Обнаружение и количественное определение клеток, удерживающих метки, в резцах мышей с использованием подхода 3D-реконструкции после очистки тканей

Резюме

Резец мыши содержит ценные клетки, удерживающие метки, в нише стволовых клеток. У нас есть новый способ объективного обнаружения и количественной оценки клеток, удерживающих метки; в нашем исследовании использовалась маркировка EdU и подход к 3D-реконструкции после очистки ткани нижней челюсти PEGASOS.

Аннотация

Резец мыши — это орган, который непрерывно растет на протяжении всей жизни мыши. Эпителиальные и мезенхимальные стволовые клетки, находящиеся в проксимальных тканях резцов, дают начало потомству, которое дифференцируется в амелобласты, одонтобласты и фибробласты пульпы. Эти клетки имеют решающее значение для поддержания устойчивого оборота тканей резцов, что делает резец мыши отличной моделью для изучения гомеостаза взрослых стволовых клеток. Считается, что стволовые клетки содержат долгоживущие спокойные клетки, которые могут быть помечены нуклеотидными аналогами, такими как 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU). Клетки сохраняют эту метку с течением времени и, соответственно, называются клетками, удерживающими метки (LRC). Подходы к визуализации LRC in vivo обеспечивают надежный инструмент для мониторинга гомеостаза стволовых клеток. В этом исследовании мы описали метод визуализации и анализа ЦУР. Наш инновационный подход включает LRC в резцах мыши после очистки тканей и окрашивания EdU с последующим конфокальной микроскопией и 3-мерной (3D) реконструкцией с помощью программного обеспечения для визуализации. Этот метод позволяет получать 3D-изображения и несмещенное количественное определение по сравнению с традиционным анализом LRC на секционных слайдах.

Введение

Непрерывно растущий резец мыши является отличной моделью для изучения взрослых стволовых клеток¹. Эпителиальные (губная и язычная шейная петля) и мезенхимальные стволовые клетки (между лабиальной и язычной шейной петлей), которые находятся на проксимальной стороне резца, дифференцируются в амелобласты, одонтобласты и клетки пульпы зуба. Этот уникальный процесс обеспечивает источник клеток для компенсации потери и обновления тканей². Хотя несколько маркеров стволовых клеток, таких как Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1 и т. Д. были идентифицированы in vivo для подмножеств взрослых стволовых клеток в резцах мышей, они неадекватны в представлении популяций стволовых клеток при использовании только 1,3,4,5. Визуализация долгоживущих спокойных клеток с помощью нуклеотидной аналоговой маркировки и удержания ДНК может обеспечить объективное обнаружение для большинства подмножеств взрослых стволовых клеток⁶. Кроме того, этот подход полезен среди многих методов идентификации стволовых клеток⁷ для понимания поведения клеток и гомеостаза популяций стволовых клеток^{зубов 3,8}. В то время как делящиеся стволовые клетки теряют свою маркировку ДНК после значительной погони, предполагаемые спокойные стволовые клетки сохраняют свою метку ДНК, считая их клетками, сохраняющими метки (LRC)⁶. Маркировка и удержание ДНК неделящимися стволовыми клетками пометит и обнаружит предполагаемые взрослые стволовые клетки в их нишах.

За последние годы маркировка аналогом тимидина 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) заменила громоздкий, трудоемкий и несовместимый с микроскопией высокого разрешения метод маркировки ДНК 3H-тимидина для анализов пролиферации клеток ^6,9. В последние годы метод маркировки 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) все чаще используется в BrdU. Такая закономерность возникла по нескольким причинам. Во-первых, метод BrdU медленный и трудоемкий. Условия использования варьируются, и он не может сохранить ультраструктуру в образцах (из-за денатурации ДНК). Аналогичным образом, метод BrdU теряет антигенность клеток, что делает его неэффективным для последующих функциональных анализов и анализов, таких как эксперименты по совместной локализации и трансплантация стволовых клеток in vivo 3,7,9,10,11,12. BrdU также является тератогеном, который не подходит для маркировки LRC в эмбриональном развитии⁶. Кроме того, метод BrdU неэффективен при использовании в образцах с цельным креплением. Недостатками являются низкое проникновение антител в глубокую часть образцов или требование длительного инкубационного периода антител для глубокого проникновения¹³. Маркировка EdU избегает этапов денатурации образцов, тем самым сохраняя ультраструктуру. Эта особенность выгодна для последующих функциональных анализов, таких как эксперименты по совместной локализации и трансплантация стволовых клеток^11,12. Кроме того, маркировка EdU очень чувствительна и быстра; Проникновение образцов является высоким из-за использования быстро поглощаемых и меньших по размеру флуоресцентных азидов для детектирования меток EdU через катализируемую Cu (I) [3 + 2] реакцию циклоприсоединения («клик»)¹⁴.

Другим все более применяемым методом маркировки ДНК является использование сконструированных трансгенных мышей. Эти мыши экспрессируют зеленый флуоресцентный белок гистона 2B (H2B-GFP), контролируемый чувствительным к тетрациклину регуляторным элементом ^5,14. После кормления мышей тетрациклиновым кормом / водой в течение периода преследования от 4 недель до 4 месяцев флуоресценция GFP будет уменьшаться в циклических клетках, и только LRC сохранят флуоресценцию⁶. Преимущество этого метода заключается в том, что меченые LRC могут быть выделены и остаются жизнеспособными для культивирования клеток или последующего функционального анализа ^6,7. В некоторых исследованиях сообщалось о неточной маркировке стволовых клеток, находящихся в состоянии покоя, при длительном использовании. Этот результат был обусловлен негерметичной фоновой экспрессией штамма H2B-GFP, а не соответствующим тетрациклин-регулируемым ответом¹⁵.

Более того, в большинстве литературы в прошлом детектирование ЦУР использовалось в основном на секционных слайдах, которые являются двумерными и часто ошибочно предвзятыми в показе точного местоположения и количества ЦУР. Подход показал неправильные углы для срезов сложных тканевых структур¹⁶. Другой метод заключался в получении 3D-изображений из серийных срезов и выполнении реконструкций после изображения. Эти шаги были неточными из-за искажения изображения из-за вариаций в каждой последовательной секции из-за сжатых или растянутых секций, что привело к отсутствию информации^16,17,18. Метод также был трудоемким и длительным.

Чтобы облегчить визуализацию LRC во всей монтировке, образцы должны быть четкими, а флуоресценция должна поддерживаться в хорошем состоянии. Современные методы очистки тканей можно разделить на три основные категории: методы очистки тканей на основе органических растворителей, методы очистки тканей на основе водных реагентов и методы очистки тканей на основе гидрогеля^17,19. Недавно была разработана система растворителей, связанная с полиэтиленгликолем (ПЭГ) (PEGASOS). Этот подход делает почти все типы тканей прозрачными и сохраняет эндогенную флуоресценцию, включая твердые ткани, такие как кости и зубы²⁰. Метод PEGASOS имеет преимущества перед другими методами очистки тканей, особенно при очистке зубных и костных материалов. Большинство других методов могут лишь частично очищать твердые ткани, иметь длительное время обработки или требовать дорогостоящих реагентов²¹. Кроме того, метод PEGASOS может эффективно сохранять эндогенную флуоресценцию по сравнению с другими методами.

Эта литература привела нас к созданию нового метода исследования клеток. Мы объединили преимущества маркировки EdU для обнаружения LRC с наиболее превосходной 3D-визуализацией образцов, очищенных от ткани; образцы обрабатывали с использованием усовершенствованной технологии очистки тканей с помощью системы растворителей, связанной с полиэтиленгликолем (ПЭГ) (PEGASOS)¹⁵. Прозрачность твердых тканей позволила нам реконструировать 3D-сигнал флуоресценции LRC in vivo без разрушения зубов или нижней челюсти, создав более точный способ визуализации и количественной оценки LRC.

В этом исследовании мы представляем инновационное руководство по визуализации LRC в резце мыши. Мы использовали 3D-визуальный подход для определения местоположения и количества LRC в нише стволовых клеток резцов мыши. В этом проекте использовалась маркировка EdU, методы очистки тканей PEGASOS и конфокальная микроскопия. Наш метод маркировки EdU LRC на цельной ткани и использование очищенного и прозрачного образца преодолевает как ограничения традиционных секционных слайдов, так и другие невыгодные методы маркировки ДНК. Таким образом, наша методика будет пригодна для исследований гомеостаза стволовых клеток, требующих обнаружения ЛРК, особенно на твердых тканях. Протокол может быть одинаково полезен для тех, кто фокусируется на гомеостазе стволовых клеток в других тканях и органах.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) для Стоматологического колледжа Техасского университета A&M.

1. Приготовление коктейля с маркировкой EdU

1. Приготовьте растворы для коктейлей, как описано в таблице 1.
2. Приготовьте коктейль с маркировкой EdU, как описано в таблице 1.

2. Приготовление мышей и раствора EdU

1. Приготовьте раствор EdU. Растворите EdU в ДМСО в дозе 20 мг/мл и храните в морозильной камере при температуре -20 °C.
   ВНИМАНИЕ: EdU является мутагеном. Пользователи должны носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) при работе с этим веществом.
2. Внутрибрюшинно вводите 5-дневным мышам C57BL/6J приготовленный раствор EdU в дозе 3 мкл / г массы тела. Мыши должны получать раствор один раз в сутки в течение 7 дней подряд. Затем они проходят период погони в течение 6 недель, прежде чем будут собраны для анализа (рис. 1).
   ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать укола иглой при введении EdU мышам. После инъекции EdU в течение 7 дней подряд поместите мышей в новую клетку. После того, как мыши окажутся в своем новом доме, утилизируйте подстилку в старой клетке, используя соответствующие правила биологической опасности.

3. Подготовка образцов методом транскардиальной перфузии (постнатальные 53-дневные мыши после 6-недельного периода погони)

ПРИМЕЧАНИЕ: Печень мыши должна побледнеть после успешной транссердечной перфузии.

1. Обезболивают мышей внутрибрюшинной инъекцией. Им необходимо давать комбинацию ксилазина и кетаминовых анестетиков (ксилазин 10-12,5 мг / кг; Кетамин, 80-100 мг/кг массы тела).
2. Подождите ~ 10 минут, пока мышь не перестанет реагировать на болевые раздражители (например, рефлексы ущипывания лап).
3. Поместите мышей в лежачее положение, стабилизированное на опоре из пенополистирола с иглами в каждой лапе.
4. Обнажите грудную полость, открыв вышележащую кожу с помощью пинцета и рассекающих ножниц.
5. Разрежьте диафрагму острыми ножницами. Следите за тем, чтобы не проткнуть сердце.
6. Разрезают грудную клетку, захватывая ножницами основание грудины, чтобы обнажить сердце.
7. Переведите мышь на перфузионную стадию рядом с циркуляционным насосом в вытяжном шкафу.
8. Вставьте иглу 25 G (из трубки, заполненной фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS)/4% раствором параформальдегида (PFA)) в верхушку левого желудочка. Следите за тем, чтобы кончик иглы оставался в просвете желудочка.
   ВНИМАНИЕ: PFA умеренно токсичен и является вероятным канцерогеном. Используйте СИЗ для обработки PFA и приготовления раствора под химическим вытяжным шкафом. Отходы PFA требуют надлежащей утилизации в соответствии с руководящими принципами учреждения.
9. Разрежьте правый желудочек с помощью острых ножниц сразу после введения иглы в левый желудочек. Этот шаг позволяет крови вытекать из мыши и стекать в чашку для сбора.
10. Перфузируют образцы 50 мл раствора PBS со скоростью потока 7 мл / мин.
11. После перфузии PBS переключите запорный кран, чтобы обеспечить поток 20 мл 4% раствора PFA при той же скорости потока 5 мл / мин.
12. Пока циркуляционный насос все еще включен, извлеките иглу из левого желудочка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь теперь закреплена для сбора тканей. Чтобы сохранить флуоресценцию, следует по возможности избегать воздействия света на протяжении всего протокола. Во время обработки ткани коническая пробирка объемом 50 мл с образцами ткани может быть покрыта алюминиевой фольгой.

4. Очистка тканей нижней челюсти по методике PEGASOS

ПРИМЕЧАНИЕ: Коническая пробирка объемом 15 мл или 50 мл в зависимости от объема тканей может использоваться для поддержания образцов готовыми к обработке на каждом этапе. Образцы обрабатываются при шейкерах при 37 °C (~100 об/мин) с этапов 4.2 по 4.7. Используйте пластиковые контейнеры на основе полипропилена, устойчивые к органическим растворителям, чтобы избежать плавления пластика. В качестве альтернативы можно использовать стеклянную посуду.

ВНИМАНИЕ: В методе очистки тканей PEGASOS используются токсичные растворы, такие как квадрол, полиэтиленгликоль (ПЭГ), бензилбензоат (BB), MMA500 и т. Д. Во избежание потенциального воздействия требуются соответствующие СИЗ.

1. Препарируют нижние челюсти и дополнительно фиксируют образцы в 4% ПФА. Держите их при комнатной температуре в течение ночи.
2. Удалите мышцы с нижней челюсти и погрузите их в 0,5 М раствор ЭДТА (рН 8,0) для декальцинации в течение 4 дней. В течение этого периода выполняйте ежедневную смену среды на шейкере с температурой 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Желательно максимально удалить мышцы из образца. Эта мера предосторожности упростит процесс визуализации и уменьшит аутофлуоресценцию мышц.
3. Обесцвечивайте мандибулы 25% раствором квадрола (v/v in H₂O) на шейкере при 37 °C в течение одного дня, чтобы удалить оставшийся гем крови.
4. Завершите окрашивание всего крепления EdU.
   1. Приготовьте свежий коктейль с маркировкой EdU в соответствии с таблицей 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коктейль для маркировки EdU необходимо каждый раз делать свежим с добавлением свежеприготовленного раствора аскорбата для получения оптимальных результатов маркировки EdU.
   2. Промойте нижние челюсти PBST в течение 30 минут на шейкере при температуре 37 °C.
   3. Промойте мандибулы PBS три раза в течение 3 минут каждый раз.
   4. Инкубируйте челюсти в свежеприготовленном коктейле с маркировкой EdU на шейкере при температуре 37 °C в течение ночи.
   5. Промойте мандибулы PBS три раза в течение 3 минут каждый раз.
5. Проводят серийную делипидизацию в каждом из следующих растворов в течение 6 ч при 37 °C:
   30% раствор трет-бутанола (тБ): 75% об./об_{. Н2}О, 22% об./об. тБ и 3% об./об. Квадрола.
   50% раствор тБ: 50% об./об. H₂O, 47% v/v tB и 3% v/v Quadrol.
   70% раствор тБ: 30% об./об. H₂O, 67% v/v tB и 3% v/v Quadrol
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этап делипидизации имеет решающее значение. Делипидизацию можно проводить между 4-6 ч в 30% и 50% тБ растворе и в течение 1 дня в 70% тБ растворе.
6. Обезвоживают мандибулы в растворе тБ-ПЭГ в течение 2 дней со следующей суточной сменой среды: 75% тБ, 22% метакрилата метилового эфира полиэтиленгликоля в среднем MMA500 и 3% об./об. Квадрола при 37 ° C.
7. Очистите нижнюю челюсть в очищающей среде бензилбензоата (BB)-ПЭГ, чтобы получить соответствие показателя преломления: 75% об./об. BB, 22% об./об. PEG-MMA500 и 3% квадрола до достижения прозрачности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: У нас есть информация о согласовании показателя преломления. Неорганические и органические компоненты в тканях, такие как вода, липиды, белки, минералы, органеллы и т. Д. имеют разный показатель преломления (RI) в диапазоне от 1,33 до 1,55. Это несоответствие RI между тканевыми компонентами затрудняет процесс визуализации. Прозрачность может быть достигнута путем устранения несоответствия RI внутри ткани. Рекомендуется погружать очищенные от тканей образцы в очищающую среду BB-PEG. Этот шаг даст равномерный внутренний RI ~ 1,54 (называемый соответствием RI) для всего образца, что облегчит процесс визуализации.
8. Сохраняйте мандибулы в среде для очистки тканей BB-PEG при комнатной температуре для хранения и визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо завершить визуализацию как можно скорее, чтобы избежать постепенной потери флуоресцентных репортеров. Тем не менее, метод PEGASOS сохранит флуоресцентные репортеры хорошо сохраниться даже после нескольких недель хранения^20,21. Для длительного хранения образцы также могут храниться при температуре 4 ° C.

5. Конфокальная визуализация очищенной ткани нижней челюсти

1. Установите очищенную ткань целиком нижней челюсти на фирменные половые стекла в очищающей среде BB-PEG и накройте стеклянными предметными стеклами. Избегайте пузырьков.
2. Выполните получение изображения с помощью подходящего лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Выберите «Получить » и установите параметры получения изображения с разрешением 512 x 512 пикселей и скоростью захвата 400 Гц. Эти настройки находятся в меню режима сбора данных программного обеспечения, управляющего микроскопом.
3. В панели флуоресцентного возбуждения активируйте необходимый лазер (TRITC) для оптимального возбуждения флуорофоров (зонд, который мы использовали для визуализации LRC, обладает флуоресцентными свойствами, такими как Cy3 с возбуждением при 548 нм и излучением при длине волны лазера 563 нм).
4. На панели для флуоресцентного обнаружения переместите ползунок, чтобы выбрать длины волн, которые будут измеряться (например, от 555 до 625 нм для флуорофора, подобного Cy3).
5. Поместите установленную нижнюю челюсть на столик микроскопа, чтобы визуализировать и найти образец с помощью белого света и объектива с меньшим увеличением (2-10x).
6. Добавьте каплю иммерсионного масла с показателем преломления 1,52 поверх покровного стекла, чтобы оно соответствовало показателю преломления стеклянного покровного стекла и объектива.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как можно точнее сопоставьте показатель преломления объективов, носителей изображения и тканей, чтобы свести к минимуму появление оптических искажений во время получения изображения.
7. Включите люминесцентные лампы и выберите подходящий объектив увеличения для интересующих областей изображения. Мы использовали объектив 20x с числовой апертурой 0,9 и рабочим расстоянием 1,95 мм. Линза с большим рабочим расстоянием может потребоваться при визуализации больших образцов тканей в конфокальном микроскопе. В качестве альтернативы, визуализация может быть легко выполнена с использованием светового микроскопа для более крупных образцов тканей.
8. В программном обеспечении для конфокальной визуализации нажмите кнопку Live , чтобы запустить режим сканирования в реальном времени. Чтобы максимально увеличить динамический диапазон изображений и избежать насыщенности пикселей, отрегулируйте усиление и интенсивность лазера для выбранного канала.
9. Определите поле зрения, чтобы визуализировать всю область нижней челюсти в измерениях X и Y. Установите верхние и нижние параметры сбора Z-стадии, которые точно покрывают объем ниши стволовых клеток в резце мышей. Используйте размер шага Z 2 мкм или в соответствии с вашими требованиями. Новые версии конфокальных микроскопов должны иметь возможность автоматически получать z-стеки различных перекрывающихся областей.
10. Получение и сохранение файлов изображений Z-stack в формате .lif.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи .lif могут быть преобразованы в файлы .tiff и использованы для другого программного обеспечения для 3D-анализа.

6. Обработка изображений, реконструкция 3D-изображений и количественная оценка ячеек, удерживающих метки, путем создания поверхности, сегментации интересующей области (ROI), маскировки ROI и создания пятен

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали Imaris (Bitplane 9.0.1) для обработки изображений и 3D-реконструкции, но аналогичные этапы обработки изображений могут быть выполнены с использованием других программных пакетов (например, ImageJ/Fiji, 3D slicer, Avizo, Arivis, Amira и т.д.).

1. В программном обеспечении для обработки изображений нажмите кнопку « Арена », затем выберите «Изображение». Выберите исходный файл . lif и выберите объединенный файл , изображения будут импортированы в программное обеспечение для обработки изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте конвертер файлов программного обеспечения для обработки изображений для преобразования файла изображения стека Z в собственный тип файла формата для программного обеспечения. Например: преобразуйте файлы .lif в файлы .ims с помощью конвертера файлов Imaris и откройте файлы .ims в программном обеспечении для обработки изображений. Преобразование данных в собственный формат файла программного обеспечения позволит быстро преобразовать файлы и свести к минимуму ошибки.
2. Дважды щелкните импортированный файл, чтобы открыть набор данных изображения.
3. Посетите панель «Настройка дисплея », щелкните название канала. Обычно он помечается как красный в режиме по умолчанию.
   1. В окне « Свойства изображения » перейдите на вкладку «Сопоставленный цвет ». В опции « Файл таблицы цветов » выберите «Огненный поток» и нажмите « ОК». Цвет дисплея обычно выбирается таким образом, чтобы отличить фоновую флуоресценцию и положительную флуоресценцию образца.
4. В верхнем левом углу экрана на панели « Сцена — свойства » нажмите на синий значок с надписью « Добавить новую поверхность». Снимите флажок « Громкость », чтобы удалить большую часть фоновой флуоресценции, и положительная флуоресценция отчетливо видна (см. Этап 6.4.2).
   1. Запустите процесс ручной сегментации интересующего региона (ROI), щелкнув вкладку « Создать » и выбрав вкладку « Пропустить автоматическое создание», «Редактировать вручную ». В мастере ручного создания поверхности щелкните вкладку «Контур », чтобы выбрать ориентацию (XY, YZ или XZ) на основе образцов, чтобы легко очертить рентабельность инвестиций. Здесь мы выбираем ориентацию XY.
   2. Затем убедитесь, что меню указателя в правом углу находится в режиме выбора . Отрегулируйте положение среза , чтобы определить рентабельность инвестиций в ткани. Вы заметите, что большая часть фоновой флуоресценции была удалена с отчетливой положительной флуоресценцией, как упоминалось на шаге 6.4. Нажмите кнопку «Нарисовать » и нарисуйте ориентировочную область интереса. Выберите параметр « Видимость » для «Нет », чтобы избежать помех из других областей, кроме ROI.
   3. Повторите шаг 6.4.2. Срез за срезом, чтобы нарисовать всю интересующую область.
   4. После завершения чертежа ROI нажмите « Создать поверхность », чтобы получить 3D-геометрию ROI.
   5. Нажмите кнопку « Изменить » в мастере ручного создания поверхностей и выберите «Маскировать все».
   6. Во всплывающем окне « Канал маски » выберите «Канал 1 » в параметрах выбора канала. После этого выберите «Дублировать канал перед применением маски». В настройках маски выберите «Константа внутри/снаружи » и установите воксельную внешнюю поверхность на 0.
   7. В области « Сцена-Свойства » снимите выбор с объекта Surface и выберите объект «Объем». В разделе «Настройка дисплея» отмените выбор исходного «красного» канала и выберите замаскированный красный канал и отрегулируйте интенсивность цвета, чтобы получить желаемую рентабельность инвестиций в флуоресценцию с 3D-рендерингом и положительной меткой.
5. Создайте новый точечный объект. Начните с нажатия на значок «Добавить пятна», чтобы количественно оценить LRC с 3D-рендерингом, создав 3D-пятна, которые сравнительно перекрываются с LRC с 3D-рендерингом. Используйте нижние стрелки для перемещения между шагами в мастере создания точек.  
   1. В мастере создания пятен будет четыре последовательных шага инструкций для автоматического создания пятен с помощью программного обеспечения. Убедитесь, что на первом шаге выбран параметр «Сегментировать только область интереса». Нажмите на значок «Далее ».
   2. На втором этапе будет «XYZ 3D box». Отрегулируйте поле XYZ, чтобы покрыть рентабельность инвестиций. Нажмите на значок «Далее ».
   3. На третьем шаге перейдите к параметрам исходного канала . Выберите замаскированный красный канал; введите расчетный диаметр пятна XY, сравнимый с подгонкой и перекрытием точек флуоресценции образца. Нажмите на значок «Далее ».
   4. На четвертом шаге добавьте тип фильтра «Качество» и отрегулируйте нижний порог интенсивности, перемещая скользящее окно по гистограмме «Качество» до тех пор, пока не будет помечено большинство идентифицируемых LRC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сегментация и, следовательно, статистические показания (например, количество ячеек) очень сильно зависят от пороговых значений интенсивности. Будьте внимательны, чтобы точно установить соответствующие пороговые значения.
   5. Нажмите кнопку « Готово» и выберите кнопку «Статистика ». Перейдите на вкладку «Общие », чтобы найти значение общего количества пятен на изображении.
   6. Экспортируйте статистику, нажав на кнопку Tab Display to File , и получите результаты в .xls файле.
   7. Используйте подходящую диаграмму для представления результатов количественной оценки.

Результаты

После маркировки EdU и процесса очистки тканей PEGASOS (рис. 2) была получена прозрачная нижняя челюсть, как показано на нашем изображении (рис. 3B). Мы сравнили модифицированный образец с нормальной нижней челюстью без процесса очистки тканей (рис. 3А...

Обсуждение

Многократные дозы инъекций (BrdU, EdU) обычно используются на растущих новорожденных мышах, чтобы максимально маркировать пролиферирующие клетки ^1,6,13. Период погони считается критическим шагом в отношении скорости обновления тканей

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Sigma Aldrcih	E9884
20 × Objective/NA 0.9	Leica	507702
50 mL Falcon Centrifuge Tubes	Falcon	352070
BD PrecisionGlide Needle	BD	REF 305111
Bezyl benzoate (BB)	Sigma Aldrcih	409529
Bitplane 9.0.1	Imaris
BRAND cavity slides	Millipore Sigma	BR475505
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Strain #:000664
Circulation Pump	VWR	23609-170
CuSO4	Sigma Aldrcih	451657
DMSO	Sigma Aldrcih	D8418
EdU	Carboynth	NE08701
Heparin	Miiilipore Sigma	H3149
Imaging System	Olympus	DP27
LAS X Software	Leica
Olympus Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Paraformaldehye	Sigma Aldrich	P6148
PBS	Sigma Aldrich	P4417
PEGMMA500	Sigma Aldrich	447943
Quadrol	Sigma Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma Aldrich	11140
Sulfa-Cyanine 3 Azide	Lumiprobe	D1330
TBS-10X	Cell Signaling Technology	12498
TCS SP8 Confocal Microscope	Leica
tert-butanol (tB)	Sigma Aldrich	360538
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100