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Resumo

Apresentamos um protocolo para desenvolver culturas organoides epiteliais a partir do dente humano. Os organoides são robustamente expansíveis e recapitulam as células-tronco epiteliais do dente, incluindo sua capacidade de diferenciação de ameloblast. O modelo organoide único fornece uma ferramenta promissora para estudar a biologia dentário humano (células-tronco) com perspectivas para abordagens regenerativas dentárias.

Resumo

Os dentes são de fundamental importância na vida não só para a mastigação alimentar e a fala, mas também para o bem-estar psicológico. O conhecimento sobre desenvolvimento dentário humano e biologia é escasso. Em particular, pouco se sabe sobre as células-tronco epiteliais do dente e sua função. Conseguimos desenvolver um novo modelo organoide a partir do tecido dentário humano (ou seja, folículo dentário, isolado dos dentes do siso extraído). Os organoides são robustos e expansíveis a longo prazo e recapitulam o compartimento de células-tronco do dente humano proposto em termos de expressão de marcador, bem como atividade funcional. Em particular, os organoides são capazes de desdobrar um processo de diferenciação ameloblast como ocorre in vivo durante a amelogênese. Este modelo organoide único fornecerá uma ferramenta poderosa para estudar não apenas o desenvolvimento dentário humano, mas também a patologia dentária, e pode abrir caminho para a terapia regenerativa dentária. Substituir dentes perdidos por um dente biológico baseado neste novo modelo organoide pode ser uma alternativa atraente para a implantação padrão atual de materiais sintéticos.

Introdução

Os dentes têm papéis essenciais na mastigação alimentar, fala e bem-estar psicológico (autoimagem). O dente humano consiste em tecidos altamente mineralizados de densidade e durezavariadas 1. O esmalte dentário, o principal componente da coroa dentária, é o tecido mineralizado mais alto do corpo humano. Durante a formação do esmalte (amelogênese), quando os dentes se desenvolvem, as células-tronco epiteliais dentárias (DESCs) se diferenciam em células formadoras de esmalte (ameloblasts). Uma vez formado, o esmalte raramente é reparado ou renovado devido à perda apoptótica dos ameloblastas no início da erupção dentária1. A restauração do tecido esmalte danificado, causado por trauma ou doença bacteriana, é atualmente realizada com materiais sintéticos; no entanto, estes são incomodados com deficiências importantes como microleakage, osseointegração e ancoragem inferiores, vida útil finita e falta de reparo totalmente funcional2. Assim, uma cultura robusta e confiável de DESCs humanos com capacidade para gerar ameloblasts e potencial para produzir tecido mineralizado seria um grande avanço no campo regenerativo dental.

O conhecimento sobre fenótipo e função biológica do DESC humano são escassos 3,4,5. Curiosamente, foram propostos DESCs de dentes humanos para existir nos Repousos de Célula Epitelial de Malassez (ERM), aglomerados celulares presentes dentro do folículo dentário (DF), que circunda dentes não rompidos, e permanece presente no ligamento periodontal ao redor da raiz uma vez que o dente entra em erupção1. Células ERM co-cultivadas com polpa dentária foram encontradas para se diferenciar em células semelhantes ao ameloblast e gerar tecido semelhante ao esmalte6. No entanto, estudos profundos sobre o papel específico das células ERM na geração de esmalte (re-) foram limitados devido à falta de modelos de estudo confiáveis7. Os sistemas atuais de cultura in vitro ERM são dificultados pela vida útil limitada e perda rápida de fenótipo nas condições 2D usadas standardmente 8,9,10,11,12. Assim, é fortemente necessário um sistema in vitro tratável para expandir, estudar e diferenciar deSCs humanos.

Durante a última década, uma técnica poderosa para cultivar células-tronco epiteliais in vitro foi aplicada com sucesso a vários tipos de tecidos epiteliais (humanos) para estudar sua biologia, bem como a doença 13,14,15,16. Essa tecnologia permite que as células-tronco epiteliais do tecido se auto-desenvolvam em construções de células 3D (ou seja, organoides) quando semeadas em uma matriz extracelular (ECM) -imitando andaimes (tipicamente, Matrigel) e cultivadas em um meio definido replicando a sinalização do nicho de células-tronco do tecido e/ou embriogênese. Os fatores típicos de crescimento necessários para o desenvolvimento organoide incluem fator de crescimento epidérmico (EGF) e ativadores de integração MMTV do tipo wingless (WNT) 14,15,16. Os organoides resultantes são caracterizados pela fidelidade duradoura na imitação das células-tronco epiteliais originais do tecido, bem como alta expansão, mantendo seu fenótipo e propriedades funcionais, superando assim a disponibilidade de tecido humano primário muitas vezes limitada como adquirido da clínica. Para estabelecer organoides, o isolamento das células-tronco epitelial do tecido heterogêneo (ou seja, compreendendo outros tipos de células, como células mesenquimais) antes da cultivo não é necessário, pois as células mesenquimais não se ligam ou prosperam no ECM, eventualmente resultando em organoides puramente epiteliais 13,16,17,18,19 . Esta tecnologia promissora e versátil levou ao desenvolvimento de modelos organoides múltiplos de vários tecidos epiteliais humanos. No entanto, os organoides derivados do dente humano, valiosos para o estudo profundo do desenvolvimento dentário, regeneração e doenças, ainda não foram estabelecidos20,21. Recentemente conseguimos desenvolver um novo modelo organoide a partir do tecido DF a partir de terceiros molares (dentes do siso) extraídos de pacientes adolescentes19.

Aqui, descrevemos o protocolo para desenvolver culturas organoides epiteliais a partir do dente humano adulto (ou seja, do DF do terceiro molar) (Figura 1A). Os organoides resultantes expressam marcadores de haste associados ao ERM, sendo expansíveis a longo prazo. Curiosamente, ao contrário da maioria dos outros modelos organoides, o EGF tipicamente necessário é redundante para o desenvolvimento e crescimento organoide robusto. Curiosamente, os organoides de caule apresentam propriedades de diferenciação de ameloblast, imitando características e processos do ERM/DESC que ocorrem in vivo. O novo e único modelo organoide descrito aqui permite explorar a biologia, plasticidade e capacidade de diferenciação do DESC e abre as portas para dar os primeiros passos em direção a abordagens regenerativas dentárias.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética de Pesquisa UZ/KU Leuven (13/0104U). Os terceiros molares extraídos (dentes do siso) foram obtidos após o consentimento informado dos pacientes.

1. Preparativos

  1. Pré-aquecimento uma placa de cultura de 48 poços para 15-20 h em uma incubadora de CO2 de 1,9% a 37 °C.
  2. Liquefazer uma alíquota de Matrigel (fator de crescimento reduzido; livre de fenol; ainda mais referida como matriz de membrana do porão; BMM) no gelo (4 °C) pela mínima de 2h antes da etapa 2.1.
    NOTA: Evite ciclos de congelamento/degelo do BMM. Liquefafique o BMM por 15-20 h no gelo e aliquot a 1 mL em tubos de microcentrifusagem e armazene a -20 °C.
  3. Esfrie a centrífuga a 4 °C.
  4. Prepare a mídia e filtre a solução através de um filtro de 0,22 μm. Os volumes a seguir baseiam-se na coleta dos DFs de todos os quatro molares de três terços tipicamente extraídos simultaneamente.
    1. Prepare 20 mL de meio de coleta df (Tabela 1): águia média essencial mínima (αMEM) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), 0,5% Amphotericina B e 1% penicilina-estreptomicina. Transfira 4 mL de médio de coleta df para um tubo de 15 mL e transfira os tubos no gelo.
      NOTA: Um tubo de 15 mL é suficiente por paciente para coleta de amostras (ou seja, para quatro molares de quatro terços).
    2. Fazer 20 mL de meio organoide dentário (ainda chamado de TOM; Tabela 2) utilizando meio definido sem soro (SFDM; Tabela 3). Armazene TOM a 4 °C durante a máxima de 2 semanas.
    3. Prepare 8 mL de meio de dissociação (Tabela 4), ou seja, salina tamponada com fosfato (PBS) contendo colagenase VI (3 mg/mL ) e dispase II (4 mg/mL). Pré-aquecimento do meio de dissociação em um banho de água de 37 °C por pelo menos 10 minutos antes do uso e transfira-o para dois tubos de 15 mL (4 mL por tubo) para dissociar quatro tecidos DF.
    4. Prepare uma placa de lavagem (12-bem) contendo: três poços com 70% de EtOH, três poços com PBS e três poços com meio de coleta DF.
    5. Fazer 15 mL de média A por amostra (ou seja, 5 mL por dois DFs por paciente; Tabela 5).
      NOTA: As seguintes etapas devem ser realizadas em condições estéreis.

2. Dissociação do folículo dental

  1. Uma vez que os terceiros molares com DFs associados são coletados no meio de coleta (no gelo), transfira o conteúdo dos tubos para uma placa de Petri.
  2. Segure o dente com uma pinça e isole cuidadosamente o DF usando uma lâmina cirúrgica.
    NOTA: Esta etapa requer prática; tenha cuidado com a lâmina.
  3. Para lavar o sangue restante dos DFs, coloque os tecidos DF brevemente no primeiro poço de 70% EtOH (placa de lavagem) para 20 s, e depois transfira para o próximo EtOH bem para 20 s, e ainda mais para o terceiro Poço EtOH (máximo de 1 min em 70% EtOH no total; maior tempo de incubação resultará em viabilidade celular reduzida).
  4. Em seguida, continue enxaguando nos três poços pbs (máximo 2 min no total).
  5. Enxágüe os DFs nos três poços médios de coleta do DF restantes (até um máximo de 20 min no total).
  6. Transfira os DFs enxaguados para uma nova placa de Petri.
  7. Corte um pequeno pedaço de um dos DFs (~5 mm2) para fixação de paraformaldeído (PFA) (ver seção 7) e armazene-o no gelo (por um máximo de 6 h) em um tubo de microcentrifuuge contendo 500 μL de meio de coleta de DF até a fixação do PFA.
  8. Pique o resto dos DFs em pequenos pedaços (~1 mm2).
    NOTA: É aconselhável processar imediatamente os tecidos DF recém-isolados para a formação organoide ideal e eficiência de crescimento, em vez de partir de tecido criopreservado, o que resulta em menor eficiência. No entanto, é possível criopreservar tecido DF primário nesta etapa (ver meio criopreservação e protocolo na seção 5).
  9. Transfira os DFs picados para um tubo de 15 mL contendo 4 mL de meio de dissociação pré-armado e incubar em um banho de água de 37 °C por 2h.
    NOTA: Adicione dois DFs por meio de dissociação pré-armado de 4 mL (um tubo) para garantir uma dissociação ideal.
  10. A cada 15 minutos, pipet o meio de dissociação DF mistura para cima e para baixo usando um cano pasteur de vidro para acelerar a desintegração do tecido. Quando as peças df não forem mais observadas (geralmente após 1h), prossiga com a dissociação do DF usando uma tubulação pasteur polida com fogo estreita.
    NOTA: Para a dissociação ótima do DF, mude para uma tubulação Pasteur estreitada pelo polimento de fogo no máximo 1h de isolamento df.
    1. Enquanto isso, prepare 10 mL de médio A contendo 50 μL de DNase (0,2 mg/mL; Tabela 5).
  11. Adicione 5 mL de médio A (contendo o DNase) a cada tubo com DF dissociado, e incubar por 1 min a temperatura ambiente (RT).
  12. Filtre a suspensão celular (contendo células únicas e aglomerados de células pequenas) através de um coador de células de 40 μm para remover os fragmentos grandes restantes e (a maioria) do tecido fibroso.
    1. Combine os vários tubos com DF dissociado de um paciente nesta etapa.
  13. Enxágüe o filtro com 1 mL de média A. Centrifugar a suspensão da célula filtrada a 200 x g por 10 min a 4 °C.
  14. Remova o supernatante, resuspenja a pelota em 1 mL de SFDM (Tabela 3) e transfira a suspensão da célula para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.
  15. Calcule a concentração celular usando um contador celular automatizado. Negligencie as células que permanecem.
  16. Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C.

3. Estabelecimento da cultura organoide dentária (Figura 1A e Figura 2A)

  1. Com base no número de celular obtido, calcule o número de poços que podem ser semeados. Uma gotícula de 20 μL deve conter 20.000 células. A mistura final é composta de suspensão celular e BMM em uma proporção de 30:70.
  2. Remova a quantidade apropriada de supernascer e resuspend em BMM gelado para obter uma proporção de 70:30 de BMM: suspensão celular para chapeamento. Por exemplo, quando 200.000 células são obtidas, placa 10 gotículas de 20 μL. Assim, remova o supernascer até que 60 μL da suspensão celular seja deixado, adicione 140 μL de BMM gelado e resuspend.
    1. Resuspend lentamente para evitar a formação de bolhas de ar. Uma vez resuspendido em BMM, mantenha o tubo de microcentrífuga no gelo.
      NOTA: Manter o tubo de microcentrífuga no gelo é crucial para evitar a solidificação do BMM.
  3. Pipetar as gotículas BMM de 20 μL no centro dos poços da placa de cultura pré-aquecido de 48 poços.
  4. Vire a placa de cabeça para baixo, coloque-a em uma incubadora de CO2 de 1,9% (% CO2 de acordo com o buffer SFDM), e deixe-a solidificar por pelo menos 20 min a 37 °C.
  5. Adicione o inibidor rock (RI; 10 μM) e a anfotericina B (0,1%) ao TOM e pré-aquecimento do meio em um banho de água de 37 °C.
    NOTA: A anfotericina B é sensível à luz.
  6. Pegue a placa de 48 poços da incubadora, coloque na vertical e adicione 250 μL do meio pré-armado preparado para cada poço com gotícula/células BMM e devolva a placa para a incubadora de CO2 1,9%.
  7. Para refrescar o meio (de preferência a cada 2-3 dias), incline a placa de 48 poços em um ângulo de 45°, remova suavemente o meio anterior, evitando tocar na goteta BMM e adicione 250 μL de novo meio TOM pré-armado.
    NOTA: Recomenda-se atualizar pelo menos três vezes por semana para evitar o esgotamento dos principais nutrientes e fatores de crescimento. A RI só precisa ser adicionada ao TOM na semeadura inicial e nos primeiros dias de cada passagem (ver seção 4) para prevenir a morte celular por anoikis e melhorar o crescimento organoide. A anfotericina B só é adicionada ao meio durante a passagem 0 (P0) para bloquear uma possível contaminação fúngica.

4. Amplificação e passagem da cultura organoide dentária (Figura 1B e Figura 2B)

  1. Passagem dos organoides entre 10 e 14 dias de cultura.
    NOTA: Evite cultivar por um período mais longo, pois a cultura prolongada pode limitar o crescimento organoide e a passabilidade. Somente no desenvolvimento inicial (P0) os organoides podem ser cultivados por até 20 dias, dependendo de sua taxa de crescimento (até que o máximo ± 200 μm de diâmetro seja atingido).
  2. Remova o meio dos poços com organoides que precisam ser passagemdos. Dentro de uma condição de cultura, acumule até quatro poços confluentes (ver Figura 2C).
  3. Para coletar os organoides, adicione 400 μL de SFDM gelado por poço diretamente na gotícula BMM e encolha repetidamente o meio para cima e para baixo até que toda a gotícula BMM seja desalojada.
    1. Caso os poços estejam sendo agrupados, transfira os 400 μL do primeiro poço para o próximo (e assim por diante) para desalojar as gotículas BMM contendo organoides de todos os poços que precisam ser agrupados.
  4. Transfira o conjunto BMM-organóide desalojado para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e repita o passo 4.3 novamente até que todas as estruturas organoides sejam coletadas dos poços.
  5. Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C.
  6. Pré-aquecimento um aliquot de TrypLE Express (complementado com RI a 5 μM) em um banho de água de 37 °C. Por tubo de microcentrifuge de organoides, é necessário um volume de 400 μL TrypLE Express.
  7. Após a centrifugação, remova o supernasce e resuspense a pelota em 400 μL de TrypLE. Incubar a suspensão em um banho de água de 37 °C por 12 minutos.
  8. Adicione 400 μL de SFDM gelado para inativar a enzima e centrífuga a 200 x g por 5 min a 4 °C. Remova o supernatante.
  9. Pré-revesse uma dica (para obter volume veja abaixo) com SFDM gelado e resuspenque a pelota organoide.
    1. Para evitar a perda organoide, reumuada a mesma ponta (pré-revestida) o máximo possível sem comprometer a esterilidade.
      NOTA: O volume de SFDM necessário para o ressusufetador da pelota depende do número de estruturas organoides obtidas e do número de passagem atual.
    2. Como regra geral, para passagens, P0 para P2-3 (geralmente ainda crescendo um número baixo de organoides) usam um volume de 200 μL SFDM. A partir de passagens, P3-4 ou superior (geralmente produzindo um número maior de organoides) usam um volume de 700 μL de SFDM.
      NOTA: Ambos os procedimentos são chamados de métodos de "passagem baixa" e "passagem mais alta", respectivamente (ver as etapas 4.10 e 4.11). Aplicar corretamente os métodos distintos é crucial para uma passagem eficiente dos organoides. Com o método de passagem mais elevado, os organoides são mais facilmente perdidos e não devem ser aplicados a baixo número de organoides (ou seja, em P0 a P2-3). No entanto, o método de passagem mais elevado é necessário para dissociar eficientemente grandes quantidades de organoides.
  10. Método de passagem baixa: Resuspend a pelota em 200 μL de SFDM gelado. Empurre a ponta da tubulação completamente esvaziada contra a parte inferior do tubo de microcentrífuga para reduzir seu diâmetro. Verifique se o diâmetro é pequeno o suficiente (aspiração mais lenta, fluxo é distorcido, mas não bloqueado). Encolé-lo para cima e para baixo por 5 minutos para interromper mecanicamente os organoides.
  11. Método de passagem mais alto: Resuspend a pelota em 700 μL de SFDM gelado com uma ponta P1000. Adicione uma ponta P200 (sem filtro) em cima desta ponta P1000 e pré-casaco com SFDM gelado. Evite a formação de bolhas de ar ajustando a configuração de volume da tubulação, a fim de aspirar pelo menos 90% do volume médio (com organoides). Encolé-lo para cima e para baixo por 5 minutos para interromper mecanicamente os organoides.
  12. Verifique sob o microscópio de luz (a 4x de ampliação) se principalmente células únicas com (apenas) algumas estruturas não desoperadas são obtidas.
  13. Adicione 500 μL de SFDM gelado ao tubo de microcentrifuuge e misture suavemente a mistura de células dissociadas com o SFDM fresco por pipetação.
  14. Deixe grandes estruturas não desoperadas sedimentares por 10 minutos colocando verticalmente o tubo de microcentrifuuge no gelo.
    NOTA: É necessário remover as estruturas não desempísparadas porque elas influenciam negativamente a passibilidade organoide. Para a iniciação organoide (P0), essa etapa de sedimentação não é necessária.
  15. Coletar o supernante (~500-1.000 μL dependendo do método de passagem) contendo células únicas e pequenos aglomerados celulares; transferir para um novo tubo de microcentrifuuge, e centrífuga a 190 x g por 10 min a 4 °C.
  16. Calcule a concentração celular usando um contador celular automatizado. Negligencie as células que permanecem.
  17. Conte quantos poços podem ser semeados e calcule a razão de suspensão celular/BMM apropriada conforme descrito acima (seção 3).
  18. Adicione 70% de BMM à pelota celular e mantenha o tubo de microcentrífuga no gelo.
    NOTA: É crucial manter o tubo de microcentrifuuge no gelo para evitar a solidificação do BMM.
  19. Prossiga com a etapa 3.3 até 3.7 e volte a passar entre o dia 10 e o dia 14 da cultura.

5. Criopreservação de organoides dentários

  1. Coletar e dissociar os organoides como mencionado acima para a passagem (passo 4). Centrifugar a suspensão celular a 200 x g por 5 min a 4 °C.
  2. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 1 mL de criopreservação contendo SFDM (70%), FBS (20%) e DMSO (10%).
  3. Transfira a suspensão para um criovial e coloque-a no gelo. Coloque os criovias em uma caixa de criogenia e transfira para -80 °C (por pelo menos 4 h).
  4. Dentro de 1 mês, transfira as amostras congeladas para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo (> 12 meses).

6. Descongelamento de organoides dentários criopreservados

  1. Antes de iniciar o procedimento de descongelamento, coloque um tubo de 15 mL por criovial no gelo contendo 10 mL de SFDM com 20% de FBS.
  2. Remova o criovial do nitrogênio líquido e coloque-o no gelo.
    NOTA: Realize as seguintes etapas o mais rápido possível e evite tempo de descongelamento muito longo (>5 min) bem como intervalos muito longos entre os passos (>5 min), pois tal prolongamento diminuirá a sobrevida celular.
  3. Coloque o criovial em um banho de água morna (37 °C) até descongelar (~1-2 min).
  4. Transfira imediatamente o conteúdo do criovial para o tubo gelado de 15 mL e centrífuga a 200 x g por 5 min a 4 °C.
  5. Remova 9 mL do supernaspe e centrifule os 1 mL restantes a 200 x g por 5 min a 4 °C. Retire o supernatante e lave a pelota com SFDM gelado de 1 mL.
  6. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e conte as células usando um contador celular automatizado.
  7. Conte quantos poços podem ser semeados e calcule a razão de suspensão celular/BMM apropriada conforme descrito acima (seção 3).
  8. Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C. Resuspenque a pelota em uma proporção de 70:30 de BMM:TOM e mantenha no gelo.
  9. Prossiga com a etapa 3.3 até 3.7 e passagem entre o dia 10 e o dia 14 da cultura.

7. Fixação e incorporação de organoides dentários

NOTA: Este procedimento (incluindo as seções 8 e 9) também pode ser aplicado ao tecido df primário.

  1. Fixação de organoides dentários em PFA
    1. Remova o meio de cada um, bem como na etapa 4.2.
    2. Coletar os organoides desalojando a gotícula BMM (etapa 4.3). Transfira a mistura BMM-organoid para um tubo de microcentrífa de 1,5 mL.
    3. Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C.
    4. Remova o supernasal e adicione 500 μL de 4% pfa e incubar por um mínimo de 30 min (máximo 1 h) em RT com mistura suave em um agitador orbital.
      ATENÇÃO: Use a coifa química ao trabalhar com PFA.
    5. Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C. Remova o supernatante e enxágue a pelota organoide com PBS por 10 minutos no RT com agitação suave.
    6. Lave a pelota organoide (passo 7.1.5) duas vezes adicionais. Gire os organoides fixos a 200 x g por 5 min a 4 °C.
    7. Resuspense a pelota em 500 μL de 70% EtOH (em água deionizada). Armazene os organoides por até 1 mês em 70% EtOH a 4 °C.
  2. Agarose e parafina-incorporação de organoides dentários
    NOTA: Para incorporar eficientemente organoides em parafina, é necessário um passo adicional de incorporação em agarose.
    1. Centrifugar os organoides fixos pfa em 70% EtOH a 200 x g por 5 min a 4 °C. Remova o supernatante.
    2. Prepare uma solução de 2% de agarose em 30 mL de PBS em uma garrafa de vidro. Aqueça a mistura agarose-PBS em um micro-ondas até que uma estrutura semelhante a gel seja observada (aproximadamente 2,5 min a 600 W).
    3. Em paralelo, adicione 30 mL de PBS a outra garrafa de vidro e aqueça no micro-ondas (aproximadamente 2,5 min a 600 W). Deixe a solução agarose esfriar por 1 min.
    4. Corte a ponta de uma ponta P200 para permitir trabalhar com a solução agarose com precisão e para evitar bolhas de ar.
    5. Pré-aqueça a ponta P200 no PBS quente, pipetting para cima e para baixo algumas vezes.
    6. Adicione 150 μL de solução de agarose pré-armada à pelota organoide e encobre suavemente a mistura organóide-agarose (com resuspensão mínima) evitando bolhas de ar.
      NOTA: A ressuspensão mínima permitirá melhor localizar os organoides no gel de agarose na seção de microtoma, uma vez que os organoides estão então mais próximos um do outro.
    7. Transfira imediatamente a mistura organóide-agarose para a mesma tampa do tubo de microcentrifuuge, coloque o tubo horizontalmente e deixe a agarose solidificar (~20 min em RT). Enquanto isso, rotule as fitas.
    8. Uma vez solidificado, remova o gel de agarose da tampa de microcentrifuuge usando uma pinça e transfira-o para um rotulado.
    9. Transfira o contendo agarose para um béquer contendo 50% de EtOH em água desionizada. Cubra o béquer com parafilm para evitar a evaporação do EtOH.
      NOTA: O volume do béquer depende do número de.
    10. Processe as amostras em um processador de tecido durante a noite.
      NOTA: À medida que a parafina se solidifica na RT, as seguintes etapas devem ser executadas rapidamente.
    11. Pré-aqueça um bloco de aquecimento na estação de trabalho de incorporação por 15 minutos.
    12. Remova o gel de agarose contendo organoides no e coloque-o no bloco de aquecimento pré-enlatado. Retire a tampa do e coloque-a de lado para uso posterior.
    13. Encha o bloco de aquecimento restante com parafina.
      NOTA: Verifique com uma pinça se o gel de agarose contendo organoides ainda está localizado na parte inferior do bloco de aquecimento. Devido ao seu leve, ele pode começar a flutuar, resultando em perda de amostra.
    14. Coloque a tampa do em cima do bloco de aquecimento. Deixe-o solidificar por 30 minutos em uma placa fria. Retire o bloco de aquecimento e armazene os blocos de parafina a 4 °C.

8. Secção de microtoma e coloração de organoides dentários (Figura 2B e Figura 3A-C)

  1. Secção de microtoma de blocos de parafina contendo organoides
    1. Corte 5 μm seções dos organoides dentários nos blocos de parafina usando um microtome.
    2. Coloque as fatias de parafina em cima de um deslizamento de vidro microscópio. Coloque o deslizamento de vidro do microscópio em uma placa quente a 37 °C e cubra-o com água deionizada usando uma tubulação Pasteur.
    3. Deixe o vidro do microscópio deslizar durante a noite.
  2. Manchas de seções organoides dentárias
    1. Desparafinar as seções organoides (no deslizamento de vidro do microscópio) em um forno por 1h a 58 °C.
    2. Reidratar as seções organoides (no deslizamento de vidro do microscópio) na diminuição da série EtOH dentro da capa química na seguinte ordem:
      Xileno 2x por 3 min cada
      100% EtOH 2x por 3 min cada
      95% EtOH 2x por 3 min cada
      90% EtOH 2x por 3 min cada
      70% EtOH 3x por 3 min cada
      ATENÇÃO: Use a coifa química ao trabalhar com Xileno.
    3. Enxágüe o deslizamento de vidro do microscópio na água da torneira por 5 minutos no RT. Em seguida, enxágüe-o em PBS por 5 min no RT.
    4. Realize a recuperação de antígenos colocando as seções organoides (no slide de vidro do microscópio) em tampão citrato pré-caçado (10 mM de ácido cítrico em água desionizada com pH 6; em um recipiente plástico; pré-armado por 10 minutos em um banho de água de 95 °C) por 30 minutos em um banho de água de 95 °C.
    5. Deixe o deslizamento de vidro do microscópio esfriar por 20 minutos na RT. Enxágue o deslizamento de vidro do microscópio em PBS por 5 minutos no RT e, em seguida, em PBS contendo 0,1% Triton-X (PBT) por 5 min na RT.
    6. Use uma caneta de marcação para criar uma barreira hidrofóbica nas fronteiras de cada slide.
    7. Bloqueie por um mínimo de 1 h no RT no buffer de bloqueio (contendo 1,5 mg/mL de glicina, 2 mg/mL de colmônio bovino (BSA) dissolvido em PBT) mais 10% de soro de burro.
      NOTA: Normalmente, 300 μL de tampão de bloqueio mais 10% de soro de burro é necessário por slide de vidro microscópio.
    8. Coloque o deslizamento de vidro do microscópio em uma câmara úmida. Use uma caixa hermética onde todos os slides se encaixam e molham alguns tecidos de papel com água para colocar na parte inferior da caixa. Isso evitará que os slides sequem durante as etapas subsequentes de coloração.
    9. Remova o tampão de bloqueio, adicione o anticorpo primário (Tabela 6) preparado no tampão de bloqueio mais 1% de soro de burro e incubar o slide coberto com solução de anticorpos durante a noite na câmara úmida a 4 °C. Refaça a borda da caneta de marcação, se necessário.
    10. Lave o deslizamento de vidro do microscópio três vezes em PBT na RT por 10 minutos com mistura suave em um agitador orbital (75-150 rpm).
    11. Adicione o anticorpo secundário (Tabela 6), preparado no tampão de bloqueio mais 1% de soro de burro, e incubar por 1h na câmara úmida da RT.
    12. Remova o tampão de bloqueio e lave o slide de vidro do microscópio três vezes em PBT em RT por 10 minutos com mistura suave em um agitador orbital.
    13. Adicione o meio de montagem antifado com DAPI (1 a 3 gotículas) em uma mancha de vidro e monte-o em cima das seções organoides (no slide de vidro do microscópio). Proceder com a imagem; armazenar slides para uma máxima de 1 semana a 4 °C.

9. Extração de RNA e RT-qPCR de organoides dentários (Figura 2B e Figura 3D)

  1. Extração de RNA de organoides dentários
    1. Retire o meio de cada poço (passo 4.2).
    2. Colete os organoides deslocando a gotícula BMM (etapa 4.3), transfira a mistura BMM-organóide para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e centrífuga a 200 x g por 5 min a 4 °C.
    3. Remova o supernasciente, resuspende vigorosamente em 350 μL de 1% β-mercaptoetanol dissolvido em tampão de lise (Tabela de Materiais), e coloque no gelo.
      ATENÇÃO: Realize todos os passos com β-mercaptoetanol em um capô químico.
      NOTA: As amostras podem ser armazenadas nesta etapa por até 1 mês a -80 °C. Descongele as amostras no gelo antes de prosseguir com a etapa 9.1.4.
    4. Vórtice as amostras até que nenhuma estrutura organoide seja observada mais.
    5. Proceda com a extração de RNA utilizando o kit de extração de RNA (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
  2. RT-qPCR de organoides dentários (Tabela 7)
    1. Transcrever inversa (RT) o RNA19 utilizando o kit de transcrição reversa (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Analise as amostras de CDNA resultantes com PCR quantitativo baseado em SYBR Green (qPCR)19 utilizando um sistema PCR em tempo real (Tabela de Materiais).

Resultados

Desenvolvimento organoide dentário
Fornecemos um protocolo detalhado para estabelecer culturas organoides a partir do tecido DF humano adquirido após a extração do dente do siso (Figura 1A). O DF isolado é enzimaticamente e mecanicamente dissociado. As células obtidas são cultivadas dentro da BMM em mídias que foram empiricamente definidas para o desenvolvimento e crescimento organoide ideal (meio organoide dentário; TOM)19.

Discussão

Este protocolo descreve a geração eficiente e reprodutível de organoides a partir do dente humano. Para nosso conhecimento, esta é a primeira metodologia para o estabelecimento de organoides de conceito atual (epitelial) a partir do tecido dentário humano. Os organoides são expansíveis a longo prazo e apresentam um fenótipo de caule epitelial dentário, duplicando DESCs previamente relatados no compartimento ERM do DF7. Além disso, os organoides replicam características funcionais de DES...

Divulgações

O autor correspondente garante que todos os autores tenham divulgado todo e qualquer conflito de interesse.

Agradecimentos

Somos gratos a todos os membros da equipe da Cirurgia Oral e Maxilofacial (MKA) da UZ Leuven, bem como aos pacientes, por sua ajuda inestimável na coleta de terceiros molares recém-extraídos. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Reinhilde Jacobs e à Dra. Este trabalho foi apoiado por subvenções da KU Leuven (BOF) e FWO-Flanders (G061819N). L.H. é um Ph.D. Fellow (1S84718N).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Microcentrifuge tubeEppendorf30120.086
15 mL Centrifuge tubeCorning430052
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM-6250
48-well flat bottom platesCorning3548
50 mL Centrifuge tubeCorning430290
A83-01Sigma-AldrichSML0788
AgaroseLonza50004
Albumin Bovine (cell culture grade)Serva47330.03
AMELX antibodySanta Cruzsc-365284
Amphotericin BGibco15200018
B27 (without vitamin A)Gibco12587-010
CassetteVWR7202191
Catalase from bovine liverSigma-AldrichC100
CD44 antibodyAbcamab34485
Cell strainer, 40 µmFalcon352340
Cholera ToxinSigma-AldrichC8052
Citric acidSigma-AldrichC0759
CK14 antibodyThermo Fisher ScientificMA5-11599
Collagenase IVGibco17104-019
Cover glassVWR6310146
CryoboxThermo Scientific5100-0001
CryovialThermo Fisher Scientific375353
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dispase IISigma-AldrichD4693
DMEM 1:1 F12 without FeInvitrogen074-90715A
DMEM powder high glucoseGibco52100039
DnaseSigma-AldrichD5025-15KU
Donkey serumSigma-AldrichD9663 - 10ML
Embedding workstation, 220 to 240 VacThermo Fisher Scientific12587976
Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH)Fisher ChemicalE/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF7524
FGF10Peprotech100-26
FGF2 (= basic FGF)R&D Systems234-FSE-025
FGF8PeprotechAF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep KitSigma-AldrichRTN350-1KTIncludes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer
Glass Pasteur pipetteNiko Mechanisms170-40050
GlycineVWR101194M
HEPESSigma-AldrichH4034
IGF-1PeproTech100-11
InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI)Sigma-Aldrich688001
Insulin from bovine pancreasSigma-AldrichI6634
ITGA6 antibodySigma-AldrichHPA012696
L-GlutamineGibco25030024
Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free)Corning15505739
Microscope slideThermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μmMilliporeSLGV033R
Minimum essential medium eagle (αMEM)Sigma-AldrichM4526
mouse IgG (Alexa 555) secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-31570
N2Gibco17502-048
N-acetyl L-cysteineSigma-AldrichA7250
NicotinamideSigma-AldrichN0636
NogginPeproTech120-10C
P63 antibodyAbcamab124762
Pap PenSigma-AldrichZ377821-1EAMarking pen
Paraformaldehyde (PFA), 16%Merck8.18715
Penicillin G sodium saltSigma-AldrichP3032
Penicillin-streptomycin (Pen/Strep)Gibco15140-122
Petri dishCorning353002
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010-015
Pipette (P20, P200, P1000)Eppendorf or others2231300006
Plastic transfer pipette (3.5 mL)Sarstedt86.1171.001
Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibodyThermo Fisher ScientificA21206
RSPO1PeproTech120-38
SB202190 (p38i)Biotechne (Tocris)1264
Scalpel (surgical blade)Swann-Morton207
SHHR&D Systems464-SH-200
Silicone molds (Heating block)VWR720-1918
Sodium Chloride (NaCl)BDH102415K
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)Merck106329
Sodium-pyruvate (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP-5280
SOX2 antibodyAbcamab92494
StepOnePlusThermo Fisher ScientificReal-Time PCR System
Stericup-GP, 0.22 µmMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μmMilliporeSCGP00525
Sterile 1000 μL pipette tips with filterGreiner740288
Sterile 20 μL pipette tips with filterGreiner774288
Sterile 200 μL pipette tips with and without filterGreiner739288
Sterile H2OFreseniusB230531
Streptomycin sulfate saltSigma-AldrichS6501
Superscript III first-strand synthesis supermixInvitrogen11752-050Reverse transcription kit
Tissue processorThermo Scientific12505356
TransferrinServa36760.01
Triton X-100SigmaT8787-50ML
TrypLE expressGibco12605-010
Vectashield mounting medium+DAPILabconsult NVH-1200Antifade mounting medium with DAPI
WNT3aBiotechne (Tocris)5036-WN-500
Xylenes, 99%, for biochemistry and histologyVWR2,89,75,325

Referências

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