Rilevamento e quantificazione delle cellule che conservano l'etichetta negli incisivi di topo utilizzando un approccio di ricostruzione 3D dopo la pulizia dei tessuti

Riepilogo

L'incisivo del topo contiene preziose cellule che conservano l'etichetta nella sua nicchia di cellule staminali. Abbiamo un nuovo modo per rilevare e quantificare in modo imparziale le celle che conservano l'etichetta; il nostro studio ha utilizzato l'etichettatura EdU e un approccio di ricostruzione 3D dopo la pulizia del tessuto PEGASOS della mandibola.

Abstract

L'incisivo murino è un organo che cresce continuamente per tutta la durata della vita del topo. Le cellule staminali epiteliali e mesenchimali che risiedono nei tessuti prossimali degli incisivi danno origine a progenie che si differenziano in ameloblasti, odontoblasti e fibroblasti della polpa. Queste cellule sono cruciali nel sostenere il turnover sostenuto dei tessuti incisivi, rendendo l'incisivo murino un modello eccellente per studiare l'omeostasi delle cellule staminali adulte. Si ritiene che le cellule staminali contengano cellule quiescenti di lunga durata che possono essere etichettate con analoghi nucleotidici come la 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU). Le cellule mantengono questa etichetta nel tempo e sono di conseguenza chiamate cellule di conservazione dell'etichetta (LRC). Gli approcci per la visualizzazione di LRC in vivo forniscono uno strumento robusto per il monitoraggio dell'omeostasi delle cellule staminali. In questo studio, abbiamo descritto un metodo per visualizzare e analizzare gli LRC. Il nostro approccio innovativo prevede LRC negli incisivi di topo dopo la pulizia dei tessuti e la colorazione EdU a montaggio completo, seguita da microscopia confocale e ricostruzione tridimensionale (3D) con il software di imaging. Questo metodo consente l'acquisizione di immagini 3D e la quantificazione non distorta rispetto all'analisi LRC tradizionale su vetrini sezionati.

Introduzione

L'incisivo di topo in continua crescita è un modello eccellente per lo studio delle cellule staminali adulte¹. Le cellule staminali epiteliali (ansa cervicale labiale e linguale) e mesenchimali (tra l'ansa cervicale labiale e linguale) che risiedono sul lato prossimale dell'incisivo si differenziano in ameloblasti, odontoblasti e cellule polpa dentali. Questo processo unico fornisce una fonte di cellule per la compensazione della perdita di tessuto e del turnover². Anche se diversi marcatori di cellule staminali come Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, ecc. sono stati identificati in vivo per i sottogruppi di cellule....

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) per il Texas A & M University College of Dentistry.

1. Preparazione del cocktail di etichettatura EdU

1. Preparare le soluzioni di cocktail come descritto nella tabella 1.
2. Preparare il cocktail di etichettatura EdU come descritto nella Tabella 1.

2. Preparazione dei topi e della soluzione EdU

1. Preparare la soluzione EdU. Sciogliere EdU in DMSO a 20 mg/ml e conservare in un congelatore a -20 °C.
   ATTENZIONE: ....

Risultati

Dopo l'etichettatura EdU e il processo di eliminazione dei tessuti PEGASOS (Figura 2), la mandibola trasparente è stata ottenuta come mostrato nella nostra immagine (Figura 3B). Abbiamo confrontato il campione modificato con una mandibola normale senza un processo di pulizia dei tessuti (Figura 3A). La mandibola trasparente (Figura 3B) con etichettatura EdU è stata sottoposta a imaging confocale. Ci s.......

Discussione

Dosi multiple di iniezioni (BrdU, EdU) sono solitamente utilizzate su topi neonatali in crescita per etichettare il più possibile le cellule proliferanti ^1,6,13. Il periodo di inseguimento è considerato un passo critico per quanto riguarda il tasso di rinnovamento dei tessuti ^6,13. L'incisivo del topo si rinnova circa ogni mese. Questa caratteristica consente ai ricerc.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Sigma Aldrcih	E9884
20 × Objective/NA 0.9	Leica	507702
50 mL Falcon Centrifuge Tubes	Falcon	352070
BD PrecisionGlide Needle	BD	REF 305111
Bezyl benzoate (BB)	Sigma Aldrcih	409529
Bitplane 9.0.1	Imaris
BRAND cavity slides	Millipore Sigma	BR475505
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Strain #:000664
Circulation Pump	VWR	23609-170
CuSO4	Sigma Aldrcih	451657
DMSO	Sigma Aldrcih	D8418
EdU	Carboynth	NE08701
Heparin	Miiilipore Sigma	H3149
Imaging System	Olympus	DP27
LAS X Software	Leica
Olympus Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Paraformaldehye	Sigma Aldrich	P6148
PBS	Sigma Aldrich	P4417
PEGMMA500	Sigma Aldrich	447943
Quadrol	Sigma Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma Aldrich	11140
Sulfa-Cyanine 3 Azide	Lumiprobe	D1330
TBS-10X	Cell Signaling Technology	12498
TCS SP8 Confocal Microscope	Leica
tert-butanol (tB)	Sigma Aldrich	360538
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100