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Résumé

Nous présentons un protocole pour développer des cultures organoïdes épithéliales à partir de dents humaines. Les organoïdes sont solidement extensibles et récapitulent les cellules souches épithéliales de la dent, y compris leur capacité de différenciation des améloblastes. Le modèle organoïde unique fournit un outil prometteur pour étudier la biologie dentaire humaine (cellules souches) avec des perspectives pour les approches régénératrices des dents.

Résumé

Les dents sont d’une importance clé dans la vie non seulement pour la mastication des aliments et la parole, mais aussi pour le bien-être psychologique. Les connaissances sur le développement des dents humaines et la biologie sont rares. En particulier, on ne sait pas grand-chose sur les cellules souches épithéliales de la dent et leur fonction. Nous avons réussi à développer un nouveau modèle organoïde à partir de tissu dentaire humain (c.-à-d. follicule dentaire, isolé à partir de dents de sagesse extraites). Les organoïdes sont extensibles de manière robuste et à long terme et récapitulent le compartiment proposé des cellules souches épithéliales de la dent humaine en termes d’expression des marqueurs ainsi que d’activité fonctionnelle. En particulier, les organoïdes sont capables de déployer un processus de différenciation des améloblastes comme cela se produit in vivo au cours de l’amélogenèse. Ce modèle organoïde unique fournira un outil puissant pour étudier non seulement le développement des dents humaines, mais aussi la pathologie dentaire, et pourrait ouvrir la voie à une thérapie régénérative des dents. Remplacer les dents perdues par une dent biologique basée sur ce nouveau modèle organoïde pourrait être une alternative attrayante à l’implantation standard actuelle de matériaux synthétiques.

Introduction

Les dents ont des rôles essentiels dans la mastication des aliments, la parole et le bien-être psychologique (image de soi). La dent humaine est constituée de tissus hautement minéralisés de densité et de dureté variables1. L’émail dentaire, le composant principal de la couronne dentaire, est le tissu le plus minéralisé du corps humain. Au cours de la formation de l’émail (amélogenèse), lorsque les dents se développent, les cellules souches épithéliales dentaires (DESC) se différencient en cellules formant l’émail (améloblastes). Une fois formé, l’émail est rarement réparé ou renouvelé en raison de la perte apoptotique des améloblastes au début de l’éruption dentaire1. La restauration du tissu de l’émail endommagé, causé par un traumatisme ou une maladie bactérienne, est actuellement effectuée à l’aide de matériaux synthétiques; cependant, ceux-ci sont troublés par des lacunes importantes telles que le microlaçage, l’ostéointégration et l’ancrage inférieurs, la durée de vie limitée et le manque de réparation entièrement fonctionnelle2. Par conséquent, une culture robuste et fiable de DESC humains ayant la capacité de générer des améloblastes et le potentiel de produire des tissus minéralisés serait un grand pas en avant dans le domaine de la régénération dentaire.

Les connaissances sur le phénotype des DESC humain et la fonction biologique sont rares 3,4,5. Fait intéressant, il a été proposé que des DESC de dents humaines existent dans les restes de cellules épithéliales de Malassez (ERM), des amas de cellules présents dans le follicule dentaire (DF), qui entoure les dents non percées, et restent présents dans le ligament parodontal autour de la racine une fois que la dent éclate1. Il a été constaté que les cellules ERM co-cultivées avec la pulpe dentaire se différencient en cellules de type améloblaste et génèrent des tissus semblables à l’émail6. Cependant, les études approfondies sur le rôle spécifique des cellules ERM dans la (re-)génération de l’émail ont été limitées en raison de l’absence de modèles d’étude fiables7. Les systèmes actuels de culture in vitro ERM sont entravés par une durée de vie limitée et une perte rapide de phénotype dans les conditions 2D standardutilisées 8,9,10,11,12. Par conséquent, un système in vitro traitable pour développer, étudier et différencier fidèlement les DESC humains est fortement nécessaire.

Au cours de la dernière décennie, une technique puissante pour cultiver des cellules souches épithéliales in vitro a été appliquée avec succès à plusieurs types de tissus épithéliaux (humains) pour étudier leur biologie ainsi que la maladie 13,14,15,16. Cette technologie permet aux cellules souches épithéliales tissulaires de se développer elles-mêmes en constructions cellulaires 3D (c’est-à-dire des organoïdes) lorsqu’elles sont ensemencées dans un échafaudage imitant la matrice extracellulaire (ECM) (typiquement, Matrigel) et cultivées dans un milieu défini répliquant la signalisation de niche de cellules souches et / ou l’embryogenèse du tissu. Les facteurs de croissance typiques nécessaires au développement organoïde comprennent le facteur de croissance épidermique (EGF) et les activateurs du site d’intégration MMTV (WNT) de type sans ailes 14,15,16. Les organoïdes résultants se caractérisent par une fidélité durable dans l’imitation des cellules souches épithéliales originales du tissu, ainsi que par une grande extensibilité tout en conservant leur phénotype et leurs propriétés fonctionnelles, surmontant ainsi la disponibilité souvent limitée des tissus humains primaires acquis à la clinique. Pour établir des organoïdes, l’isolement des cellules souches épithéliales du tissu hétérogène (c.-à-d. comprenant d’autres types de cellules telles que les cellules mésenchymateuses) avant la culture n’est pas nécessaire car les cellules mésenchymateuses ne s’attachent pas à l’ECM ou ne s’y développent pas, ce qui aboutit éventuellement à des organoïdes purement épithéliaux 13,16,17,18,19 . Cette technologie prometteuse et polyvalente a conduit au développement de nombreux modèles organoïdes à partir de divers tissus épithéliaux humains. Cependant, les organoïdes dérivés des dents humaines, précieux pour l’étude approfondie du développement, de la régénération et de la maladie des dents, n’ont pas encore été établis20,21. Nous avons récemment réussi à développer un tel nouveau modèle organoïde à partir de tissu DF de troisièmes molaires (dents de sagesse) extraites de patients adolescents19.

Nous décrivons ici le protocole pour développer des cultures organoïdes épithéliales à partir de la dent humaine adulte (c.-à-d. à partir du DF des troisièmes molaires) (Figure 1A). Les organoïdes résultants expriment des marqueurs de tige associés à ERM tout en étant extensibles à long terme. Curieusement, contrairement à la plupart des autres modèles organoïdes, l’EGF généralement nécessaire est redondant pour un développement et une croissance organoïdes robustes. Fait intéressant, les organoïdes de la tige présentent des propriétés de différenciation des améloblastes, imitant ainsi les caractéristiques et les processus ERM / DESC se produisant in vivo. Le nouveau modèle organoïde unique décrit ici permet d’explorer la biologie, la plasticité et la capacité de différenciation du DESC et ouvre la porte aux premiers pas vers des approches de régénération des dents.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité d’éthique de recherche UZ/KU Leuven (13/0104U). Les troisièmes molaires extraites (dents de sagesse) ont été obtenues après le consentement éclairé des patients.

1. Préparatifs

  1. Préchauffer une plaque de culture de 48 puits pendant 15-20 h dans un incubateur àCO 2 à 1,9% à 37 °C.
  2. Liquéfier une aliquote de Matrigel (facteur de croissance réduit; sans phénol rouge; en outre appelée matrice de membrane basale; BMM) sur glace (4 °C) pendant au moins 2 h avant l’étape 2.1.
    REMARQUE: Évitez les cycles de gel / dégel du BMM. Liquéfiez le BMM pendant 15-20 h sur de la glace et aliquote à 1 mL dans des tubes de microcentrifugation et stockez-le à -20 °C.
  3. Refroidir la centrifugeuse à 4 °C.
  4. Préparer le média et filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Les volumes suivants sont basés sur la collection des DF des quatre troisièmes molaires généralement extraites simultanément.
    1. Préparer 20 mL de milieu de collecte de DF (tableau 1) : milieu essentiel minimal d’aigle (αMEM) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 0,5 % d’amphotéricine B et 1 % de pénicilline-streptomycine. Transférer 4 mL de milieu collecteur DF dans un tube de 15 mL et transférer les tubes sur de la glace.
      REMARQUE : Un tube de 15 mL suffit par patient pour le prélèvement de l’échantillon (c.-à-d. pour quatre tiers molaires).
    2. Fabriquer 20 mL de milieu organoïde dentaire (plus appelé TOM; Tableau 2) en utilisant un milieu défini sans sérum (SFDM; Tableau 3). Conserver TOM à 4 °C pendant 2 semaines maximum.
    3. Préparer 8 mL de milieu de dissociation (tableau 4), c’est-à-dire une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant de la collagénase VI (3 mg/mL) et de la dispase II (4 mg/mL). Préchauffer le milieu de dissociation dans un bain-marie à 37 °C pendant au moins 10 min avant utilisation et le transférer dans deux tubes de 15 mL (4 mL par tube) pour dissocier quatre tissus DF.
    4. Préparer une plaque de lavage (12 puits) contenant : trois puits avec 70 % d’EtOH, trois puits avec PBS et trois puits avec un milieu de collecte DF.
    5. Produire 15 mL de milieu A par échantillon (c.-à-d. 5 mL par deux DF par patient; Tableau 5).
      REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles.

2. Dissociation des follicules dentaires

  1. Une fois que les troisièmes molaires avec des DF associés sont collectées dans le milieu de collecte (sur glace), transférez le contenu des tubes dans une boîte de Pétri.
  2. Tenez la dent avec une pince et isolez soigneusement le DF à l’aide d’une lame chirurgicale.
    REMARQUE: Cette étape nécessite de la pratique; soyez prudent avec la lame.
  3. Pour laver le sang restant des DF, placez brièvement les tissus DF dans le premier puits de 70% EtOH (plaque de lavage) pendant 20 s, puis transférez-les au puits EtOH suivant pendant 20 s, puis au troisième puits EtOH (maximum 1 min dans 70% EtOH au total; un temps d’incubation plus long entraînera une viabilité cellulaire réduite).
  4. Ensuite, poursuivez le rinçage dans les trois puits PBS (maximum 2 min au total).
  5. Rincez les DF dans les trois puits de milieu de collecte DF restants (jusqu’à un maximum de 20 min au total).
  6. Transférer les DF rincés dans une nouvelle boîte de Pétri.
  7. Couper un petit morceau de l’un des DF (~5 mm2) pour la fixation du paraformaldéhyde (PFA) (voir rubrique 7) et le stocker sur de la glace (pendant un maximum de 6 h) dans un tube de microcentrifugation contenant 500 μL de milieu collecteur de DF jusqu’à la fixation du PFA.
  8. Hachez le reste des FD en petits morceaux (~1 mm2).
    REMARQUE: Il est conseillé de traiter immédiatement les tissus DF fraîchement isolés pour une formation organoïde optimale et une efficacité de croissance, plutôt que de partir de tissus cryoconservés, ce qui entraîne une efficacité inférieure. Néanmoins, il est possible de cryoconserver le tissu DF primaire à cette étape (voir milieu et protocole de cryoconservation à la rubrique 5).
  9. Transférer les DF hachés dans un tube de 15 mL contenant 4 mL de milieu de dissociation pré-averti et incuber au bain-marie à 37 °C pendant 2 h.
    REMARQUE: Ajouter deux DF par milieu de dissociation préavertissé de 4 mL (un tube) pour assurer une dissociation optimale.
  10. Toutes les 15 minutes, pipet le milieu de dissociation DF mélange de haut en bas à l’aide d’une pipette Pasteur en verre pour accélérer la désintégration des tissus. Lorsque les pièces DF ne sont plus observées (généralement après 1 h), procéder à la dissociation DF à l’aide d’une pipette Pasteur polie au feu rétrécie.
    REMARQUE: Pour une dissociation DF optimale, passez à une pipette Pasteur rétrécie par polissage au feu au plus tard 1 h d’isolation DF.
    1. Entre-temps, préparer 10 mL de milieu A contenant 50 μL de DNase (0,2 mg/mL; Tableau 5).
  11. Ajouter 5 mL de milieu A (contenant la DNase) à chaque tube avec DF dissocié, et incuber pendant 1 min à température ambiante (RT).
  12. Filtrer la suspension cellulaire (contenant des cellules individuelles et des amas de petites cellules) à travers une passoire cellulaire de 40 μm pour éliminer les gros fragments restants et (la plupart) le tissu fibreux.
    1. Combinez les différents tubes avec DF dissocié d’un patient à cette étape.
  13. Rincer le filtre avec 1 mL de milieu A. Centrifuger la suspension de la cellule filtrée à 200 x g pendant 10 min à 4 °C.
  14. Retirez le surnageant, remettez la pastille dans 1 mL de SFDM (tableau 3) et transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
  15. Calculez la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Négligez les amas cellulaires qui restent.
  16. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.

3. Établissement d’une culture organoïde dentaire (figure 1A et figure 2A)

  1. En fonction du nombre de cellules obtenu, calculez le nombre de puits pouvant être ensemencés. Une gouttelette de 20 μL doit contenir 20 000 cellules. Le mélange final est composé de suspension cellulaire et de BMM dans un rapport de 30:70.
  2. Retirez la quantité appropriée de surnageant et remettez-le en suspension dans du BMM glacé pour obtenir un rapport 70:30 de BMM: suspension cellulaire pour le placage. Par exemple, lorsque 200 000 cellules sont obtenues, plaque 10 gouttelettes de 20 μL. Ainsi, retirez le surnageant jusqu’à ce qu’il reste 60 μL de la suspension cellulaire, ajoutez 140 μL de BMM glacé et remettez en suspension.
    1. Remettez en suspension lentement pour éviter la formation de bulles d’air. Une fois remis en suspension dans BMM, gardez le tube de microcentrifugeuse sur la glace.
      REMARQUE: Garder le tube de microcentrifugation sur la glace est crucial pour éviter la solidification BMM.
  3. Pipeter les gouttelettes BMM de 20 μL au centre des puits de la plaque de culture préchauffée de 48 puits.
  4. Retournez la plaque à l’envers, mettez-la dans un incubateur à 1,9% de CO2 (% de CO2 selon tampon SFDM), et laissez-la se solidifier pendant au moins 20 min à 37 °C.
  5. Ajouter l’inhibiteur de ROCK (RI; 10 μM) et l’amphotéricine B (0,1%) à la TOM et préchauffer le milieu dans un bain-marie à 37 °C.
    REMARQUE: L’amphotéricine B est sensible à la lumière.
  6. Prenez la plaque de 48 puits de l’incubateur, placez-la à la verticale et ajoutez 250 μL du milieu préaverti préparé à chaque puits avec des gouttelettes / cellules BMM et retournez la plaque à l’incubateur àCO 2 à 1,9%.
  7. Pour rafraîchir le milieu (de préférence tous les 2-3 jours), inclinez la plaque de 48 puits à un angle de 45°, retirez doucement le milieu précédent tout en évitant de toucher la gouttelette BMM et ajoutez 250 μL de nouveau milieu TOM préavertis.
    REMARQUE: Il est recommandé de se rafraîchir au moins trois fois par semaine pour éviter l’épuisement des nutriments clés et des facteurs de croissance. L’IR ne doit être ajoutée à la TOM qu’au moment de l’ensemencement initial et les premiers jours de chaque passage (voir rubrique 4) pour prévenir la mort cellulaire par les anoikis et améliorer l’excroissance organoïde. L’amphotéricine B n’est ajoutée au milieu que pendant le passage 0 (P0) pour bloquer une éventuelle contamination fongique.

4. Amplification et passage de la culture organoïde dentaire (Figure 1B et Figure 2B)

  1. Passage des organoïdes entre 10 et 14 jours de culture.
    REMARQUE: Évitez de cultiver pendant une période plus longue, car une culture prolongée peut limiter la repousse des organoïdes et la possibilité de passage. Ce n’est qu’au développement initial (P0) que les organoïdes peuvent être cultivés jusqu’à 20 jours en fonction de leur taux de croissance (jusqu’à ce que le diamètre maximal ±200 μm soit atteint).
  2. Retirez le milieu des puits avec des organoïdes qui doivent être passés. Dans une condition de culture, mettre en commun jusqu’à quatre puits confluents (voir la figure 2C).
  3. Pour recueillir les organoïdes, ajoutez 400 μL de SFDM glacé par puits directement sur la gouttelette de BMM et pipetez à plusieurs reprises le milieu de haut en bas jusqu’à ce que la gouttelette de BMM entière soit délogée.
    1. Dans le cas où des puits sont mis en commun, transférez les 400 μL du premier puits au suivant (et ainsi de suite) pour déloger les gouttelettes de BMM contenant des organoïdes de tous les puits qui doivent être mis en commun.
  4. Transférer l’ensemble organoïde BMM délogé dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et répéter l’étape 4.3 jusqu’à ce que toutes les structures organoïdes soient collectées dans les puits.
  5. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
  6. Préchauffer une aliquote de TrypLE Express (complétée par RI à 5 μM) dans un bain-marie à 37 °C. Par tube microcentrifuge d’organoïdes, un volume de 400 μL TrypLE Express est nécessaire.
  7. Après centrifugation, retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 400 μL de TrypLE. Incuber la suspension dans un bain-marie à 37 °C pendant 12 min.
  8. Ajouter 400 μL de SFDM glacé pour inactiver l’enzyme et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant.
  9. Pré-enduire une pointe (pour le volume voir ci-dessous) avec du SFDM glacé et remettre en suspension la pastille organoïde.
    1. Pour éviter la perte d’organoïdes, réutilisez la même pointe (pré-enduite) autant que possible sans compromettre la stérilité.
      REMARQUE: Le volume de SFDM requis pour la remise en suspension de la pastille dépend du nombre de structures organoïdes obtenues et du nombre de passage actuel.
    2. En règle générale, pour les passages, P0 à P2-3 (généralement encore en croissance d’un faible nombre d’organoïdes) utilisent un volume de 200 μL SFDM. À partir des passages, P3-4 ou plus (donnant généralement un plus grand nombre d’organoïdes) utilisent un volume de 700 μL de SFDM.
      REMARQUE: Les deux procédures sont appelées méthodes de « passage bas » et de « passage supérieur », respectivement (voir les étapes 4.10 et 4.11). L’application correcte des méthodes distinctes est cruciale pour un passage efficace des organoïdes. Avec la méthode du passage plus élevé, les organoïdes sont plus facilement perdus et ne doivent pas être appliqués à un faible nombre d’organoïdes (c’est-à-dire à P0 à P2-3). Cependant, la méthode de passage supérieur est nécessaire pour dissocier efficacement de plus grandes quantités d’organoïdes.
  10. Méthode à faible passage : Remettre en suspension la pastille dans 200 μL de SFDM glacé. Poussez la pointe de pipette complètement vidée contre le fond du tube de microcentrifugation pour réduire son diamètre. Vérifiez si le diamètre est suffisamment petit (aspiration plus lente, débit asymétrique mais pas bloqué). Pipet de haut en bas pendant 5 min pour perturber mécaniquement les organoïdes.
  11. Méthode de passage plus élevé: Remettez en suspension la pastille dans 700 μL de SFDM glacé avec une pointe P1000. Ajoutez une pointe P200 (sans filtre) sur cette pointe P1000 et pré-enduisez avec du SFDM glacé. Prévenir la formation de bulles d’air en ajustant le réglage du volume de la pipette afin d’aspirer au moins 90% du volume moyen (avec des organoïdes). Pipet de haut en bas pendant 5 min pour perturber mécaniquement les organoïdes.
  12. Vérifiez au microscope optique (à grossissement 4x) si l’on obtient principalement des cellules uniques avec (seulement) quelques structures non dispersées.
  13. Ajouter 500 μL de SFDM glacé au tube de microcentrifugation et mélanger doucement le mélange de cellules dissociées avec le SFDM frais par pipetage.
  14. Laissez les grandes structures non dispersées sédimenter pendant 10 min en plaçant verticalement le tube de microcentrifugation sur la glace.
    REMARQUE: Il est nécessaire d’enlever les structures non dispersées car elles influencent négativement la passageabilité organoïde. Pour l’initiation organoïde (P0), cette étape de sédimentation n’est pas nécessaire.
  15. Recueillir le surnageant (~500-1 000 μL selon la méthode de passage) contenant des cellules individuelles et des grappes de petites cellules; transférer dans un nouveau tube de microcentrifugation et centrifuger à 190 x g pendant 10 min à 4 °C.
  16. Calculez la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Négligez les amas cellulaires qui restent.
  17. Comptez le nombre de puits pouvant être ensemencés et calculez le rapport suspension cellulaire/BMM approprié comme décrit ci-dessus (section 3).
  18. Ajouter 70 % de BMM à la pastille de cellule et maintenir le tube de microcentrifugation sur de la glace.
    REMARQUE: Il est crucial de garder le tube de microcentrifugation sur la glace pour éviter la solidification du BMM.
  19. Passez à l’étape 3.3 jusqu’à 3.7 et passez à nouveau entre le jour 10 et le jour 14 de la culture.

5. Cryoconservation des organoïdes dentaires

  1. Collecter et dissocier les organoïdes comme mentionné ci-dessus pour le passage (étape 4). Centrifuger la suspension de la cellule à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
  2. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu de cryoconservation contenant du SFDM (70 %), du FBS (20 %) et du DMSO (10 %).
  3. Transférez la suspension dans un cryovial et mettez-la sur la glace. Placer les cryoviaux dans une cryo boîte et transférer à -80 °C (pendant au moins 4 h).
  4. Dans un délai de 1 mois, transférer les échantillons congelés dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme (>12 mois).

6. Décongélation des organoïdes dentaires cryoconservés

  1. Avant de commencer la procédure de décongélation, placez un tube de 15 mL par cryovial sur de la glace contenant 10 mL de SFDM avec 20% de FBS.
  2. Retirez le cryovial de l’azote liquide et mettez-le sur la glace.
    REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes le plus rapidement possible et évitez un temps de décongélation trop long (>5 min) ainsi que des intervalles trop longs entre les étapes (>5 min), car un tel allongement diminuera la survie cellulaire.
  3. Placer le cryovial dans un bain d’eau tiède (37 °C) jusqu’à ce qu’il soit décongelé (~1-2 min).
  4. Transférer immédiatement le contenu du cryovial dans le tube glacé de 15 mL et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
  5. Retirer 9 mL du surnageant et centrifuger les 1 mL restants à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant et lavez la pastille avec 1 mL de SFDM glacé.
  6. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
  7. Comptez le nombre de puits pouvant être ensemencés et calculez le rapport suspension cellulaire/BMM approprié comme décrit ci-dessus (section 3).
  8. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettez en suspension la pastille dans un rapport de 70:30 de BMM:TOM et gardez-la sur la glace.
  9. Passez à l’étape 3.3 jusqu’à la 3.7 et passez entre le jour 10 et le jour 14 de la culture.

7. Fixation et incorporation de paraffine des organoïdes dentaires

REMARQUE: Cette procédure (y compris les rubriques 8 et 9) peut également être appliquée sur le tissu DF primaire.

  1. Fixation des organoïdes dentaires dans le PFA
    1. Retirez le support de chaque puits comme à l’étape 4.2.
    2. Collectez les organoïdes en délogeant la gouttelette de BMM (étape 4.3). Transférer le mélange BMM-organoïde dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
    3. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
    4. Retirer le surnageant et ajouter 500 μL de PFA à 4 % et incuber pendant au moins 30 min (maximum 1 h) à RT en mélangeant doucement sur un agitateur orbital.
      ATTENTION : Utilisez la hotte chimique lorsque vous travaillez avec du PFA.
    5. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant et rincez la pastille organoïde avec du PBS pendant 10 min à RT en agitant doucement.
    6. Lavez la pastille organoïde (étape 7.1.5) deux fois de plus. Faire tourner les organoïdes fixes vers le bas à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
    7. Remettre en suspension la pastille dans 500 μL de 70 % d’EtOH (dans de l’eau désionisée). Conservez les organoïdes jusqu’à 1 mois dans 70% EtOH à 4 °C.
  2. Incorporation d’agarose et de paraffine d’organoïdes dentaires
    REMARQUE: Pour intégrer efficacement des organoïdes dans la paraffine, une étape supplémentaire d’incorporation dans l’agarose est nécessaire.
    1. Centrifuger les organoïdes fixés pfa dans 70% EtOH à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant.
    2. Préparer une solution d’agarose à 2 % dans 30 mL de PBS dans une bouteille en verre. Réchauffer le mélange agarose-PBS au micro-ondes jusqu’à ce qu’une structure semblable à un gel soit observée (environ 2,5 min à 600 W).
    3. En parallèle, ajouter 30 mL de PBS à une autre bouteille en verre et réchauffer au micro-ondes (environ 2,5 min à 600 W). Laissez refroidir la solution d’agarose pendant 1 min.
    4. Coupez l’extrémité d’une pointe P200 pour permettre de travailler avec la solution d’agarose avec précision et d’éviter les bulles d’air.
    5. Préwarmez la pointe P200 dans le PBS chaud en pipetant de haut en bas plusieurs fois.
    6. Ajouter 150 μL de solution d’agarose préavertie à la pastille organoïde et pipeter doucement le mélange organoïde-agarose (avec une remise en charge minimale) tout en évitant les bulles d’air.
      REMARQUE: La remise en suspension minimale permettra de mieux localiser les organoïdes dans le gel d’agarose lors de la sectionnement des microtomes puisque les organoïdes sont alors plus proches les uns des autres.
    7. Transférer immédiatement le mélange organoïde-agarose dans le même capuchon de tube de microcentrifugation, placer le tube horizontalement et laisser l’agarose se solidifier (~ 20 min à RT). En attendant, étiquetez les cassettes.
    8. Une fois solidifié, retirez le gel d’agarose du bouchon de microcentrifugeuse à l’aide d’une pince à épiler et transférez-le sur une cassette étiquetée.
    9. Transférer la cassette contenant de l’agarose dans un bécher contenant 50% d’EtOH dans de l’eau désionisée. Couvrir le bécher avec un parafilm pour éviter l’évaporation de l’EtOH.
      REMARQUE: Le volume du bécher dépend du nombre de cassettes.
    10. Traiter les échantillons dans un processeur de tissu pendant la nuit.
      REMARQUE: Comme la paraffine se solidifie à RT, les étapes suivantes doivent être effectuées rapidement.
    11. Préchauffer un bloc chauffant dans le poste de travail d’intégration pendant 15 min.
    12. Retirez le gel d’agarose contenant des organoïdes enfermé dans la cassette et placez-le dans le bloc chauffant préavertissé. Retirez le capuchon de la cassette et mettez-le de côté pour une utilisation ultérieure.
    13. Remplissez le bloc chauffant restant avec de la paraffine.
      REMARQUE: Vérifiez avec une pince à épiler si le gel d’agarose contenant des organoïdes est toujours situé au fond du bloc chauffant. En raison de sa légèreté, il peut commencer à flotter, entraînant une perte d’échantillon.
    14. Placez le capuchon de la cassette sur le dessus du bloc chauffant. Laissez-le se solidifier pendant 30 min sur une plaque froide. Retirez le bloc chauffant et conservez les blocs de paraffine à 4 °C.

8. Sectionnement et coloration des organoïdes dentaires (Figure 2B et Figure 3A-C)

  1. Sectionnement microtome de blocs de paraffine contenant des organoïdes
    1. Trancher des sections de 5 μm des organoïdes dentaires dans les blocs de paraffine à l’aide d’un microtome.
    2. Placez les tranches de paraffine sur une lame de verre de microscope. Placez la lame de verre du microscope sur une plaque chaude à 37 °C et recouvrez-la d’eau désionisée à l’aide d’une pipette Pasteur.
    3. Laissez le verre du microscope glisser sécher pendant la nuit.
  2. Coloration des sections organoïdes des dents
    1. Déparaffiniser les sections organoïdes (sur la lame de verre du microscope) dans un four pendant 1 h à 58 °C.
    2. Réhydrater les sections organoïdes (sur la lame de verre du microscope) en série EtOH décroissante à l’intérieur de la hotte chimique dans l’ordre suivant:
      Xylène 2x pendant 3 min chacun
      100% EtOH 2x pendant 3 min chacun
      95% EtOH 2x pendant 3 min chacun
      90% EtOH 2x pendant 3 min chacun
      70% EtOH 3x pendant 3 min chacun
      ATTENTION : Utilisez la hotte chimique lorsque vous travaillez avec du xylène.
    3. Rincez la lame de verre du microscope dans l’eau du robinet pendant 5 min à TA. Ensuite, rincez-le dans PBS pendant 5 min à RT.
    4. Effectuer la récupération de l’antigène en plaçant les sections organoïdes (sur la lame de verre du microscope) dans un tampon de citrate préavertissé (10 mM d’acide citrique dans de l’eau désionisée avec un pH de 6; dans un récipient en plastique; préavertillé pendant 10 min dans un bain-marie à 95 °C) pendant 30 min dans un bain-marie à 95 °C.
    5. Laissez refroidir la lame de verre du microscope pendant 20 min à RT. Rincez la lame de verre de microscope dans PBS pendant 5 min à RT, puis dans PBS contenant 0,1% de Triton-X (PBT) pendant 5 min à RT.
    6. Utilisez un stylo de marquage pour créer une barrière hydrophobe aux bordures de chaque diapositive.
    7. Bloquer pendant au moins 1 h à RT dans le tampon bloquant (contenant 1,5 mg/mL de glycine, 2 mg/mL d’albumine de sérum bovin (BSA) dissous dans du PBT) plus 10 % de sérum d’âne.
      REMARQUE: En règle générale, 300 μL de tampon bloquant plus 10% de sérum d’âne sont nécessaires par lame de verre de microscope.
    8. Placez la lame de verre du microscope dans une chambre humide. Utilisez une boîte hermétique où toutes les glissières s’adaptent et mouillez quelques mouchoirs en papier avec de l’eau à placer au fond de la boîte. Cela empêchera les lames de se dessécher lors des étapes de coloration suivantes.
    9. Retirer le tampon bloquant, ajouter l’anticorps primaire (tableau 6) préparé dans un tampon bloquant plus 1 % de sérum d’âne et incuber la lame recouverte d’une solution d’anticorps pendant la nuit dans la chambre humide à 4 °C. Refaites la bordure du stylo de marquage si nécessaire.
    10. Lavez la lame de verre du microscope trois fois en PBT à RT pendant 10 minutes en mélangeant doucement sur un agitateur orbital (75-150 tr / min).
    11. Ajouter l’anticorps secondaire (tableau 6), préparé dans un tampon bloquant plus 1 % de sérum d’âne, et incuber pendant 1 h dans la chambre humide à TA.
    12. Retirez le tampon bloquant et lavez la lame de verre du microscope trois fois en PBT à RT pendant 10 minutes en mélangeant doucement sur un agitateur orbital.
    13. Ajouter un support de montage antifade avec DAPI (1 à 3 gouttelettes) sur un couvercle en verre et le monter sur les sections organoïdes (sur la lame de verre du microscope). Procéder à l’imagerie; conserver les diapositives pendant un maximum de 1 semaine à 4 °C.

9. Extraction de l’ARN et RT-qPCR des organoïdes dentaires (Figure 2B et Figure 3D)

  1. Extraction de l’ARN des organoïdes dentaires
    1. Retirez le milieu de chaque puits (étape 4.2).
    2. Recueillir les organoïdes en délogeant la gouttelette de BMM (étape 4.3), transférer le mélange BMM-organoïde dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
    3. Retirer le surnageant, remettre en suspension vigoureusement dans 350 μL de 1 % de β-mercaptoéthanol dissous dans un tampon de lyse (table des matières) et mettre sur glace.
      ATTENTION: Effectuez toutes les étapes avec du β-mercaptoéthanol dans une hotte chimique.
      REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés à cette étape jusqu’à 1 mois à -80 ° C. Décongeler les échantillons sur de la glace avant de passer à l’étape 9.1.4.
    4. Vortex les échantillons jusqu’à ce qu’aucune structure organoïde ne soit plus observée.
    5. Procéder à l’extraction de l’ARN à l’aide du kit d’extraction d’ARN (Table des matériaux) conformément aux instructions du fabricant.
  2. RT-qPCR des organoïdes dentaires (tableau 7)
    1. Transcrire en sens inverse (RT) l’ARN19 à l’aide du kit de transcription inverse (Table des matériaux) selon les instructions du fabricant.
    2. Analysez les échantillons d’ADNc résultants avec la PCR quantitative basée sur SYBR Green (qPCR)19 à l’aide d’un système de PCR en temps réel (Table des matériaux).

Résultats

Développement organoïde dentaire
Nous fournissons un protocole détaillé pour établir des cultures organoïdes à partir de tissu DF humain acquis à la suite d’une extraction de dents de sagesse (Figure 1A). Le DF isolé est dissocié enzymatiquement et mécaniquement. Les cellules obtenues sont cultivées dans le BMM dans des milieux qui ont été définis empiriquement pour un développement et une croissance organoïdes optimaux (milieu organoïde de la dent; TO...

Discussion

Ce protocole décrit la génération efficace et reproductible d’organoïdes à partir de la dent humaine. À notre connaissance, il s’agit de la première méthodologie permettant d’établir des organoïdes à concept actuel (épithéliaux) à partir de tissu dentaire humain. Les organoïdes sont extensibles à long terme et présentent un phénotype de tige épithéliale dentaire, dupliquant les DESC précédemment signalés dans le compartiment ERM du DF7. De plus, les organoïdes reprodu...

Déclarations de divulgation

L’auteur correspondant s’assure que tous les auteurs ont divulgué tous les conflits d’intérêts.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à tous les membres du personnel de la chirurgie buccale et maxillo-faciale (MKA) de l’UZ Leuven, ainsi qu’aux patients, pour leur aide inestimable dans la collecte des troisièmes molaires fraîchement extraites. Nous tenons également à remercier la Dre Reinhilde Jacobs et la Dre Elisabeth Tijskens pour leur aide dans la collecte d’échantillons. Ce travail a été soutenu par des subventions de la KU Leuven (BOF) et de FWO-Flanders (G061819N). L.H. est titulaire d’un doctorat FWO (1S84718N).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Microcentrifuge tubeEppendorf30120.086
15 mL Centrifuge tubeCorning430052
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM-6250
48-well flat bottom platesCorning3548
50 mL Centrifuge tubeCorning430290
A83-01Sigma-AldrichSML0788
AgaroseLonza50004
Albumin Bovine (cell culture grade)Serva47330.03
AMELX antibodySanta Cruzsc-365284
Amphotericin BGibco15200018
B27 (without vitamin A)Gibco12587-010
CassetteVWR7202191
Catalase from bovine liverSigma-AldrichC100
CD44 antibodyAbcamab34485
Cell strainer, 40 µmFalcon352340
Cholera ToxinSigma-AldrichC8052
Citric acidSigma-AldrichC0759
CK14 antibodyThermo Fisher ScientificMA5-11599
Collagenase IVGibco17104-019
Cover glassVWR6310146
CryoboxThermo Scientific5100-0001
CryovialThermo Fisher Scientific375353
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dispase IISigma-AldrichD4693
DMEM 1:1 F12 without FeInvitrogen074-90715A
DMEM powder high glucoseGibco52100039
DnaseSigma-AldrichD5025-15KU
Donkey serumSigma-AldrichD9663 - 10ML
Embedding workstation, 220 to 240 VacThermo Fisher Scientific12587976
Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH)Fisher ChemicalE/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF7524
FGF10Peprotech100-26
FGF2 (= basic FGF)R&D Systems234-FSE-025
FGF8PeprotechAF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep KitSigma-AldrichRTN350-1KTIncludes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer
Glass Pasteur pipetteNiko Mechanisms170-40050
GlycineVWR101194M
HEPESSigma-AldrichH4034
IGF-1PeproTech100-11
InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI)Sigma-Aldrich688001
Insulin from bovine pancreasSigma-AldrichI6634
ITGA6 antibodySigma-AldrichHPA012696
L-GlutamineGibco25030024
Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free)Corning15505739
Microscope slideThermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μmMilliporeSLGV033R
Minimum essential medium eagle (αMEM)Sigma-AldrichM4526
mouse IgG (Alexa 555) secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-31570
N2Gibco17502-048
N-acetyl L-cysteineSigma-AldrichA7250
NicotinamideSigma-AldrichN0636
NogginPeproTech120-10C
P63 antibodyAbcamab124762
Pap PenSigma-AldrichZ377821-1EAMarking pen
Paraformaldehyde (PFA), 16%Merck8.18715
Penicillin G sodium saltSigma-AldrichP3032
Penicillin-streptomycin (Pen/Strep)Gibco15140-122
Petri dishCorning353002
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010-015
Pipette (P20, P200, P1000)Eppendorf or others2231300006
Plastic transfer pipette (3.5 mL)Sarstedt86.1171.001
Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibodyThermo Fisher ScientificA21206
RSPO1PeproTech120-38
SB202190 (p38i)Biotechne (Tocris)1264
Scalpel (surgical blade)Swann-Morton207
SHHR&D Systems464-SH-200
Silicone molds (Heating block)VWR720-1918
Sodium Chloride (NaCl)BDH102415K
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)Merck106329
Sodium-pyruvate (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP-5280
SOX2 antibodyAbcamab92494
StepOnePlusThermo Fisher ScientificReal-Time PCR System
Stericup-GP, 0.22 µmMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μmMilliporeSCGP00525
Sterile 1000 μL pipette tips with filterGreiner740288
Sterile 20 μL pipette tips with filterGreiner774288
Sterile 200 μL pipette tips with and without filterGreiner739288
Sterile H2OFreseniusB230531
Streptomycin sulfate saltSigma-AldrichS6501
Superscript III first-strand synthesis supermixInvitrogen11752-050Reverse transcription kit
Tissue processorThermo Scientific12505356
TransferrinServa36760.01
Triton X-100SigmaT8787-50ML
TrypLE expressGibco12605-010
Vectashield mounting medium+DAPILabconsult NVH-1200Antifade mounting medium with DAPI
WNT3aBiotechne (Tocris)5036-WN-500
Xylenes, 99%, for biochemistry and histologyVWR2,89,75,325

Références

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