Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

요약

마우스 앞니는 줄기 세포 틈새에 귀중한 표지 유지 세포를 포함합니다. 우리는 라벨 유지 세포를 편견 없이 검출하고 정량화하는 새로운 방법을 가지고 있습니다. 우리의 연구는 하악의 PEGASOS 조직 제거 후 EdU 라벨링과 3D 재구성 접근법을 사용했습니다.

초록

쥐 앞니는 마우스의 수명 동안 지속적으로 성장하는 기관입니다. 앞니의 근위 조직에 존재하는 상피 및 중간엽 줄기 세포는 아멜로아세포, 치모세포 및 치수 섬유아세포로 분화할 자손을 생성합니다. 이 세포는 앞니 조직의 지속적인 회전율을 지원하는 데 중요하므로 쥐 앞니는 성체 줄기 세포의 항상성을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다. 줄기 세포는 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)과 같은 뉴클레오티드 유사체에 의해 표지 될 수있는 수명이 긴 정지 세포를 함유하고있는 것으로 여겨진다. 셀은 시간이 지남에 따라 이 레이블을 유지하며 그에 따라 레이블 유지 셀(LRC)로 명명됩니다. 생체 내에서 LRC를 시각화하기 위한 접근 방식은 줄기 세포 항상성을 모니터링하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 본 연구에서는 LRC를 시각화하고 분석하는 방법에 대해 설명하였다. 당사의 혁신적인 접근 방식은 조직 세척 후 마우스 앞니의 LRC와 전체 장착 EdU 염색 후 컨포칼 현미경 및 이미징 소프트웨어를 사용한 3차원(3D) 재구성을 특징으로 합니다. 이 방법은 단면 슬라이드에 대한 기존 LRC 분석과 비교하여 3D 이미징 획득 및 비편향 정량화를 가능하게 합니다.

서문

지속적으로 성장하는 쥐 앞니는 성체 줄기 세포 연구를 위한 훌륭한 모델이다¹. 앞니의 근위부에 상피(순순 및 설측 자궁경부 루프)와 중간엽 줄기세포(순순과 설측 경추 루프 사이)는 아멜로모세포, 치모세포, 치수 세포로 분화합니다. 이 독특한 과정은 조직 손실과 회전율을 보상하기 위한 세포의 공급원을 제공한다². Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 등과 같은 여러 줄기 세포 마커가 있지만. 마우스 앞니에서 성체 줄기 세포의 서브세트에 대해 생체 내에서 확인되었으며, 이들은 단독으로 사용될 때 줄기 세포 집단을 나타내는데 부적절하다 1,3,4,5. 뉴클레오티드 유사체 DNA 라벨링 및 보존에 의해 수명이 긴 정지 세포를 시각화하면 대부분의 성체 줄기 세포 하위 집합에 대해 편견 없는 검출을 제공할 수^{있습니다 6}. 또한, 이러한 접근법은 세포 거동과 치아 줄기 세포 집단^3,8의 항상성을 이해하기 위한 많은 줄기 세포 식별 방법7 중에서 유용하다. 분열하는 줄기 세포는 상당한 추적 후에 DNA 라벨링을 잃게 되지만, 추정되는 정지 줄기 세포는 DNA 라벨을 유지하여 라벨 유지 세포(LRC^)로 간주합니다6. 분열하지 않는 줄기 세포에 의한 DNA 라벨링 및 보유는 틈새 시장에서 추정되는 성체 줄기 세포를 표시하고 찾습니다.

지난 몇 년 동안 티미딘 유사체 5-브로모-2′-데옥시유리딘(BrdU) 표지는 세포 증식 분석을 위한 번거롭고 시간이 많이 소요되는 고해상도 현미경 비호환 3H-티미딘 DNA 표지 방법을 대체했습니다 ^6,9. 최근 몇 년 동안 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU) 표지 기술이 BrdU보다 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 이 패턴은 몇 가지 이유로 나타났습니다. 첫째, BrdU 방법은 느리고 노동 집약적입니다. 사용자 조건은 가변적이며 검체의 미세 구조를 보존할 수 없습니다(DNA 변성으로 인해). 마찬가지로, BrdU 방법은 세포의 항원성을 상실하여 공동 국소화 실험 및 생체 내 줄기 세포 이식 3,7,9,10,11,12와 같은 다운스트림 기능 분석 및 분석에 비효율적입니다. BrdU는 또한 기형 유발 물질로, 배아 발달에서 LRC를 표지하는 데 적합하지 않다⁶. 또한 BrdU 방법은 전체 장착 시편에 사용할 때 비효율적입니다. 단점은 검체의 깊은 부분에서의 항체 침투율이 낮거나 깊은 침투를 위해 긴 항체 배양 기간이 필요하다는 점이다¹³. EdU 라벨링은 표본을 변성시키는 단계를 벗어나 미세 구조를 보존합니다. 이 특징은 co-localization 실험 및 줄기 세포 이식과 같은 다운스트림 기능 분석에 유리합니다^11,12. 또한 EdU 라벨링은 매우 민감하고 빠릅니다. Cu(I) 촉매 [3 + 2] 고리첨가 반응("클릭" 화학)¹⁴을 통해 EdU 라벨을 검출하기 위해 빠르게 흡수되고 더 작은 크기의 형광 아지드를 사용하기 때문에 시편 침투율이 높습니다.

점점 더 많이 적용되는 또 다른 DNA 라벨링 방법은 조작된 형질전환 마우스를 사용하는 것입니다. 이 마우스는 테트라사이클린 반응성 조절 요소 ^5,14에 의해 제어되는 히스톤 2B 녹색 형광 단백질(H2B-GFP)을 발현합니다. 4주에서 4개월의 추적 기간 동안 생쥐에게 테트라사이클린 차우/물을 먹인 후, GFP 형광은 사이클링 세포에서 감소하고 LRC만이 형광을 유지합니다⁶. 이 방법의 장점은 표지된 LRC를 분리할 수 있고 세포 배양 또는 다운스트림 기능 분석에 사용할 수 있다는 것입니다 ^6,7. 일부 연구에서는 장기간 사용을 위해 추적했을 때 정지 줄기 세포의 부정확한 라벨링을 보고했습니다. 이 결과는 H2B-GFP 균주에서 새는 배경 발현으로 인한 것이지 적절한 테트라사이클린 조절 반응이 아니었기 때문이다¹⁵.

더욱이 과거의 대부분의 문헌은 주로 단면 슬라이드에서 LRC 검출을 사용했는데, 이는 2차원이며 LRC의 정확한 위치와 수를 표시하는 데 종종 잘못 편향되어 있습니다. 이 접근법은 복잡한 조직 구조의 절편에 대해 부정확한 각도를 표시하였다¹⁶. 다른 방법은 직렬 섹션에서 3D 이미지를 얻고 사후 이미지 재구성을 수행하는 것이었습니다. 이들 단계들은 압축되거나 늘어난 섹션들로 인한 각각의 시리얼 섹션들의 변형으로 인한 이미지 왜곡 때문에 부정확하였고, 그 결과 정보^(16,17,18)가 누락되었다. 이 방법은 또한 힘들고 시간이 많이 걸렸습니다.

LRC의 전체 마운트 이미징을 용이하게 하려면 형광이 잘 유지되는 동안 샘플을 선명하게 해야 합니다. 현재의 조직 투명화 기술은 세 가지 주요 범주로 분류할 수 있다: 유기 용매 기반 조직 투명화 기술, 수성 시약 기반 조직 투명화 기술, 및 하이드로겔 기반 조직 투명화 기술^17,19. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관련 용매 시스템(PEGASOS)이 최근에 개발되었습니다. 이 접근법은 거의 모든 유형의 조직을 투명하게 만들고 뼈와 치아와 같은 경조직을 포함한 내인성 형광을 보존한다²⁰. PEGASOS 방법은 특히 치아 및 뼈 재료를 청소할 때 다른 조직 청소 방법에 비해 장점이 있습니다. 대부분의 다른 방법들은 경조직을 부분적으로만 제거할 수 있거나, 처리 시간이 길거나, 값비싼 시약을 필요로 한다²¹. 또한 PEGASOS 분석법은 다른 분석법에 비해 내인성 형광을 효율적으로 보존할 수 있습니다.

이 문헌은 우리로 하여금 세포 연구를 위한 새로운 방법을 만들도록 이끌었습니다. 우리는 EdU 라벨링의 LRC 검출 이점과 조직 투명 표본의 가장 우수한 3D 전체 마운트 이미징을 결합했습니다. 샘플을 고급 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관련 용매 시스템(PEGASOS) 조직 투명화 기술¹⁵로 처리하였다. 경조직 투명성을 통해 치아나 하악골을 부러뜨리지 않고 생체 내에서 LRC 형광의 3D 신호를 재구성할 수 있어 LRC를 시각화하고 정량화하는 보다 정확한 방법을 만들 수 있었습니다.

이 연구에서는 마우스 앞니에서 LRC를 시각화하는 혁신적인 가이드를 제공합니다. 우리는 마우스 앞니 줄기 세포 틈새 내에서 LRC의 위치와 양을 결정하기 위해 3D 시각적 접근 방식을 만들었습니다. 이 프로젝트에서는 EdU 라벨링, PEGASOS 조직 투명화 기술 및 컨포칼 현미경을 사용했습니다. 전체 마운트 조직에 LRC를 EdU로 라벨링하는 당사의 방법과 투명하고 투명한 표본을 사용하는 방법은 기존의 절편 슬라이드와 기타 불리한 DNA 라벨링 방법의 한계를 모두 극복합니다. 따라서 우리의 기술은 LRC 검출이 필요한 줄기 세포 항상성 연구, 특히 경조직에 적합 할 것입니다. 이 프로토콜은 다른 조직과 기관의 줄기 세포 항상성에 초점을 맞춘 사람들에게도 똑같이 유리할 수 있습니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 Texas A&M University College of Dentistry의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. EdU 라벨링 칵테일의 제조

1. 표 1에 기재된 바와 같이 칵테일 스톡 용액을 준비한다.
2. 표 1에 설명된 대로 EdU 라벨링 칵테일을 준비합니다.

2. 마우스 및 EdU 용액의 제조

1. EdU 솔루션을 준비합니다. EdU를 DMSO에 20mg/mL로 녹이고 -20°C 냉동고에 보관합니다.
   주의: EdU는 돌연변이 유발 물질입니다. 사용자는 이 물질을 취급할 때 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다.
2. 5일령 C57BL/6J 마우스에 준비된 EdU 용액을 3μL/g 체중으로 복강 주사합니다. 마우스는 연속 7일 동안 하루에 한 번 용액을 받아야 합니다. 다음으로, 분석을 위해 수확되기 전에 6주 동안 추적 기간을 거칩니다(그림 1).
   주의 : EdU를 마우스에 주사할 때 바늘이 찔리지 않도록 주의하십시오. 연속 7일 동안 EdU를 주사한 후 마우스를 새 케이지에 넣습니다. 생쥐가 새 집에 들어간 후에는 적절한 생물학적 위험 규칙을 사용하여 오래된 새장에 침구를 버리십시오.

3. 경심 관류에 의한 시료 준비(생후 53일령 마우스, 6주간의 체이스 기간 후)

참고: 마우스 간은 성공적인 경심장 관류 후 창백해져야 합니다.

1. 복강 주사로 마우스를 마취하십시오. 자일라진과 케타민 마취제(자일라진 10-12.5 mg/kg; 케타민, 80-100 mg/kg 체중).
2. 마우스가 더 이상 고통스러운 자극(예: 발 꼬집음 반사)에 반응하지 않을 때까지 ~10분 동안 기다립니다.
3. 각 발에 바늘이 있는 스티로폼 지지대에 안정된 앙와위 자세로 마우스를 놓습니다.
4. 핀셋과 가위를 사용하여 위에 놓인 피부를 열어 흉강을 노출시킵니다.
5. 날카로운 가위로 다이어프램을 자릅니다. 심장을 뚫지 않도록주의하십시오.
6. 흉곽을 자르고 클램프 가위로 흉골 기저부를 잡고 심장을 노출시킵니다.
7. 마우스를 관류로 옮깁니다.tage 흄 후드의 순환 펌프 근처.
8. 25G 바늘(인산염 완충 식염수(PBS)/4% 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 채워진 튜브에서)을 좌심실 정점에 삽입합니다. 바늘 끝이 심실의 내강에 유지되도록주의하십시오.
   주의: PFA는 중간 정도의 독성을 지니고 있으며 발암 가능성이 있습니다. PPE를 사용하여 PFA를 처리하고 화학 흄 후드 아래에서 용액을 준비하십시오. 폐기물 PFA는 기관 지침에 따라 적절한 처리가 필요합니다.
9. 좌심실에 바늘을 삽입 한 직후 날카로운 가위로 우심실을 자릅니다. 이 단계를 통해 혈액이 마우스에서 흘러나와 수집 접시로 배출됩니다.
10. 샘플을 50mL의 PBS 용액으로 7mL/분의 유속으로 관류합니다.
11. PBS 관류 후 마개를 전환하여 5mL/min의 동일한 유속으로 4% PFA 용액 20mL를 흘릴 수 있도록 합니다.
12. 순환 펌프가 켜져 있는 동안 좌심실에서 바늘을 제거합니다.
    참고: 이제 마우스가 조직 수집을 위해 고정되었습니다. 형광을 보존하려면 전체 프로토콜에서 가능한 한 빛 노출을 피해야 합니다. 조직이 처리되는 동안 조직 샘플이 있는 50mL 원뿔형 튜브를 알루미늄 호일로 덮을 수 있습니다.

4. PEGASOS 기법을 이용한 하악 조직 제거

참고: 조직 부피에 따라 15mL 또는 50mL 원뿔형 튜브를 사용하여 각 단계에서 처리할 수 있는 샘플을 준비할 수 있습니다. 샘플은 4.2 단계에서 4.7 단계까지 37 °C 쉐이커 (~ 100 rpm)에서 처리됩니다. 플라스틱이 녹지 않도록 유기 용제에 내성이 있는 폴리프로필렌 기반 플라스틱 용기를 사용하십시오. 또는 유리 제품을 사용할 수 있습니다.

주의: PEGASOS 조직 투명 기술은 Quadrol, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 벤질 벤조에이트(BB), MMA500 등과 같은 독성 용액을 사용합니다. 잠재적인 노출을 방지하려면 적절한 PPE가 필요합니다.

1. 하악골을 해부하고 샘플을 4% PFA로 추가로 고정합니다. 밤새 실온에 보관하십시오.
2. 하악골에서 근육을 제거하고 0.5M EDTA 용액(pH 8.0)에 담가 4일 동안 석회질을 제거합니다. 이 기간 동안 37°C 셰이커에서 매일 배지 변경을 수행합니다.
   알림: 샘플에서 근육을 가능한 한 많이 제거하는 것이 바람직합니다. 이 예방 조치는 이미징 과정을 단순화하고 근육의 자가 형광을 감소시킵니다.
3. 하악골을 37°C 쉐이커에서 하루 동안 25% Quadrol 용액(v/v in H₂O)으로 탈색하여 남은 혈액 헴을 제거합니다.
4. 전체 마운트 EdU 염색을 완료합니다.
   1. 표 1에 따라 신선한 EdU 라벨링 칵테일을 준비합니다.
      알림: EdU 라벨링 칵테일은 최적의 EdU 라벨링 결과를 얻기 위해 새로 준비된 아스코르브산염 용액을 추가하여 매번 신선하게 만들어야 합니다.
   2. 37°C 셰이커에서 30분 동안 PBST로 하악골을 헹굽니다.
   3. PBS로 하악골을 매번 3분 동안 세 번 헹굽니다.
   4. 하악골을 갓 만든 EdU 라벨링 칵테일에 넣고 37°C 셰이커에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   5. PBS로 하악골을 매번 3분 동안 세 번 헹굽니다.
5. 37 °C에서 6 시간 동안 다음 각 용액에서 연속 지질 제거를 수행합니다.
   30% tert-부탄올(tB) 용액: 75% v/v H 2O,₂₂% v/v tB 및 3% v/v Quadrol.
   50% tB 용액: 50% v/v H_2O, 47% v/v tB 및 3% v/v 쿼드롤.
   70% tB 용액: 30% v/v H_2O, 67% v/v tB 및 3% v/v Quadrol
   참고: 지질 제거 단계가 중요합니다. 탈지질화는 30% 및 50% tB 용액에서 4-6시간 사이, 70% tB 용액에서 1일 동안 수행할 수 있습니다.
6. 75% tB, 22% v/v 폴리에틸렌 글리콜 메틸-에테르 메타크릴레이트 평균 MMA500 및 37°C에서 3% v/v Quadrol로 매일 배지 교체로 2일 동안 tB-PEG 용액에서 하악골을 탈수합니다.
7. 굴절률 매칭을 얻기 위해 벤질 벤조에이트(BB)-PEG 투명 매체에서 하악을 투명하게 합니다: 투명도가 달성될 때까지 75% v/v BB, 22% v/v PEG-MMA500 및 3% Quadrol.
   참고: 굴절률 일치에 대한 정보가 있습니다. 물, 지질, 단백질, 미네랄, 세포 기관 등과 같은 조직의 무기 및 유기 성분. 1.33에서 1.55 사이의 다른 굴절률(RI)을 갖습니다. 조직 구성 요소 간의 이러한 RI 불일치는 이미징 프로세스를 방해합니다. 조직 내 RI 불일치를 제거함으로써 투명성을 얻을 수 있습니다. 조직 투명 샘플을 BB-PEG의 투명 매체에 담그는 것이 좋습니다. 이 단계는 전체 시편에 ~1.54(RI 매칭이라고 함)의 균일한 내부 RI를 제공하여 이미징 프로세스를 용이하게 합니다.
8. 보관 및 이미징을 위해 실온에서 BB-PEG 조직 투명 배지의 하악골을 보존합니다.
   알림: 형광 리포터의 점진적인 손실을 피하기 위해 가능한 한 빨리 이미징을 완료하는 것이 좋습니다. 그러나, 페가소스(PEGASOS) 방법은 몇 주간의 보관 후에도 형광 리포터를 잘 보존할 수 있다^20,21. 장기 보관을 위해 샘플을 4°C에서 보관할 수도 있습니다.

5. 조직 제거 하악의 공초점 영상

1. 하악 전체를 투명하게 청소한 조직을 BB-PEG 투명 매체의 브랜드 캐비티 슬라이드에 장착하고 유리 커버 슬라이드로 덮습니다. 거품을 피하십시오.
2. 적절한 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 이미지 획득을 수행합니다. Acquire 를 선택하고 이미지 획득 파라미터를 512 x 512 픽셀 해상도 및 400 Hz 획득 속도로 설정합니다. 이러한 설정은 현미경을 제어하는 소프트웨어의 획득 모드 메뉴에서 찾을 수 있습니다.
3. 형광 여기 패널에서 형광단을 최적으로 여기시키기 위해 필요한 레이저(TRITC)를 활성화합니다(LRC 시각화에 사용한 프로브는 548nm에서 여기 및 563nm에서 방출되는 Cy3와 같은 형광 특성을 가짐).
4. 형광 검출용 패널에서 슬라이더를 움직여 측정할 파장을 선택합니다(예: Cy3 유사 형광단의 경우 555 - 625 nm).
5. 장착된 하악을 현미경 스테이지에 배치하여 백색광과 저배율 대물렌즈(2-10x)를 사용하여 샘플을 시각화하고 찾습니다.
6. 커버슬립 위에 굴절률이 1.52인 이멀젼 오일 한 방울을 추가하여 유리 커버슬립과 대물렌즈의 굴절률과 일치시킵니다.
   참고: 대물렌즈, 이미징 매체 및 조직의 굴절률을 최대한 가깝게 일치시켜 이미지 획득 중 광학 왜곡의 도입을 최소화합니다.
7. 형광등을 켜고 적절한 배율 대물렌즈를 선택하여 관심 영역을 이미지화합니다. 우리는 1.95mm의 작동 거리와 0.9의 개구수를 가진 20x 대물 렌즈를 사용했습니다. 컨포칼 현미경으로 더 큰 조직 샘플을 이미징할 때 더 긴 작동 거리 렌즈가 필요할 수 있습니다. 또는 더 큰 조직 샘플에 대해 광시트 현미경을 사용하여 이미징을 쉽게 수행할 수 있습니다.
8. 컨포칼 이미징 소프트웨어에서 라이브 버튼을 눌러 라이브 스캔 모드를 시작합니다. 이미지의 다이내믹 레인지를 최대화하고 픽셀 채도를 피하려면 선택한 채널의 게인과 레이저 강도를 조정합니다.
9. 시야를 식별하여 하악의 전체 영역을 X 및 Y 차원으로 시각화합니다. 마우스 앞니에서 줄기 세포 틈새의 부피를 정확하게 커버하는 상위 및 하단 Z-단계 획득 매개변수를 설정합니다. 2μm의 Z 단계 크기를 사용하거나 요구 사항에 따라 사용하십시오. 최신 버전의 컨포칼 현미경은 다양한 중첩 영역의 z-스택을 자동으로 획득할 수 있어야 합니다.
10. Z-스택 이미지 파일을 .lif 형식으로 수집하고 저장합니다.
    참고 : .lif 파리는 .tiff 파일로 변환하여 다른 3D 분석 소프트웨어에 사용할 수 있습니다.

6. 표면 생성, 관심 영역(ROI) 분할, ROI 마스킹 및 스팟 생성을 통한 표지 유지 세포의 이미지 처리, 3D 이미지 재구성 및 정량화

참고: 이미지 처리 및 3D 재구성을 위해 Imaris(Bitplane 9.0.1)를 사용했지만 다른 소프트웨어 제품군(예: ImageJ/Fiji, 3D 슬라이서, Avizo, Arivis, Amira 등)을 사용하여 유사한 이미지 처리 단계를 수행할 수 있습니다.

1. 이미징 소프트웨어에서 Arena 버튼을 클릭한 다음 Image를 선택합니다. 원본 . lif 파일을 선택하고 병합된 파일을 선택하면 이미지를 이미징 소프트웨어로 가져옵니다.
   참고: 또는 이미징 소프트웨어 파일 변환기를 사용하여 Z 스택 이미지 파일을 소프트웨어의 기본 형식 파일 형식으로 변환합니다. 예를 들어, Imaris 파일 변환기를 사용하여 .lif 파일을 .ims 파일로 변환하고 이미징 소프트웨어에서 .ims 파일을 엽니다. 데이터를 소프트웨어의 기본 파일 형식으로 변환하면 파일을 빠르게 변환하고 오류를 최소화할 수 있습니다.
2. 가져온 파일을 두 번 클릭하여 이미지 데이터 세트를 엽니다.
3. 디스플레이 조정 패널을 방문하여 채널 이름을 클릭합니다. 일반적으로 기본 모드에서는 빨간색으로 표시됩니다.
   1. Image Properties(이미지 속성) 창에서 Mapped Color(매핑된 색상) 탭을 클릭합니다. Color Table File(색상 테이블 파일) 옵션에서 Fire Flow(Fire Flow)를 선택한 다음 OK(확인)를 클릭합니다. 디스플레이 색상은 일반적으로 배경 형광과 양성 형광을 샘플과 구별하기 위해 선택됩니다.
4. 화면 왼쪽 상단의 장면 – 속성 창에서 새 표면 추가라는 파란색 아이콘을 클릭합니다. 볼륨 아이콘을 선택 취소하면 대부분의 배경 형광이 제거되고 양성 형광이 뚜렷하게 보입니다(6.4.2단계 참조).
   1. Create(만들기) 탭을 클릭하고 Skip Automatic Creation(자동 생성 건너뛰기), Edit Manually(수동 편집) 탭을 선택하여 관심 영역(ROI)을 수동으로 세분화하는 프로세스를 시작합니다. 수동 서피스 작성 마법사에서 컨투어(Contour) 탭을 클릭하고 샘플을 기반으로 방향(XY, YZ 또는 XZ)을 선택하여 ROI를 쉽게 컨투어링할 수 있습니다. 여기서는 XY 방향을 선택합니다.
   2. 그런 다음 오른쪽 모서리에 있는 포인터 메뉴가 선택 모드인지 확인합니다. 슬라이스 위치를 조정하여 조직에서 ROI를 찾습니다. 대부분의 배경 형광이 6.4단계에서 언급한 대로 뚜렷한 양성 형광으로 제거되었음을 알 수 있습니다. 그리기 버튼을 클릭하고 잠정 관심 영역을 그립니다. ROI 이외의 다른 영역에서 간섭을 피하기 위해 가시성 옵션을 없음 으로 선택합니다.
   3. 6.4.2단계를 반복합니다. 슬라이스 단위로 슬라이스하여 전체 관심 영역을 그립니다.
   4. ROI 도면이 완료되면 표면 생성을 클릭하여 ROI의 3D 지오메트리를 가져옵니다.
   5. 수동 서피스 작성 마법사에서 편집(Edit ) 버튼을 클릭하고 마스크 전체(Mask All)를 선택합니다.
   6. 튀어나온 마스크 채널 창의 채널 선택 옵션에서 채널 1 을 선택합니다. 그런 다음 마스크를 적용하기 전에 채널 복제를 선택합니다. 마스크 설정에서 Constant Inside/Outside 를 선택하고 복셀 외부 표면을 0으로 설정합니다.
   7. 장면 속성(Scene-Properties) 창에서 서피스 오브젝트(Surface Object)를 선택 취소하고 볼륨 오브젝트(Volume Object)를 선택합니다. 디스플레이 조정에서 원래 "빨간색" 채널을 선택 해제하고 마스크된 빨간색 채널을 선택하고 색상 강도를 조정하여 원하는 3D 렌더링 및 긍정적으로 레이블링된 형광 ROI를 얻습니다.
5. 새 별색 개체를 만듭니다. 먼저 스팟에 추가 아이콘을 클릭하여 3D 렌더링 LRC와 비교적 겹치는 3D 스팟을 만들어 3D 렌더링 LRC를 정량화합니다. 아래쪽 화살표를 사용하여 스팟 생성 마법사의 단계 사이를 이동합니다. 
   1. 스팟 생성 마법사에는 소프트웨어를 사용하여 자동으로 스팟을 생성하는 4개의 순차적인 지침 단계가 있습니다. 첫 번째 단계에서 Segment Only a Region of Interest(관심 영역만 세그먼트) 옵션이 선택되어 있는지 확인합니다. 다음 아이콘을 클릭합니다.
   2. 두 번째 단계에는 "XYZ 3D 상자"가 있습니다. ROI를 포함하도록 XYZ 상자를 조정합니다. 다음 아이콘을 클릭합니다.
   3. 세 번째 단계에서 소스 채널 옵션으로 이동합니다. 가면을 쓴 빨간색 채널을 선택하십시오. 맞는 추정 XY 스폿 직경을 입력하고 샘플 형광 점을 겹칩니다. 다음 아이콘을 클릭합니다.
   4. 네 번째 단계에서는 "품질" 필터 유형을 추가하고 식별 가능한 LRC의 대부분이 레이블이 지정될 때까지 '품질' 히스토그램을 가로질러 슬라이딩 윈도우를 이동하여 낮은 강도 임계값을 조정합니다.
      참고: 세분화 및 그에 따른 통계적 판독값(예:ample: 셀 수)은 강도 임계값에 따라 크게 달라집니다. 적절한 임계값을 정확하게 설정해야 합니다.
   5. Finish(마침) 버튼을 클릭하고 Statistic(통계) 버튼을 선택합니다. 전체 탭을 선택하여 이미지의 총 스팟 수에 대한 값을 찾습니다.
   6. Tab Display to File 버튼을 클릭하여 통계를 내보내고 결과를 .xls 파일로 받습니다.
   7. 정량화 결과를 제시하기 위해 적절한 다이어그램을 사용하십시오.

결과

EdU 라벨링 및 PEGASOS 조직 투명화 과정(그림 2) 후, 이미지와 같이 투명한 하악골을 얻었습니다(그림 3B). 우리는 변형된 샘플을 조직 투명화 과정 없이 정상 하악과 비교했습니다(그림 3A). EdU 표지가 있는 투명한 하악골(그림 3B)을 공초점 이미징을 실시했습니다. 우리는 (보충 그림 1)에서 볼 수 있?...

토론

증식하는 세포를 가능한 한 많이 표지하기 위해 성장하는 신생아 마우스에 다회 투여(BrdU, EdU)를 다회 투여한다 ^1,6,13. 추격 기간은 조직의 재생율 ^6,13에 관한 중요한 단계로 간주된다. 마우스 앞니는 매달 스스로 갱신됩니다. 이 특성을 통해 연구자는 추적 기간을 4주 이상으로 설정?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Sigma Aldrcih	E9884
20 × Objective/NA 0.9	Leica	507702
50 mL Falcon Centrifuge Tubes	Falcon	352070
BD PrecisionGlide Needle	BD	REF 305111
Bezyl benzoate (BB)	Sigma Aldrcih	409529
Bitplane 9.0.1	Imaris
BRAND cavity slides	Millipore Sigma	BR475505
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Strain #:000664
Circulation Pump	VWR	23609-170
CuSO4	Sigma Aldrcih	451657
DMSO	Sigma Aldrcih	D8418
EdU	Carboynth	NE08701
Heparin	Miiilipore Sigma	H3149
Imaging System	Olympus	DP27
LAS X Software	Leica
Olympus Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Paraformaldehye	Sigma Aldrich	P6148
PBS	Sigma Aldrich	P4417
PEGMMA500	Sigma Aldrich	447943
Quadrol	Sigma Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma Aldrich	11140
Sulfa-Cyanine 3 Azide	Lumiprobe	D1330
TBS-10X	Cell Signaling Technology	12498
TCS SP8 Confocal Microscope	Leica
tert-butanol (tB)	Sigma Aldrich	360538
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100