani sono stati proposti per esistere nei resti delle cellule epiteliali di Malassez (ERM), cluster cellulari presenti all'interno del follicolo dentale (DF), che circonda i denti non eruttati e rimane presente nel legamento parodontale intorno alla radice una volta che il dente erutta1. È stato scoperto che le cellule ERM co-coltivate con polpa dentale si differenziano in cellule simili agli ameloblasti e generano tessuto simile allo smalto6. Tuttavia, studi approfonditi sul ruolo specifico delle cellule ERM nella (ri)generazione dello smalto sono stati limitati a causa della mancanza di modelli di studio affidabili7. Gli attuali sistemi di coltura in vitro ERM sono ostacolati da una durata di vita limitata e da una rapida perdita di fenotipo nelle condizioni 2D utilizzate standardmente 8,9,10,11,12. Quindi, un sistema trattabile in vitro per espandere, studiare e differenziare fedelmente i DESC umani è fortemente necessario.

Durante l'ultimo decennio, una potente tecnica per coltivare cellule staminali epiteliali in vitro è stata applicata con successo a diversi tipi di tessuti epiteliali (umani) per studiare la loro biologia e la malattia 13,14,15,16. Questa tecnologia consente alle cellule staminali epiteliali tissutali di auto-svilupparsi in costruzioni cellulari 3D (cioè organoidi) quando seminate in un'impalcatura che imita la matrice extracellulare (ECM) (tipicamente, Matrigel) e coltivate in un mezzo definito che replica la segnalazione di nicchia delle cellule staminali del tessuto e / o l'embriogenesi. I fattori di crescita tipici necessari per lo sviluppo di organoidi includono il fattore di crescita epidermico (EGF) e gli attivatori del sito di integrazione MMTV di tipo alare (WNT) 14,15,16. Gli organoidi risultanti sono caratterizzati da una fedeltà duratura nell'imitare le cellule staminali epiteliali originali del tessuto, nonché da un'elevata espandibilità pur mantenendo il loro fenotipo e le loro proprietà funzionali, superando così la disponibilità di tessuto umano primario spesso limitata acquisita dalla clinica. Per stabilire gli organoidi, non è necessario l'isolamento delle cellule staminali epiteliali dal tessuto eterogeneo (cioè comprendente altri tipi di cellule come le cellule mesenchimali) prima della coltura poiché le cellule mesenchimali non si attaccano o prosperano nell'ECM, risultando infine in organoidi puramente epiteliali 13,16,17,18,19 . Questa tecnologia promettente e versatile ha portato allo sviluppo di molteplici modelli organoidi da vari tessuti epiteliali umani. Tuttavia, gli organoidi derivati dai denti umani, preziosi per lo studio approfondito dello sviluppo, della rigenerazione e della malattia dei denti, non sono stati ancora stabiliti20,21. Recentemente siamo riusciti a sviluppare un nuovo modello organoide a partire dal tessuto DF di terzi molari (denti del giudizio) estratti da pazienti adolescenti19.

Qui, descriviamo il protocollo per sviluppare colture organoidi epiteliali dal dente umano adulto (cioè dal DF dei terzi molari) (Figura 1A). Gli organoidi risultanti esprimono marcatori di stelo associati all'ERM pur essendo espandibili a lungo termine. Curiosamente, contrariamente alla maggior parte degli altri modelli di organoidi, l'EGF tipicamente necessario è ridondante per uno sviluppo e una crescita robusti di organoidi. È interessante notare che gli organoidi di staminale mostrano proprietà di differenziazione degli ameloblasti, imitando così le caratteristiche e i processi ERM / DESC che si verificano in vivo. Il nuovo e unico modello organoide qui descritto consente di esplorare la biologia, la plasticità e la capacità di differenziazione DESC e apre la porta per fare i primi passi verso approcci rigenerativi dei denti.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato Etico ricerca UZ/KU Leuven (13/0104U). I terzi molari estratti (denti del giudizio) sono stati ottenuti dopo il consenso informato dei pazienti.

1. Preparativi

  1. Preriscaldare una piastra di coltura a 48 pozzetti per 15-20 ore in un incubatore CO2 all'1,9 % a 37 °C.
  2. Liquefare un'aliquota di Matrigel (fattore di crescita ridotto; priva di fenolo rosso; ulteriormente indicata come matrice di membrana basale; BMM) su ghiaccio (4 °C) per un minimo di 2 ore prima del punto 2.1.
    NOTA: Evitare cicli di congelamento/scongelamento del BMM. Liquefare il BMM per 15-20 h su ghiaccio e aliquotare a 1 mL in tubi microcentrifuga e conservare a -20 °C.
  3. Raffreddare la centrifuga a 4 °C.
  4. Preparare il fluido e filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm. I seguenti volumi si basano sulla raccolta dei DF da tutti e quattro i terzi molari tipicamente estratti contemporaneamente.
    1. Preparare 20 ml di mezzo di raccolta DF (Tabella 1): aquila media minima essenziale (αMEM) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), lo 0,5% di amfotericina B e l'1% di penicillina-streptomicina. Trasferire 4 mL di mezzo di raccolta DF in un tubo da 15 mL e trasferire i tubi sul ghiaccio.
      NOTA: Una provetta da 15 ml è sufficiente per paziente per la raccolta del campione (cioè per quattro terzi molari).
    2. Produrre 20 ml di mezzo organoide dentale (ulteriormente indicato come TOM; Tabella 2) utilizzando un mezzo definito privo di siero (SFDM; Tabella 3). Conservare TOM a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
    3. Preparare 8 mL di mezzo di dissociazione (Tabella 4), cioè soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente collagenasi VI (3 mg/mL) e dispasi II (4 mg/mL). Preriscaldare il mezzo di dissociazione a bagnomaria a 37 °C per almeno 10 minuti prima dell'uso e trasferirlo in due tubi da 15 mL (4 mL per tubo) per dissociare quattro tessuti DF.
    4. Preparare una piastra di lavaggio (12 pozzetti) contenente: tre pozzetti con 70% etOH, tre pozzetti con PBS e tre pozzetti con mezzo di raccolta DF.
    5. Produrre 15 mL di mezzo A per campione (cioè 5 mL per due DF per paziente; Tabella 5).
      NOTA: i seguenti passaggi devono essere eseguiti in condizioni sterili.

2. Dissociazione del follicolo dentale

  1. Una volta che i terzi molari con i DF associati sono stati raccolti nel mezzo di raccolta (su ghiaccio), trasferire il contenuto dei tubi in una capsula di Petri.
  2. Tenere il dente con una pinzetta e isolare accuratamente il DF usando una lama chirurgica.
    NOTA: questo passaggio richiede pratica; fai attenzione con la lama.
  3. Per lavare il sangue rimanente dai DF, posizionare brevemente i tessuti DF nel primo pozzetto di EtOH al 70% (piastra di lavaggio) per 20 s, quindi trasferire al successivo pozzo EtOH per 20 s, e successivamente al terzo pozzo EtOH (massimo 1 minuto nel 70% EtOH in totale; un tempo di incubazione più lungo comporterà una ridotta vitalità cellulare).
  4. Successivamente, continuare il risciacquo nei tre pozzetti PBS (massimo 2 minuti in totale).
  5. Risciacquare i DF nei tre restanti pozzetti medi di raccolta DF (fino a un massimo di 20 minuti in totale).
  6. Trasferire i DF risciacquati in una nuova capsula di Petri.
  7. Tagliare un piccolo pezzo di uno dei DF (~5 mm2) per la fissazione della paraformaldeide (PFA) (vedere paragrafo 7) e conservarlo sul ghiaccio (per un massimo di 6 ore) in un tubo microcentrifuga contenente 500 μL di mezzo di raccolta DF fino alla fissazione del PFA.
  8. Tritare il resto dei DF in piccoli pezzi (~1 mm2).
    NOTA: Si consiglia di elaborare immediatamente i tessuti DF appena isolati per la formazione ottimale degli organoidi e l'efficienza di crescita, piuttosto che iniziare dal tessuto crioconservato, il che si traduce in una minore efficienza. Tuttavia, è possibile crioconservare il tessuto DF primario in questa fase (vedere mezzo di crioconservazione e protocollo al paragrafo 5).
  9. Trasferire i DF tritati in un tubo da 15 mL contenente 4 mL di mezzo di dissociazione prebellico e incubare in un bagno d'acqua a 37 °C per 2 ore.
    NOTA: Aggiungere due DF per 4 mL di mezzo di dissociazione preriscaldato (un tubo) per garantire una dissociazione ottimale.
  10. Ogni 15 minuti, pipettare il mezzo di dissociazione DF mescolare su e giù usando un pipetto Pasteur di vetro per accelerare la disintegrazione del tessuto. Quando i pezzi DF non vengono più osservati (di solito dopo 1 ora), procedere con la dissociazione DF utilizzando un pipetto Pasteur ristretto lucidato a fuoco.
    NOTA: per una dissociazione DF ottimale, passare a un pipetto Pasteur ristretto mediante lucidatura antincendio entro e non oltre 1 ora di isolamento DF.
    1. Nel frattempo preparare 10 mL di mezzo A contenente 50 μL di DNasi (0,2 mg/mL; Tabella 5).
  11. Aggiungere 5 ml di mezzo A (contenente la DNasi) a ciascun tubo con DF dissociato e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente (RT).
  12. Filtrare la sospensione cellulare (contenente cellule singole e piccoli grumi cellulari) attraverso un filtro cellulare da 40 μm per rimuovere i frammenti di grandi dimensioni rimanenti e (la maggior parte) il tessuto fibroso.
    1. Combinare i diversi tubi con DF dissociato da un paziente in questa fase.
  13. Risciacquare il filtro con 1 mL di mezzo A. Centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 200 x g per 10 minuti a 4 °C.
  14. Rimuovere il surnatante, risospesciare il pellet in 1 mL di SFDM (Tabella 3) e trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
  15. Calcola la concentrazione cellulare utilizzando un contatore cellulare automatizzato. Trascurare i grumi cellulari che rimangono.
  16. Centrifugare a 200 x g per 5 min a 4 °C.

3. Istituzione di colture organoidi dentali (Figura 1A e Figura 2A)

  1. Sulla base del numero di cella ottenuto, calcolare il numero di pozzetti che possono essere seminati. Una goccia da 20 μL dovrebbe contenere 20.000 cellule. La miscela finale è composta da sospensione cellulare e BMM con un rapporto di 30:70.
  2. Rimuovere la quantità appropriata di surnatante e risospeso in BMM ghiacciato per ottenere un rapporto 70:30 di BMM: sospensione cellulare per placcatura. Ad esempio, quando si ottengono 200.000 cellule, piastra 10 goccioline da 20 μL. Quindi, rimuovere il surnatante fino a quando non rimangono 60 μL della sospensione cellulare, aggiungere 140 μL di BMM ghiacciato e risospese.
    1. Risospendare lentamente per evitare la formazione di bolle d'aria. Una volta risospeso in BMM, mantenere il tubo microcentrifuga sul ghiaccio.
      NOTA: Mantenere il tubo di microcentrifuga sul ghiaccio è fondamentale per evitare la solidificazione BMM.
  3. Pipettare le goccioline BMM da 20 μL al centro dei pozzetti della piastra di coltura preriscaldata a 48 pozzetti.
  4. Capovolgere la piastra, metterla in un incubatore a CO2 all'1,9 % (% CO2 secondo il tampone SFDM) e lasciarla solidificare per almeno 20 minuti a 37 °C.
  5. Aggiungere l'inibitore ROCK (RI; 10 μM) e l'amfotericina B (0,1%) al TOM e preriscaldare il mezzo a bagnomaria a 37 °C.
    NOTA: l'amfotericina B è sensibile alla luce.
  6. Prendere la piastra a 48 pozzetti dall'incubatore, posizionarla in posizione verticale e aggiungere 250 μL del mezzo preriscaldato preparato a ciascun pozzetto con goccioline / celle BMM e riportare la piastra all'incubatore CO2 all'1,9%.
  7. Per rinfrescare il mezzo (preferibilmente ogni 2-3 giorni), inclinare la piastra a 48 pozzetti con un angolo di 45 °, rimuovere delicatamente il mezzo precedente evitando di toccare la goccia BMM e aggiungere 250 μL di nuovo mezzo TOM preribalizzato.
    NOTA: Si consiglia di rinfrescare almeno tre volte alla settimana per evitare l'esaurimento dei nutrienti chiave e dei fattori di crescita. Il RI deve essere aggiunto al TOM solo alla semina iniziale e nei primi giorni di ogni passaggio (vedere paragrafo 4) per prevenire la morte cellulare da anoikis e migliorare la crescita organoide. L'amfotericina B viene aggiunta al mezzo solo durante il passaggio 0 (P0) per bloccare la possibile contaminazione fungina.

4. Amplificazione e passaggio di colture organoidiche dentali (Figura 1B e Figura 2B)

  1. Passaggio degli organoidi tra i 10 e i 14 giorni di coltura.
    NOTA: Evitare la coltivazione per un periodo più lungo poiché la coltura prolungata può limitare la ricrescita e la passabilità degli organoidi. Solo allo sviluppo iniziale (P0) gli organoidi possono essere coltivati per un massimo di 20 giorni a seconda del loro tasso di crescita (fino al raggiungimento di un diametro massimo di ±200 μm).
  2. Rimuovere il mezzo dai pozzetti con organoidi che devono essere passati. All'interno di una condizione di coltura, raggruppare fino a quattro pozzi confluenti (vedere figura 2C).
  3. Per raccogliere gli organoidi, aggiungere 400 μL di SFDM ghiacciato per pozzetto direttamente sulla goccia BMM e pipettare ripetutamente il mezzo su e giù fino a quando l'intera goccia BMM viene spostata.
    1. Nel caso in cui i pozzetti vengano raggruppati, trasferire i 400 μL dal primo pozzo al successivo (e così via) per rimuovere le goccioline BMM contenenti organoidi di tutti i pozzetti che devono essere raggruppati.
  4. Trasferire l'assemblaggio organoide BMM spostato in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e ripetere nuovamente il passaggio 4.3 fino a quando tutte le strutture organoidi non vengono raccolte dai pozzetti.
  5. Centrifugare a 200 x g per 5 min a 4 °C.
  6. Prima del riscaldamento un'aliquota di TrypLE Express (integrata con RI a 5 μM) in un bagno d'acqua a 37 °C. Per tubo microcentrifugato di organoidi, è necessario un volume di 400 μL TrypLE Express.
  7. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospese il pellet in 400 μL di TrypLE. Incubare la sospensione a bagnomaria a 37 °C per 12 min.
  8. Aggiungere 400 μL di SFDM ghiacciato per inattivare l'enzima e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
  9. Pre-rivestire una punta (per il volume vedi sotto) con SFDM ghiacciato e risospesire il pellet organoide.
    1. Per evitare la perdita di organoidi, riutilizzare il più possibile la stessa punta (preverniciata) senza compromettere la sterilità.
      NOTA: Il volume di SFDM richiesto per la risospendizione del pellet dipende dal numero di strutture organoidi ottenute e dal numero di passaggio corrente.
    2. Come regola generale, per i passaggi, da P0 a P2-3 (generalmente ancora in crescita un basso numero di organoidi) usano un volume di 200 μL SFDM. Dai passaggi, P3-4 o superiore (generalmente producendo un numero maggiore di organoidi) utilizza un volume di 700 μL di SFDM.
      NOTA: Entrambe le procedure sono denominate rispettivamente metodi "passaggio basso" e "passaggio superiore" (vedere i passaggi 4.10 e 4.11). La corretta applicazione dei metodi distinti è fondamentale per un efficiente passaggio degli organoidi. Con il metodo del passaggio superiore, gli organoidi sono più facilmente persi e non dovrebbero essere applicati a un basso numero di organoidi (cioè da P0 a P2-3). Tuttavia, il metodo di passaggio più elevato è necessario per dissociare in modo efficiente grandi quantità di organoidi.
  10. Metodo a basso passaggio: sospendere il pellet in 200 μL di SFDM ghiacciato. Spingere la punta del pipetto completamente svuotata contro il fondo del tubo della microcentrifuga per ridurne il diametro. Controllare se il diametro è abbastanza piccolo (aspirazione più lenta, il flusso è inclinato ma non bloccato). Pipettare su e giù per 5 minuti per interrompere meccanicamente gli organoidi.
  11. Metodo di passaggio superiore: risospesciare il pellet in 700 μL di SFDM ghiacciato con una punta P1000. Aggiungi una punta P200 (senza filtro) sopra questa punta P1000 e pre-rivestiti con SFDM ghiacciato. Prevenire la formazione di bolle d'aria regolando l'impostazione del volume del pipetto in modo da aspirare almeno al 90% del volume medio (con organoidi). Pipettare su e giù per 5 minuti per interrompere meccanicamente gli organoidi.
  12. Controllare al microscopio ottico (con ingrandimento 4x) se si ottengono principalmente singole cellule con (solo) poche strutture non disperse.
  13. Aggiungere 500 μL di SFDM ghiacciato al tubo di microcentrifuga e mescolare delicatamente la miscela di cellule dissociate con l'SFDM fresco mediante pipettaggio.
  14. Lasciare sedimentare grandi strutture non disperse per 10 minuti posizionando verticalmente il tubo della microcentrifuga sul ghiaccio.
    NOTA: È necessario rimuovere le strutture non disperse perché influenzano negativamente la passabilità organoide. Per l'inizio organoide (P0), questa fase di sedimentazione non è necessaria.
  15. Raccogliere il surnatante (~500-1.000 μL a seconda del metodo di passaggio) contenente singole cellule e piccoli cluster cellulari; trasferire in un nuovo tubo microcentrifuga e centrifugare a 190 x g per 10 minuti a 4 °C.
  16. Calcola la concentrazione cellulare utilizzando un contatore cellulare automatizzato. Trascurare i grumi cellulari che rimangono.
  17. Contare quanti pozzetti possono essere seminati e calcolare il rapporto sospensione cellulare/BMM appropriato come descritto sopra (sezione 3).
  18. Aggiungere il 70% di BMM al pellet cellulare e mantenere il tubo di microcentrifuga sul ghiaccio.
    NOTA: È fondamentale mantenere il tubo microcentrifuga sul ghiaccio per evitare la solidificazione BMM.
  19. Procedere con il passaggio 3.3 fino al 3.7 e passare di nuovo tra il giorno 10 e il giorno 14 della cultura.

5. Crioconservazione degli organoidi dentali

  1. Raccogliere e dissociare gli organoidi come menzionato sopra per il passaggio (passaggio 4). Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 min a 4 °C.
  2. Scartare il surnatante e risospesere il pellet in 1 mL di mezzo di crioconservazione contenente SFDM (70%), FBS (20%) e DMSO (10%).
  3. Trasferire la sospensione in un crioviale e metterla sul ghiaccio. Posizionare le crioviali in una criocasella e trasferirle a -80 °C (per almeno 4 ore).
  4. Entro 1 mese, trasferire i campioni congelati in azoto liquido per la conservazione a lungo termine (>12 mesi).

6. Scongelamento di organoidi dentali crioconservati

  1. Prima di iniziare la procedura di scongelamento, posizionare un tubo da 15 ml per crioviale su ghiaccio contenente 10 ml di SFDM con il 20% di FBS.
  2. Rimuovere il crioviale dall'azoto liquido e metterlo sul ghiaccio.
    NOTA: Eseguire i seguenti passaggi il più rapidamente possibile ed evitare tempi di scongelamento troppo lunghi (>5 min) e intervalli troppo lunghi tra i passaggi (>5 min), in quanto tale prolungamento ridurrà la sopravvivenza cellulare.
  3. Mettere il crioviale in un bagno d'acqua tiepida (37 °C) fino allo scongelamento (~1-2 min).
  4. Trasferire immediatamente il contenuto della crioviale nel tubo ghiacciato da 15 ml e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 4 °C.
  5. Rimuovere 9 mL del surnatante e centrifugare il restante 1 mL a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 1 mL di SFDM ghiacciato.
  6. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e contare le celle utilizzando un contatore cellulare automatizzato.
  7. Contare quanti pozzetti possono essere seminati e calcolare il rapporto sospensione cellulare/BMM appropriato come descritto sopra (sezione 3).
  8. Centrifugare a 200 x g per 5 min a 4 °C. Risospesciare il pellet in un rapporto 70:30 di BMM:TOM e tenerlo sul ghiaccio.
  9. Procedere con il passaggio 3.3 fino al 3.7 e passare tra il giorno 10 e il giorno 14 della cultura.

7. Fissazione e incorporazione di paraffina di organoidi dentali

NOTA: Questa procedura (comprese le sezioni 8 e 9) può essere applicata anche al tessuto DF primario.

  1. Fissazione di organoidi dentali in PFA
    1. Rimuovere il supporto da ciascun pozzetto come nel passaggio 4.2.
    2. Raccogliere gli organoidi spostando la goccia BMM (passaggio 4.3). Trasferire la miscela BMM-organoide in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml.
    3. Centrifugare a 200 x g per 5 min a 4 °C.
    4. Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 μL di PFA al 4% e incubare per un minimo di 30 minuti (massimo 1 ora) a RT con una miscelazione delicata su uno shaker orbitale.
      ATTENZIONE: Utilizzare la cappa chimica quando si lavora con PFA.
    5. Centrifugare a 200 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risciacquare il pellet organoide con PBS per 10 minuti a RT con un leggero scuotimento.
    6. Lavare il pellet organoide (punto 7.1.5) altre due volte. Far ruotare gli organoidi fissi a 200 x g per 5 minuti a 4 °C.
    7. Risospese il pellet in 500 μL di EtOH al 70% (in acqua deionizzata). Conservare gli organoidi per un massimo di 1 mese in EtOH al 70% a 4 °C.
  2. Incorporamento di agarosio e paraffina di organoidi dentali
    NOTA: Per incorporare in modo efficiente gli organoidi nella paraffina, è necessaria un'ulteriore fase di incorporamento nell'agarosio.
    1. Centrifugare gli organoidi fissi pfA in EtOH al 70% a 200 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
    2. Preparare una soluzione di agarosio al 2% in 30 ml di PBS in una bottiglia di vetro. Riscaldare la miscela di agarosio-PBS in un microonde fino a quando non si osserva una struttura gelatinosa (circa 2,5 minuti a 600 W).
    3. In parallelo, aggiungere 30 ml di PBS a un'altra bottiglia di vetro e riscaldare nel microonde (circa 2,5 minuti a 600 W). Lasciare raffreddare la soluzione di agarosio per 1 minuto.
    4. Tagliare l'estremità di una punta P200 per consentire di lavorare con precisione con la soluzione di agarosio ed evitare bolle d'aria.
    5. Preriscaldare la punta P200 nel PBS caldo pipettando su e giù un paio di volte.
    6. Aggiungere 150 μL di soluzione di agarosio preriscaldata al pellet organoide e convogliare delicatamente la miscela organoide-agarosio (con una risospensione minima) evitando bolle d'aria.
      NOTA: La minima risospensione consentirà di localizzare meglio gli organoidi nel gel di agarosio al sezionamento microtome poiché gli organoidi sono quindi più vicini l'uno all'altro.
    7. Trasferire immediatamente la miscela organoide-agarosio nello stesso tappo del tubo microcentrifuga, mettere il tubo orizzontalmente e lasciare che l'agarosio si solidifichi (~ 20 minuti a RT). Nel frattempo, etichetta le cassette.
    8. Una volta solidificato, rimuovere il gel di agarosio dal tappo del microcentrifuga usando una pinzetta e trasferirlo su una cassetta etichettata.
    9. Trasferire la cassetta contenente agarosio in un becher contenente il 50% di EtOH in acqua deionizzata. Coprire il becher con parafilm per evitare l'evaporazione dell'EtOH.
      NOTA: il volume del becher dipende dal numero di cassette.
    10. Elaborare i campioni in un processore di tessuti durante la notte.
      NOTA: poiché la paraffina si solidifica a RT, i seguenti passaggi devono essere eseguiti rapidamente.
    11. Preriscaldare un blocco riscaldante nella postazione di lavoro di incorporamento per 15 minuti.
    12. Rimuovere il gel di agarosio contenente organoidi racchiuso nella cassetta e posizionarlo nel blocco riscaldante preriscaldato. Rimuovere il tappo dalla cassetta e metterlo da parte per un uso successivo.
    13. Riempire il blocco riscaldante rimanente con paraffina.
      NOTA: Verificare con una pinzetta se il gel di agarosio contenente organoidi si trova ancora nella parte inferiore del blocco riscaldante. A causa della sua leggerezza, potrebbe iniziare a galleggiare, con conseguente perdita del campione.
    14. Posizionare il tappo della cassetta sulla parte superiore del blocco riscaldante. Lasciare solidificare per 30 minuti su un piatto freddo. Rimuovere il blocco riscaldante e conservare i blocchi di paraffina a 4 °C.

8. Sezionamento microtomo e colorazione degli organoidi dentali (Figura 2B e Figura 3A-C)

  1. Sezionamento microtomatico di blocchi di paraffina contenenti organoidi
    1. Affettare sezioni di 5 μm degli organoidi dentali nei blocchi di paraffina usando un microtomo.
    2. Posizionare le fette di paraffina sopra un vetrino per microscopio. Posizionare il vetrino del microscopio su una piastra calda a 37 °C e coprirlo con acqua deionizzata utilizzando un pipetto Pasteur.
    3. Lasciare asciugare il vetrino del microscopio durante la notte.
  2. Colorazione delle sezioni organoidi dei denti
    1. Deparaffinizzare le sezioni organoidi (sul vetrino del microscopio) in forno per 1 ora a 58 °C.
    2. Reidratare le sezioni organoidiche (sul vetrino del microscopio) in serie EtOH decrescente all'interno della cappa chimica nel seguente ordine:
      Xilene 2x per 3 min ciascuno
      100% EtOH 2x per 3 min ciascuno
      95% EtOH 2x per 3 minuti ciascuno
      90% EtOH 2x per 3 min ciascuno
      70% EtOH 3x per 3 min ciascuno
      ATTENZIONE: Utilizzare la cappa chimica quando si lavora con xilene.
    3. Risciacquare il vetrino del microscopio in acqua di rubinetto per 5 minuti a RT. Quindi, risciacquare in PBS per 5 minuti a RT.
    4. Eseguire il recupero dell'antigene posizionando le sezioni organoidi (sul vetrino del microscopio) in un tampone citrato preriscaldato (10 mM di acido citrico in acqua deionizzata con pH 6; in un contenitore di plastica; preriscaldato per 10 minuti in un bagno d'acqua a 95 °C) per 30 minuti in un bagno d'acqua a 95 °C.
    5. Lasciare raffreddare il vetrino del microscopio per 20 minuti a RT. Risciacquare il vetrino del microscopio in PBS per 5 minuti a RT, quindi in PBS contenente lo 0,1% di Triton-X (PBT) per 5 minuti a RT.
    6. Utilizzare una penna di marcatura per creare una barriera idrofoba ai bordi di ogni diapositiva.
    7. Blocco per un minimo di 1 ora a RT in tampone bloccante (contenente 1,5 mg/mL di glicina, 2 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA) disciolta in PBT) più il 10% di siero d'asino.
      NOTA: In genere, sono necessari 300 μL di tampone di blocco più il 10% di siero d'asino per vetrino del microscopio.
    8. Posizionare il vetrino del microscopio in una camera umida. Utilizzare una scatola ermetica in cui tutti i vetrini si adattano e bagnare alcuni fazzoletti di carta con acqua da posizionare sul fondo della scatola. Ciò impedirà alle diapositive di asciugarsi durante le successive fasi di colorazione.
    9. Rimuovere il tampone bloccante, aggiungere l'anticorpo primario (Tabella 6) preparato in tampone bloccante più siero d'asino all'1% e incubare il vetrino coperto con soluzione anticorpale durante la notte nella camera umida a 4 °C. Se necessario, rifare il bordo della penna di marcatura.
    10. Lavare il vetrino del microscopio tre volte in PBT a RT per 10 minuti con una miscelazione delicata su uno shaker orbitale (75-150 giri / min).
    11. Aggiungere l'anticorpo secondario (Tabella 6), preparato in tampone bloccante più l'1% di siero d'asino, e incubare per 1 ora nella camera umida a RT.
    12. Rimuovere il tampone di blocco e lavare il vetrino del microscopio tre volte in PBT a RT per 10 minuti con una miscelazione delicata su uno shaker orbitale.
    13. Aggiungere il mezzo di montaggio antideflagrante con DAPI (da 1 a 3 goccioline) su un coperchio di vetro e montarlo sopra le sezioni organoidiche (sul vetrino del microscopio). Procedere con l'imaging; conservare le diapositive per un massimo di 1 settimana a 4 °C.

9. Estrazione dell'RNA e RT-qPCR degli organoidi dentali (Figura 2B e Figura 3D)

  1. Estrazione dell'RNA degli organoidi dentali
    1. Rimuovere il mezzo da ciascun pozzetto (passaggio 4.2).
    2. Raccogliere gli organoidi spostando la goccia BMM (fase 4.3), trasferire la miscela organoide BMM in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 4 °C.
    3. Rimuovere il surnatante, risospesare vigorosamente in 350 μL di β-mercaptoetanolo all'1% disciolto in tampone di lisi (Tabella dei materiali) e mettere su ghiaccio.
      ATTENZIONE: Eseguire tutti i passaggi con β-mercaptoetanolo in un cappuccio chimico.
      NOTA: i campioni possono essere conservati in questa fase per un massimo di 1 mese a -80 °C. Scongelare i campioni sul ghiaccio prima di procedere con il punto 9.1.4.
    4. Vortice i campioni fino a quando non si osservano più strutture organoidi.
    5. Procedere con l'estrazione dell'RNA utilizzando il kit di estrazione dell'RNA (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
  2. RT-qPCR degli organoidi dentali (Tabella 7)
    1. Trascrivere inversamente (RT) l'RNA19 utilizzando il kit di trascrizione inversa (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
    2. Analizzare i campioni di cDNA risultanti con la PCR quantitativa (qPCR) basata su SYBR Green19 utilizzando un sistema PCR in tempo reale (Tabella dei materiali).

Risultati

Sviluppo organoide dentale
Forniamo un protocollo dettagliato per stabilire colture organoidi da tessuto DF umano acquisito dopo l'estrazione del dente del giudizio (Figura 1A). Il DF isolato è dissociato enzimaticamente e meccanicamente. Le cellule ottenute vengono coltivate all'interno di BMM in mezzi che sono stati definiti empiricamente per lo sviluppo e la crescita ottimale degli organoidi (mezzo organoide dentale; TOM)19.

Discussione

Questo protocollo descrive la generazione efficiente e riproducibile di organoidi a partire dal dente umano. Per quanto ne sappiamo, questa è la prima metodologia per stabilire organoidi di concetto corrente (epiteliali) a partire dal tessuto dentale umano. Gli organoidi sono espandibili a lungo termine e mostrano un fenotipo di staminalità epiteliale dentale, duplicando i DESC precedentemente riportati nel compartimento ERM del DF7. Inoltre, gli organoidi replicano le caratteristiche funzionali...

Divulgazioni

L'autore corrispondente garantisce che tutti gli autori abbiano divulgato tutti i conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Siamo grati a tutti i membri dello staff della Chirurgia Orale e Maxillo-Facciale (MKA) di UZ Leuven, così come ai pazienti, per il loro inestimabile aiuto nella raccolta dei terzi molari appena estratti. Vorremmo anche ringraziare la dott.ssa Reinhilde Jacobs e la dott.ssa Elisabeth Tijskens per il loro aiuto nella raccolta dei campioni. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di KU Leuven (BOF) e FWO-Flanders (G061819N). L.H. è un FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Microcentrifuge tubeEppendorf30120.086
15 mL Centrifuge tubeCorning430052
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM-6250
48-well flat bottom platesCorning3548
50 mL Centrifuge tubeCorning430290
A83-01Sigma-AldrichSML0788
AgaroseLonza50004
Albumin Bovine (cell culture grade)Serva47330.03
AMELX antibodySanta Cruzsc-365284
Amphotericin BGibco15200018
B27 (without vitamin A)Gibco12587-010
CassetteVWR7202191
Catalase from bovine liverSigma-AldrichC100
CD44 antibodyAbcamab34485
Cell strainer, 40 µmFalcon352340
Cholera ToxinSigma-AldrichC8052
Citric acidSigma-AldrichC0759
CK14 antibodyThermo Fisher ScientificMA5-11599
Collagenase IVGibco17104-019
Cover glassVWR6310146
CryoboxThermo Scientific5100-0001
CryovialThermo Fisher Scientific375353
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dispase IISigma-AldrichD4693
DMEM 1:1 F12 without FeInvitrogen074-90715A
DMEM powder high glucoseGibco52100039
DnaseSigma-AldrichD5025-15KU
Donkey serumSigma-AldrichD9663 - 10ML
Embedding workstation, 220 to 240 VacThermo Fisher Scientific12587976
Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH)Fisher ChemicalE/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF7524
FGF10Peprotech100-26
FGF2 (= basic FGF)R&D Systems234-FSE-025
FGF8PeprotechAF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep KitSigma-AldrichRTN350-1KTIncludes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer
Glass Pasteur pipetteNiko Mechanisms170-40050
GlycineVWR101194M
HEPESSigma-AldrichH4034
IGF-1PeproTech100-11
InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI)Sigma-Aldrich688001
Insulin from bovine pancreasSigma-AldrichI6634
ITGA6 antibodySigma-AldrichHPA012696
L-GlutamineGibco25030024
Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free)Corning15505739
Microscope slideThermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μmMilliporeSLGV033R
Minimum essential medium eagle (αMEM)Sigma-AldrichM4526
mouse IgG (Alexa 555) secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-31570
N2Gibco17502-048
N-acetyl L-cysteineSigma-AldrichA7250
NicotinamideSigma-AldrichN0636
NogginPeproTech120-10C
P63 antibodyAbcamab124762
Pap PenSigma-AldrichZ377821-1EAMarking pen
Paraformaldehyde (PFA), 16%Merck8.18715
Penicillin G sodium saltSigma-AldrichP3032
Penicillin-streptomycin (Pen/Strep)Gibco15140-122
Petri dishCorning353002
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010-015
Pipette (P20, P200, P1000)Eppendorf or others2231300006
Plastic transfer pipette (3.5 mL)Sarstedt86.1171.001
Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibodyThermo Fisher ScientificA21206
RSPO1PeproTech120-38
SB202190 (p38i)Biotechne (Tocris)1264
Scalpel (surgical blade)Swann-Morton207
SHHR&D Systems464-SH-200
Silicone molds (Heating block)VWR720-1918
Sodium Chloride (NaCl)BDH102415K
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)Merck106329
Sodium-pyruvate (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP-5280
SOX2 antibodyAbcamab92494
StepOnePlusThermo Fisher ScientificReal-Time PCR System
Stericup-GP, 0.22 µmMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μmMilliporeSCGP00525
Sterile 1000 μL pipette tips with filterGreiner740288
Sterile 20 μL pipette tips with filterGreiner774288
Sterile 200 μL pipette tips with and without filterGreiner739288
Sterile H2OFreseniusB230531
Streptomycin sulfate saltSigma-AldrichS6501
Superscript III first-strand synthesis supermixInvitrogen11752-050Reverse transcription kit
Tissue processorThermo Scientific12505356
TransferrinServa36760.01
Triton X-100SigmaT8787-50ML
TrypLE expressGibco12605-010
Vectashield mounting medium+DAPILabconsult NVH-1200Antifade mounting medium with DAPI
WNT3aBiotechne (Tocris)5036-WN-500
Xylenes, 99%, for biochemistry and histologyVWR2,89,75,325

Riferimenti

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