组织清除后使用3D重建方法检测和定量小鼠门牙中的标记保留细胞

摘要

小鼠门牙在其干细胞生态位中含有有价值的标记保留细胞。我们有一种新颖的方法来无偏地检测和量化标签保留细胞;我们的研究在PEGASOS组织清除下颌骨后使用了EdU标记和3D重建方法。

摘要

鼠门牙是小鼠一生中不断生长的器官。存在于门牙近端组织中的上皮和间充质干细胞产生后代，后代将分化为釉质母细胞、成牙细胞和牙髓成纤维细胞。这些细胞对于支持门牙组织的持续更新至关重要，使小鼠门牙成为研究成体干细胞稳态的极好模型。干细胞被认为含有长寿命的静止细胞，可以通过核苷酸类似物（如5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU））标记。细胞随着时间的推移保留此标签，并相应地命名为标签保留细胞 （LRC）。 体内 LRCs可视化的方法为监测干细胞稳态提供了强大的工具。在这项研究中，我们描述了一种可视化和分析LRC的方法。我们的创新方法的特点是，在组织清除和全安装EdU染色后，在小鼠门牙中放置LRC，然后使用成像软件进行共聚焦显微镜和3D（3D）重建。与传统的切片载玻片上的LRCs分析相比，该方法可实现3D成像采集和无偏差定量。

引言

持续生长的小鼠门牙是研究成体干细胞的极好模型¹。位于门牙近端的上皮（唇颈袢）和间充质干细胞（唇颈袢和颈舌之间）分化为釉母细胞、成牙细胞和牙髓细胞。这种独特的过程为补偿组织损失和周转提供了细胞来源²。虽然有几种干细胞标志物，如Sox2，Gli1，Thy1 / CD90，Bmi1等。已经在体内鉴定出小鼠门牙中成体干细胞亚群，当单独使用时，它们不足以代表干细胞群¹，³，^4，5。通过核苷酸类似物DNA标记和保留可视化长寿命静止细胞可以为大多数成体干细胞亚群提供无偏倚检测⁶。此外，该方法在许多干细胞鉴定方法⁷中是有用的，用于了解细胞行为和牙科^{干细胞群的}稳态3^，8。虽然分裂的干细胞在经过相当大的追逐后会失去其DNA标记，但假定的静止干细胞保留其DNA标记，认为它们是标记保留细胞（LRC）⁶。非分裂干细胞的DNA标记和保留将标记并定位假定的成体干细胞在其生态位中。

在过去的几年中，胸苷类似物5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）标记取代了用于细胞增殖测定的繁琐，耗时且高分辨率的显微镜不兼容的3H-胸苷DNA标记方法^6，9。近年来，5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）标记技术越来越多地用于BrdU。这种模式的出现有几个原因。首先，BrdU方法速度慢且劳动密集。用户条件是可变的，并且无法保留标本中的超微结构（由于DNA变性）。同样，BrdU方法失去了细胞的抗原性，因此对于下游功能分析和测定（例如共定位实验和体内干细胞移植）效率低下3，7，⁹，10，^11，12。BrdU也是一种致畸剂，不适合在胚胎发育中标记^LRCs6。此外，BrdU方法在用于整个安装试样时效率低下。缺点是抗体在标本深部的渗透率低，或者需要较长的抗体孵育期才能深入¹³。EdU标记省去了变性标本的步骤，从而保留了超微结构。此功能有利于下游功能分析，例如共定位实验和干细胞移植^11，12。此外，EdU 标签具有高度的灵敏度和快速性;由于使用快速吸收和较小尺寸的荧光叠氮化物通过Cu（I）催化的[3 + 2]环加成反应（"点击"化学）检测EdU标记，因此样品穿透力很高¹⁴。

另一种应用日益广泛的DNA标记方法是使用工程转基因小鼠。这些小鼠表达由四环素响应调节元件^5，14控制的组蛋白2B绿色荧光蛋白（H2B-GFP）。用四环素食物/水喂养小鼠4周至4个月的追逐期后，GFP荧光将在循环细胞中减弱，只有LRC保留荧光⁶。该方法的优点是标记的LRC可以分离，并且对于细胞培养或下游^{功能分析仍然}有效6^，7。一些研究报告了长期使用时静态干细胞的标记不准确。该结果是由于H2B-GFP菌株的背景表达泄漏，而不是适当的四环素调节反应¹⁵。

此外，过去大多数文献主要在切片玻片上使用LRCs检测，切片玻片是二维的，在显示LRC的准确位置和数量时经常错误地偏向。该方法显示复杂组织结构切片的角度不正确¹⁶.另一种方法是从连续切片获取3D图像并进行图像后重建。这些步骤是不准确的，因为压缩或拉伸部分导致每个序列部分的变化导致图像失真，导致信息缺失^16，17，18。这种方法也很费力和耗时。

为了便于LRC的全卡口成像，需要使样品清晰，同时保持良好的荧光。目前的组织清除技术可分为三大类:基于有机溶剂的组织清除技术、基于水试剂的组织清除技术和基于水凝胶的组织清除技术^17，19。聚乙二醇（PEG）相关溶剂体系（PEGASOS）最近被开发出来。这种方法使几乎所有类型的组织透明并保留内源性荧光，包括硬组织，如骨骼和牙齿²⁰。PEGASOS方法比其他组织清除方法具有优势，特别是在清除牙齿和骨骼材料方面。大多数其他方法只能部分清除硬组织，处理时间长，或者需要昂贵的试剂²¹。此外，与其他方法相比，PEGASOS方法可以有效地保留内源性荧光。

这些文献促使我们创造了一种新的细胞研究方法。我们将EdU标记的LRCs检测优势与组织清除标本最卓越的3D全安装成像相结合;样品采用先进的聚乙二醇（PEG）相关溶剂系统（PEGASOS）组织清除技术处理¹⁵。硬组织透明度使我们能够在不折断牙齿或下颌 骨的情况下重建 体内LRCs荧光的3D信号，从而创建一种更准确的方法来可视化和量化LRC。

在这项研究中，我们提供了一个创新的指南来可视化小鼠门牙中的LRC。我们制作了一种3D视觉方法来确定LRC在小鼠门牙干细胞生态位中的位置和数量。该项目使用了EdU标记，PEGASOS组织清除技术和共聚焦显微镜。我们的EdU在整个安装组织上标记LRC的方法以及使用透明和透明的标本的方法克服了传统切片载玻片和其他不利的DNA标记方法的局限性。因此，我们的技术将适用于需要LRCs检测的干细胞稳态研究，特别是在硬组织上。该协议对那些专注于其他组织和器官中的干细胞稳态的人同样有利。

研究方案

此处描述的所有方法均已获得德克萨斯A&M大学牙科学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. EdU标签鸡尾酒的准备

1. 如 表1所述制备鸡尾酒储备溶液。
2. 如 表1中所述制备EdU标签鸡尾酒。

2.小鼠和EdU溶液的制备

1. 准备 EdU 解决方案。将EdU溶解在DMSO中，浓度为20mg / mL，并储存在-20°C冰箱中。
   注意:EdU是一种诱变剂。用户在处理此物质时应穿戴适当的个人防护设备 （PPE）。
2. 以3μL / g体重腹膜内注射5天大的C57BL / 6J小鼠。小鼠必须连续7天每天接受一次溶液。接下来，它们在收获进行分析之前经历 6 周的追逐期（图 1）。
   注意:将EdU注射到小鼠体内时，请注意避免针刺。连续7天注射EdU后，将小鼠放入新的笼子中。小鼠进入新家后，使用适当的生物危害规则将床上用品丢弃在旧笼子中。

3.经心灌注样品制备（6周追逐期后出生后53日龄小鼠）

注意:成功经心灌注后，小鼠肝脏应变白。

1. 用腹膜内注射麻醉小鼠。他们需要给予甲苯噻嗪和氯胺酮麻醉剂的组合（甲苯噻嗪10-12.5mg / kg;氯胺酮，80-100毫克/公斤体重）。
2. 等待~10分钟，直到鼠标不再对疼痛刺激（如爪子捏反射）做出反应。
3. 将小鼠置于仰卧位置，稳定在聚苯乙烯泡沫塑料支架上，每只爪子上都有针。
4. 通过使用镊子和解剖剪刀打开覆盖的皮肤来暴露胸腔。
5. 用锋利的剪刀剪开隔膜。注意不要刺穿心脏。
6. 切开胸腔，用夹式剪刀抓住胸骨的底部，露出心脏。
7. 将鼠标转移到通风橱中循环泵附近的灌注阶段。
8. 将 25 G 针头（从装有磷酸盐缓冲盐水 （PBS）/4% 多聚甲醛 （PFA） 溶液的管中）插入左心室的顶端。注意将针尖保持在心室内腔内。
   注意:PFA具有中等毒性，可能是致癌物。使用PPE处理PFA，并在化学通风橱下制备溶液。废物PFA需要根据机构指南进行适当处置。
9. 将针头插入左心室后，立即使用锋利的剪刀切割右心室。此步骤允许血液从小鼠流出并排入收集盘中。
10. 用 50 mL PBS 溶液以 7 mL/min 的流速灌注样品。
11. PBS 灌注后，切换旋塞阀，以 5 mL/min 的相同流速流动 20 mL 的 4% PFA 溶液。
12. 当循环泵仍打开时，从左心室取出针头。
    注意:鼠标现已固定用于组织收集。为了保持荧光，在整个方案中应尽可能避免光照。在处理组织时，可以用铝箔覆盖装有组织样品的 50 mL 锥形管。

4. 使用PEGASOS技术清除下颌骨的组织

注意:根据组织体积，可以使用15 mL或50 mL锥形管来保持样品准备好在每个步骤中进行处理。样品在步骤4.2至4.7的37°C摇床（~100rpm）下处理。使用耐有机溶剂的聚丙烯基塑料容器，以避免塑料熔化。或者，也可以使用玻璃器皿。

注意:PEGASOS组织清除技术使用有毒溶液，如Quadrol，聚乙二醇（PEG），苯甲酸苄酯（BB），MMA500等。需要适当的个人防护装备以避免潜在的接触。

1. 解剖下颌骨并进一步将样品固定在 4% PFA 中。将它们在室温下保存过夜。
2. 从下颌骨中取出肌肉，并将其浸入0.5M EDTA溶液（pH 8.0）中脱钙4天。在此期间，每天在37°C摇床上进行培养基更换。
   注意:最好尽可能多地从样品中去除肌肉。这种预防措施将简化成像过程并减少肌肉的自发荧光。
3. 在37°C摇床上用25%Quadrol溶液（h₂O中的v / v）使下颌骨脱色一天，以除去剩余的血红素。
4. 完成整个支架 EdU 染色。
   1. 根据 表1准备新鲜的EdU标签鸡尾酒。
      注意:每次都需要新鲜制作EdU标记混合物，并添加新鲜制备的抗坏血酸溶液，以获得最佳的EdU标记结果。
   2. 用PBST在37°C摇床上冲洗下颌骨30分钟。
   3. 用PBS冲洗下颌骨三次，每次3分钟。
   4. 将下颌骨在新鲜制作的EdU标签鸡尾酒中在37°C摇摇杯上孵育过夜。
   5. 用PBS冲洗下颌骨三次，每次3分钟。
5. 在37°C下在以下每种溶液中进行连续脱脂6小时:
   30% 叔丁醇 （tB） 溶液:75% v/v H₂O、22% v/v tB 和 3% v/v Quadrol。
   50% tB 溶液:50% v/v H₂O、47% v/v tB 和 3% v/v Quadrol。
   70% tB 溶液:30% v/v H₂O、67% v/v tB 和 3% v/v 四重
   注意:脱脂步骤至关重要。脱脂可以在30%和50%tB溶液中4-6小时之间进行，在70%tB溶液中1天。
6. 在tB-PEG溶液中脱水下颌骨2天，每日更换培养基:75%tB，22%v / v聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯平均MMA500和3%v / v Quadrol在37°C。
7. 清除苯甲酸苄酯（BB）-PEG清除介质中的下颌骨以获得折射率匹配:75% v / v BB，22% v / v PEG-MMA500和3%Quadrol，直到达到透明度。
   注意:我们有关于折射率匹配的信息。组织中的无机和有机成分，如水、脂质、蛋白质、矿物质、细胞器等。在 1.33 到 1.55 的范围内具有不同的折射率 （RI）。组织成分之间的这种RI不匹配阻碍了成像过程。透明度可以通过消除组织内的RI不匹配来实现。建议将组织清除的样品浸入BB-PEG的清除介质中。此步骤将为整个标本提供~1.54的均匀内部折射率（称为RI匹配），从而简化成像过程。
8. 在室温下将下颌骨保存在BB-PEG组织清除培养基中以进行储存和成像。
   注意:最好尽快完成成像，以避免荧光报告基因逐渐流失。然而，PEGASOS方法即使在储存数周后也能保持荧光报告基因的良好保存^20，21。对于长期储存，样品也可以储存在4°C。

5. 组织清除下颌骨的共聚焦成像

1. 将整个下颌骨清除的组织安装在BB-PEG清除介质中的品牌腔载玻片上，并用玻璃盖玻片覆盖。避免任何气泡。
2. 使用合适的激光扫描共聚焦显微镜进行图像采集。选择采集 并将图像采集 参数设置为 512 x 512 像素分辨率和 400 Hz 采集速度。这些设置可在控制显微镜的软件的采集模式菜单中找到。
3. 在荧光激发面板中，激活所需的激光（TRITC）以最佳方式激发荧光团（我们用于LRC可视化的探针具有荧光特性，例如Cy3，激发波长为548 nm，发射波长为563 nm）。
4. 在荧光检测面板中，移动滑块以选择要测量的波长（例如，对于 Cy3 样荧光团，在 555 到 625 nm 之间）。
5. 将安装的下颌骨放在显微镜载物台上，使用白光和较低放大倍率的物镜（2-10x）观察和找到样品。
6. 在盖玻片顶部加入一滴折射率为1.52的浸油，以匹配玻璃盖玻片和物镜的折射率。
   注意:尽可能匹配物镜、成像介质和组织的折射率，以尽量减少图像采集过程中光学失真的引入。
7. 打开荧光灯并选择合适的放大倍率物镜对感兴趣区域进行成像。我们使用20倍物镜，数值孔径为0.9，工作距离为1.95 mm。在共聚焦显微镜中对较大的组织样本进行成像时，可能需要更长的工作距离镜头。或者，对于较大的组织样本，可以使用光片显微镜轻松进行成像。
8. 在共聚焦成像软件上，按实时按钮启动 实时 扫描模式。要最大化图像的动态范围并避免像素饱和，请调整所选通道的增益和激光强度。
9. 识别视野以在 X 和 Y 维度上可视化下颌骨的整个区域。设置上下Z期采集参数，以准确覆盖小鼠门牙中干细胞生态位的体积。使用 2 μm 的 Z 步长尺寸或根据您的要求。较新版本的共聚焦显微镜应该能够自动获取各种重叠区域的z堆栈。
10. 以 .lif 格式获取并保存 Z 堆栈图像文件。
    注意:.lif 苍蝇可以转换为.tiff文件并用于其他 3D 分析软件。

6. 通过创建表面、分割感兴趣区域 （ROI）、屏蔽 ROI 和创建斑点来量化标签保留细胞的图像处理、3D 图像重建和量化

注意:我们使用Imaris（Bitplane 9.0.1）进行图像处理和3D重建，但类似的图像处理步骤可以使用其他软件套件（例如，ImageJ / Fiji，3D切片器，Avizo，Arivis，Amira等）进行。

1. 在成像软件中，点按" 竞技场 "按钮，然后选取 "影像"。选择原始 .lif文件并选择合并 文件 ，图像将被导入成像软件。
   注意:或者，使用成像软件文件转换器将 Z 堆栈图像文件转换为软件的本机格式文件类型。例如:使用Imaris文件转换器将.lif文件转换为.ims文件，并在成像软件中打开.ims文件。将数据转换为软件的本机文件格式将允许快速文件转换并最大限度地减少错误。
2. 双击导入的文件以打开图像数据集。
3. 访问 显示调整 面板，单击频道名称。在默认模式下，它通常标记为红色。
   1. 在 "图像属性 "窗口中，单击" 映射颜色 "选项卡。在" 颜色表文件" 选项中，选择" 消防流"，然后单击" 确定"。通常选择显示颜色以区分背景荧光和样品中的正荧光。
4. 在 场景 - 属性 窗格中屏幕左上角，单击标有 添加新表面的蓝色图标。取消选择 音量 图标，这将去除大部分背景荧光，并且正荧光清晰可见（参见步骤6.4.2）。
   1. 通过单击"创建"选项卡并选择"跳过自动创建，手动编辑"选项卡，开始手动分割感兴趣区域 （ROI） 的过程。在手动曲面创建向导中，单击"轮廓"选项卡以根据样品选择方向（XY、YZ 或 XZ），以轻松绘制 ROI 轮廓。在这里，我们选择XY方向。
   2. 接下来，确保右上角的指针菜单处于 选择 模式。调整 切片位置 以定位组织中的ROI。您会注意到，如步骤6.4中所述，大部分背景荧光已被去除，并具有明显的正荧光。单击"绘制"按钮并 绘制 感兴趣的暂定区域。选择" 可见性 "选项为 "无 "，以避免来自 ROI 以外的其他区域的干扰。
   3. 重复步骤 6.4.2。逐个切片绘制整个感兴趣区域。
   4. ROI 绘图完成后，单击" 创建曲面 "以获取 ROI 的 3D 几何图形。
   5. 单击手动曲面创建向导中的" 编辑 "按钮，然后选择 "全部遮罩"。
   6. 在弹出的 "掩码 通道"窗口中，在通道选择选项中选择 通道 1 。然后，选择 复制通道 在应用蒙版之前。在蒙版设置中，选择 恒定内/ 外并将体素外表面设置为 0。
   7. 在" 场景属性 "窗格中，取消选择 "表面 对象"并选择 "体积对象"。在" 显示调整"中，取消选择原始"红色"通道并选择 "蒙版红色 "通道并调整颜色强度以获得所需的 3D 渲染和正标记荧光 ROI。
5. 创建新的专色对象。首先单击" 添加 斑点 "图标，通过创建与 3D 渲染的 LRC 相当重叠的 3D 斑点来量化 3D 渲染的 LRC。 使用底部箭头在点创建向导中的步骤之间移动。
   1. 在光斑创建向导中，将有四个连续的指令步骤，以使用软件自动创建光斑。确保在第一步中选择了仅细分感兴趣区域选项。单击 下一步 图标。
   2. 在第二步中，将有一个"XYZ 3D框"。调整 XYZ 框以覆盖投资回报率。单击 下一步 图标。
   3. 在第三步中，转到 源频道 选项。选择蒙版红色通道;输入估计的XY光斑直径，以拟合和重叠样品荧光点。单击 下一步 图标。
   4. 在第四步中，添加"质量"过滤器类型，并通过在"质量"直方图上移动滑动窗口来调整较低的强度阈值，直到标记大多数可识别的LRC。
      注意:分割和统计读数（例如:细胞数）在很大程度上取决于强度阈值。注意精确设置适当的阈值。
   5. 单击" 完成 "按钮，然后选择 "统计信息 "按钮。选择 "总体 "选项卡以查找图像中点总数的值。
   6. 通过单击 "选项卡显示到文件 "按钮导出统计信息，并在.xls文件中接收结果。
   7. 使用合适的图表来显示定量结果。

结果

在EdU标记和PEGASOS组织清除过程（图2）之后，获得了透明的下颌骨，如我们的图像所示（图3B）。我们将修改后的样品与没有组织清除过程的正常下颌骨进行了比较（图3A）。对带有EdU标记的透明下颌骨（图3B）进行共聚焦成像。我们专注于显示干细胞生态位的门牙顶端，如（补充图1）所示。门?...

讨论

多剂量注射（BrdU，EdU）通常用于生长中的新生小鼠，以尽可能多地标记增殖细胞¹，^6，13。追逐期被认为是关于组织更新率的关键步骤^6，13。小鼠门牙每个月都会自我更新。这种特性允许研究人员将追逐期设置为 4 周或更长⁴，^5，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Sigma Aldrcih	E9884
20 × Objective/NA 0.9	Leica	507702
50 mL Falcon Centrifuge Tubes	Falcon	352070
BD PrecisionGlide Needle	BD	REF 305111
Bezyl benzoate (BB)	Sigma Aldrcih	409529
Bitplane 9.0.1	Imaris
BRAND cavity slides	Millipore Sigma	BR475505
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Strain #:000664
Circulation Pump	VWR	23609-170
CuSO4	Sigma Aldrcih	451657
DMSO	Sigma Aldrcih	D8418
EdU	Carboynth	NE08701
Heparin	Miiilipore Sigma	H3149
Imaging System	Olympus	DP27
LAS X Software	Leica
Olympus Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Paraformaldehye	Sigma Aldrich	P6148
PBS	Sigma Aldrich	P4417
PEGMMA500	Sigma Aldrich	447943
Quadrol	Sigma Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma Aldrich	11140
Sulfa-Cyanine 3 Azide	Lumiprobe	D1330
TBS-10X	Cell Signaling Technology	12498
TCS SP8 Confocal Microscope	Leica
tert-butanol (tB)	Sigma Aldrich	360538
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100