Detecção e Quantificação de Células Retentoras de Marcação em Incisivos de Camundongos utilizando uma Abordagem de Reconstrução 3D após Limpeza de Tecidos

Resumo

O incisivo de camundongo contém valiosas células retentoras de marcação em seu nicho de células-tronco. Temos uma nova maneira de detectar e quantificar imparcialmente as células de retenção de marcação; nosso estudo utilizou marcação com EdU e uma abordagem de reconstrução 3D após a limpeza tecidual da mandíbula pelo PEGASOS.

Resumo

O incisivo murino é um órgão que cresce continuamente ao longo da vida útil do rato. As células-tronco epiteliais e mesenquimais que residem nos tecidos proximais dos incisivos dão origem à progênie que se diferenciará em ameloblastos, odontoblastos e fibroblastos pulpar. Essas células são cruciais para suportar o turnover sustentado dos tecidos incisivos, tornando o incisivo murino um excelente modelo para estudar a homeostase de células-tronco adultas. Acredita-se que as células-tronco contenham células quiescentes de vida longa que podem ser marcadas por análogos de nucleotídeos, como 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU). As células retêm esse rótulo ao longo do tempo e, consequentemente, são chamadas de células de retenção de rótulo (LRCs). Abordagens para visualização de LRCs in vivo fornecem uma ferramenta robusta para monitorar a homeostase de células-tronco. Neste estudo, descrevemos um método para visualização e análise de LRCs. Nossa abordagem inovadora apresenta LRCs em incisivos de camundongos após limpeza do tecido e coloração de EdU de montagem total, seguida de microscopia confocal e reconstrução 3D (3D) com o software de imagem. Este método permite a aquisição de imagens 3D e quantificação não enviesada em comparação com a análise tradicional de LRCs em lâminas seccionadas.

Introdução

O incisivo de camundongo em crescimento contínuo é um excelente modelo para o estudo de células-tronco adultas¹. As células-tronco epiteliais (alça cervical labial e lingual) e mesenquimais (entre a alça cervical labial e lingual) que residem na face proximal do incisivo diferenciam-se em ameloblastos, odontoblastos e células da polpa dentária. Este processo único fornece uma fonte de células para compensação da perda e turnover tecidual². Embora vários marcadores de células-tronco como Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1, etc. foram identificadas in vivo para os subgrupos de células-tronco adultas em incisivos de camun....

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) para a Texas A&M University College of Dentistry.

1. Preparação do coquetel de rotulagem EdU

1. Preparar as soluções de coquetel conforme descrito na Tabela 1.
2. Preparar o coquetel de rotulagem da EdU conforme descrito na Tabela 1.

2. Preparação dos ratos e da solução de EdU

1. Prepare a solução EdU. Dissolver EdU em DMSO a 20 mg/mL e armazenar em freezer a -20 °C.
   CUIDADO: EdU é um agente mutagênico. Os utiliza....

Resultados

Após a marcação da EdU e o processo de limpeza tecidual PEGASOS (Figura 2), a mandíbula transparente foi obtida como mostrado em nossa imagem (Figura 3B). Comparamos a amostra modificada com uma mandíbula normal sem processo de limpeza tecidual (Figura 3A). A mandíbula transparente (Figura 3B) com marcação de EdU foi submetida a imagens confocais. Focamos no ápice do incisivo mostrando o nicho .......

Discussão

Doses múltiplas de injeções (BrdU, EdU) são geralmente usadas em camundongos neonatais em crescimento para marcar ao máximo as células em proliferação ^1,6,13. O período de perseguição é considerado uma etapa crítica em relação à taxa de renovação dos tecidos ^6,13. O incisivo do rato renova-se todos os meses. Essa característica permite que os pesquisad.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Sigma Aldrcih	E9884
20 × Objective/NA 0.9	Leica	507702
50 mL Falcon Centrifuge Tubes	Falcon	352070
BD PrecisionGlide Needle	BD	REF 305111
Bezyl benzoate (BB)	Sigma Aldrcih	409529
Bitplane 9.0.1	Imaris
BRAND cavity slides	Millipore Sigma	BR475505
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Strain #:000664
Circulation Pump	VWR	23609-170
CuSO4	Sigma Aldrcih	451657
DMSO	Sigma Aldrcih	D8418
EdU	Carboynth	NE08701
Heparin	Miiilipore Sigma	H3149
Imaging System	Olympus	DP27
LAS X Software	Leica
Olympus Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Paraformaldehye	Sigma Aldrich	P6148
PBS	Sigma Aldrich	P4417
PEGMMA500	Sigma Aldrich	447943
Quadrol	Sigma Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma Aldrich	11140
Sulfa-Cyanine 3 Azide	Lumiprobe	D1330
TBS-10X	Cell Signaling Technology	12498
TCS SP8 Confocal Microscope	Leica
tert-butanol (tB)	Sigma Aldrich	360538
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100