זיהוי וכימות של תאים שומרי תוויות בחותכות עכבר באמצעות גישת שחזור תלת-ממדית לאחר ניקוי רקמות

Summary

החותכת לעכבר מכילה תאים שומרי תוויות יקרי ערך בנישת תאי הגזע שלה. יש לנו דרך חדשה לזהות ולכמת באופן בלתי משוחד את התאים שומרי התווית; המחקר שלנו השתמש בתיוג EdU ובגישת שחזור תלת ממדית לאחר ניקוי רקמות פגסוס של הלסת התחתונה.

Abstract

החותכת היא איבר הגדל ברציפות לאורך כל חיי העכבר. תאי הגזע האפיתל והמזנכימליים השוכנים ברקמות הפרוקסימליות של החותכות מולידים צאצאים שיתמינו לאמלובלסטים, אודונטובלסטים ופיברובלסטים של מוך השן. תאים אלה חיוניים לתמיכה בתחלופה מתמשכת של רקמות חותכות, מה שהופך את החותכת murine מודל מצוין לחקר הומאוסטזיס של תאי גזע בוגרים. מאמינים כי תאי גזע מכילים תאים שקטים מאריכי חיים שניתן לתייג על ידי אנלוגים של נוקלאוטידים כגון 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU). התאים שומרים על תווית זו לאורך זמן ובהתאם לכך נקראים תאים שומרי תוויות (LRCs). גישות להדמיה של LRCs in vivo מספקות כלי חזק לניטור הומאוסטזיס של תאי גזע. במחקר זה תיארנו שיטה להדמיה וניתוח של LRCs. הגישה החדשנית שלנו כוללת LRCs בחותכות עכבר לאחר ניקוי רקמות וצביעת EdU בהרכבה מלאה ולאחר מכן מיקרוסקופ קונפוקלי ושחזור תלת ממדי (3D) עם תוכנת ההדמיה. שיטה זו מאפשרת רכישת הדמיה תלת-ממדית וכימות לא מוטה בהשוואה לניתוח LRCs מסורתי על שקופיות חתוכות.

Introduction

החותכת לעכבר הגדלה ללא הרף היא מודל מצוין לחקר תאי גזע בוגרים¹. תאי הגזע האפיתל (לולאה צווארית שפתית ולשונית) ותאי גזע מזנכימליים (בין הלולאה הצווארית השפתית והלשונית) השוכנים בצד הפרוקסימלי של החותכת מתמיינים לאמלובלסטים, אודונטובלסטים ותאי מוך השן. תהליך ייחודי זה מספק מקור תאים לפיצוי אובדן רקמות ותחלופת רקמה². למרות מספר סמנים של תאי גזע כגון Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 וכו '. זוהו in vivo עבור תת-קבוצות של תאי גזע בוגרים בחותכות עכבר, הם אינם מספיקים בייצוג אוכלוסיות תאי הגזע כאשר משתמשים בהם לבד 1,3,4,5. הדמיה של תאים שקטים מאריכי חיים על ידי תיוג ושימור דנ"א אנלוגי של נוקלאוטידים יכולה לספק זיהוי בלתי משוחד עבור רוב תת-הקבוצות של תאי גזע בוגרים⁶. יתר על כן, גישה זו שימושית בקרב שיטות זיהוי תאי גזע רבות⁷ להבנת התנהגות התאים והומאוסטזיס של אוכלוסיות תאי גזע דנטליים ^3,8. בעוד שתאי הגזע המתחלקים יאבדו את תיוג הדנ"א שלהם לאחר מרדף ניכר, תאי הגזע השקטים לכאורה שומרים על תווית הדנ"א שלהם, ורואים בהם תאים שומרי תוויות (LRCs)⁶. תיוג ושימור DNA על ידי תאי גזע שאינם מתחלקים יסמנו וימקמו את תאי הגזע הבוגרים לכאורה בנישות שלהם.

במהלך השנים האחרונות, תיוג אנלוגי של תימידין 5-ברומו-2′-דאוקסיורידין (BrdU) החליף את שיטת התיוג 3H-thymidine DNA המסורבלת, הגוזלת זמן רב וברזולוציה גבוהה שאינה תואמת 3H-thymidine DNA לבדיקות התפשטות תאים ^6,9. בשנים האחרונות, טכניקת התיוג 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) נמצאת בשימוש הולך וגובר על BrdU. דפוס זה נוצר מכמה סיבות. ראשית, שיטת BrdU היא איטית ועתירת עבודה. תנאי המשתמש משתנים, והוא אינו מסוגל לשמר את מבנה העל בדגימות (עקב דנטורציה של DNA). כמו כן, שיטת BrdU מאבדת את האנטיגניות של תאים, ובכך הופכת אותה ללא יעילה עבור ניתוחים פונקציונליים במורד הזרם ובדיקות כגון ניסויי לוקליזציה משותפת והשתלת תאי גזע in vivo 3,7,9,10,11,12. BrdU הוא גם טרטוגן, שאינו מתאים לתיוג LRCs בהתפתחות עוברית⁶. כמו כן, שיטת BrdU אינה יעילה כאשר משתמשים בה בדגימות שלמות. החסרונות הם חדירה נמוכה של נוגדנים בחלק העמוק של הדגימות או דרישה לתקופת דגירה ארוכה של נוגדנים לחדירה עמוקה¹³. תיוג EdU חומק מהשלבים של דגימות דנטורציה, ובכך משמר את מבנה העל. תכונה זו מועילה לניתוחים פונקציונליים במורד הזרם, כגון ניסויי לוקליזציה משותפת והשתלת תאי גזע^11,12. כמו כן, תיוג EdU רגיש ומהיר מאוד; חדירת הדגימות גבוהה הודות לשימוש באזידים פלואורסצנטיים נספגים במהירות ובגודל קטן יותר לזיהוי תוויות EdU באמצעות תגובת ציקלואיד (כימיית "קליק" Cu(I)-זרז [3 + 2]¹⁴.

שיטה נוספת לסימון דנ"א המיושמת יותר ויותר היא השימוש בעכברים טרנסגניים מהונדסים. עכברים אלה מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק היסטון 2B (H2B-GFP) הנשלט על ידי אלמנט מווסת מגיב טטרציקלין ^5,14. לאחר האכלת עכברים בטטרציקלין צ'או/מים למשך תקופת מרדף של 4 שבועות עד 4 חודשים, פלואורסצנטיות GFP תפחת בתאי מחזור ורק LRCs ישמרו על פלואורסצנטיות⁶. היתרון של שיטה זו הוא שניתן לבודד את ה- LRCs המסומנים ולהישאר בני קיימא עבור תרבית תאים או ניתוחים פונקציונליים במורד הזרם ^6,7. כמה מחקרים דיווחו על תיוג לא מדויק של תאי גזע שקטים כאשר רדפו אחריהם לשימוש ארוך טווח. תוצאה זו נבעה מביטוי רקע דולף מזן H2B-GFP ולא מהתגובה המווסתת הטטרציקלין^{המתאימה 15}.

יתר על כן, רוב הספרות בעבר השתמשה בזיהוי LRCs בעיקר על שקופיות חתוכות, שהן דו-ממדיות ולעתים קרובות מוטות בטעות בהצגת המיקום והמספר המדויקים של LRCs. הגישה הציגה זוויות שגויות למקטעים של מבני רקמות מורכבים¹⁶. השיטה השנייה הייתה להשיג תמונות תלת ממדיות מקטעים טוריים ולבצע שחזורים לאחר התמונה. שלבים אלה לא היו מדויקים בגלל עיוות תמונה מווריאציות בכל קטע טורי עקב קטעים דחוסים או מתוחים, וכתוצאה מכך חסר מידע^16,17,18. השיטה הייתה גם מייגעת וגוזלת זמן.

כדי להקל על הדמיה מלאה של LRCs, הדגימות צריכות להיות ברורות בזמן שהפלואורסצנטיות מתוחזקת היטב. ניתן לסווג את טכניקות ניקוי הרקמה הנוכחיות לשלוש קטגוריות עיקריות: טכניקות ניקוי רקמות מבוססות ממס אורגני, טכניקות ניקוי רקמות מבוססות מגיב מימי, וטכניקות ניקוי רקמות מבוססות הידרוג'ל^17,19. מערכת הממסים הקשורה לפוליאתילן גליקול (PEG) (פגסוס) פותחה לאחרונה. גישה זו הופכת כמעט את כל סוגי הרקמות לשקופים ומשמרת פלואורסצנטיות אנדוגנית, כולל רקמות קשות כגון עצם ושיניים²⁰. לשיטת פגסוס יתרונות על פני שיטות ניקוי רקמות אחרות, בעיקר בניקוי חומרי שן ועצם. רוב השיטות האחרות יכולות לנקות רקמות קשות רק באופן חלקי, בעלות זמני עיבוד ארוכים, או דורשות ריאגנטים יקרים²¹. כמו כן, שיטת פגסוס יכולה לשמר ביעילות פלואורסצנטיות אנדוגנית על פני שיטות אחרות.

ספרות זו הובילה אותנו ליצור שיטה חדשה לחקר התא. שילבנו את יתרונות זיהוי ה-LRCs של תיוג EdU עם ההדמיה התלת-ממדית המעולה ביותר של דגימות שעברו ניקוי רקמות; הדגימות עובדו בטכניקת ניקוי רקמות מתקדמת של מערכת ממס משויכת פוליאתילן גליקול (PEG) (PEGASOS)¹⁵. שקיפות רקמות קשות אפשרה לנו לשחזר את האות התלת-ממדי של פלואורסצנטיות LRCs in vivo מבלי לשבור את השיניים או הלסתות, וליצור דרך מדויקת יותר לדמיין ולכמת LRCs.

במחקר זה, אנו מספקים מדריך חדשני להמחשת LRCs בחותך העכבר. יצרנו גישה חזותית תלת-ממדית כדי לקבוע את המיקום והכמות של LRCs בתוך נישת תאי הגזע החותכים לעכבר. פרויקט זה השתמש בתיוג EdU, טכניקות ניקוי רקמות פגסוס ומיקרוסקופ קונפוקלי. השיטה שלנו של תיוג EdU של LRCs על רקמה שלמה ושימוש בדגימה מנוקה ושקופה מתגברת הן על המגבלות של שקופיות חתוכות מסורתיות והן על שיטות תיוג DNA חסרות אחרות. לכן, הטכניקה שלנו תתאים למחקרים על הומאוסטזיס של תאי גזע הדורשים זיהוי LRCs, במיוחד על רקמות קשות. הפרוטוקול יכול להיות מועיל באותה מידה לאלה המתמקדים בהומאוסטזיס של תאי גזע ברקמות ואיברים אחרים.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) עבור המכללה לרפואת שיניים של אוניברסיטת טקסס A&M.

1. הכנת קוקטייל התיוג EdU

1. הכינו את תמיסות ציר הקוקטיילים כמתואר בטבלה 1.
2. הכינו את קוקטייל הסימון של EdU כמתואר בטבלה 1.

2. הכנת העכברים ותמיסת EdU

1. הכן את פתרון EdU. יש להמיס EdU ב-DMSO במינון של 20 מ"ג/מ"ל ולאחסן במקפיא בטמפרטורה של -20°C.
   זהירות: EdU הוא מוטגן. על המשתמשים ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים בעת הטיפול בחומר זה.
2. הזריקו לעכברי C57BL/6J בני 5 ימים את תמיסת ה-EdU המוכנה תוך צפקית במשקל גוף של 3 מיקרוליטר/גרם. עכברים חייבים לקבל את התמיסה פעם ביום במשך 7 ימים רצופים. לאחר מכן, הם עוברים תקופת מרדף במשך 6 שבועות לפני שהם נקצרים לניתוח (איור 1).
   זהירות: היזהר להימנע מדקירות מחט בעת הזרקת EdU לעכברים. לאחר הזרקת EdU במשך 7 ימים רצופים, הכניסו את העכברים לכלוב חדש. לאחר שהעכברים נמצאים בביתם החדש, השליכו את המצעים בכלוב הישן תוך שימוש בכללי סיכון ביולוגי מתאימים.

3. הכנת דגימה על ידי זילוח לב טרנס (עכברות בנות 53 יום לאחר הלידה לאחר תקופת המרדף של 6 שבועות)

הערה: כבד העכבר אמור להחוויר לאחר זילוח טראנס-לבבי מוצלח.

1. מרדימים עכברים עם זריקה intraperitoneal. הם צריכים לקבל שילוב של xylazine ו ketamine הרדמה (Xylazine 10-12.5 מ"ג / ק"ג; קטמין, 80-100 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
2. המתן ~ 10 דקות עד שהעכבר לא יגיב עוד לגירויים כואבים (כגון רפלקסים של צביטת כפות).
3. הניחו את העכברים במצב שכיבה מיוצב על תמיכת קלקר עם מחטים בכל כפה.
4. חשוף את חלל החזה על ידי פתיחת העור שמעליו באמצעות פינצטה וניתוח מספריים.
5. חותכים את הסרעפת בעזרת מספריים חדים. היזהר לא לחדור את הלב.
6. חותכים דרך כלוב הצלעות, תופסים את בסיס עצם החזה עם מספריים מהדק כדי לחשוף את הלב.
7. מעבירים את העכבר לשלב הזילוח ליד משאבת הסירקולציה במכסה אדים.
8. הכנס את המחט 25 G (מהצינורית המלאה במי מלח חוצצי פוספט (PBS)/4% תמיסת פרפורמלדהיד (PFA) לקודקוד החדר השמאלי. הקפד לשמור על קצה המחט בלומן של החדר.
   אזהרה: PFA הוא רעיל במידה בינונית ומסרטן סביר. השתמש ב- PPE לטיפול ב- PFA והכן את התמיסה תחת מכסה אדים כימי. פסולת PFA דורשת סילוק נאות בהתאם להנחיות המוסד.
9. חותכים את החדר הימני באמצעות מספריים חדים מיד לאחר החדרת המחט לחדר השמאלי. שלב זה מאפשר לדם לזרום החוצה מהעכבר ולהתנקז לצלחת האיסוף.
10. לנקב את הדגימות עם 50 מ"ל של תמיסת PBS בקצב זרימה של 7 מ"ל/דקה.
11. לאחר זילוח PBS, החליפו את הסטופקוק כדי לאפשר זרימה של 20 מ"ל של 4% תמיסת PFA באותו קצב זרימה של 5 מ"ל/דקה.
12. בזמן שמשאבת זרימת הדם עדיין פועלת, הסר את המחט מהחדר השמאלי.
    הערה: העכבר קבוע כעת לאיסוף רקמות. כדי לשמר את הפלואורסצנטיות, יש להימנע ככל האפשר מחשיפה לאור לאורך כל הפרוטוקול. בזמן עיבוד הרקמה, הצינור החרוטי 50 מ"ל עם דגימות הרקמה עשוי להיות מכוסה ברדיד אלומיניום.

4. ניקוי רקמות של הלסת התחתונה בטכניקת פגסוס

הערה: ניתן להשתמש בצינור חרוטי של 15 מ"ל או 50 מ"ל בהתאם לנפח הרקמות כדי לשמור על הדגימות מוכנות לטיפול בכל שלב. הדגימות מעובדות בשייקר של 37°C (~100 סל"ד) משלבים 4.2 עד 4.7. השתמש במיכלי פלסטיק מבוססי פוליפרופילן העמידים בפני ממיסים אורגניים כדי למנוע המסת הפלסטיק. לחלופין, ניתן להשתמש בכלי זכוכית.

זהירות: טכניקת ניקוי הרקמה של פגסוס משתמשת בתמיסות רעילות כגון Quadrol, פוליאתילן גליקול (PEG), בנזיל בנזואט (BB), MMA500 וכו'. נדרש ציוד הגנה אישי מתאים כדי למנוע חשיפות פוטנציאליות.

1. לנתח לסת תחתונה ולתקן דגימות נוספות ב 4% PFA. שמרו אותם בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
2. הסר את השרירים מן הלסת ולטבול אותם בתמיסת 0.5 M EDTA (pH 8.0) כדי decalcize במשך 4 ימים. במהלך תקופה זו, יש לבצע שינוי בינוני יומי בשייקר בטמפרטורה של 37°C.
   הערה: רצוי להסיר את השרירים מהדגימה ככל האפשר. אמצעי זהירות זה יפשט את תהליך ההדמיה ויפחית את האוטופלואורסצנטיות מהשרירים.
3. יש לצבוע את הלסת התחתונה עם תמיסת Quadrol 25% (v/v ב-H₂O) על שייקר של 37°C למשך יום אחד כדי להסיר את הדם שנותר.
4. צביעת EdU שלמה של הרכבה שלמה.
   1. הכינו קוקטייל תיוג EdU טרי לפי טבלה 1.
      הערה: קוקטייל הסימון של EdU צריך להיות טרי בכל פעם עם פתרון אסקורבט טרי שנוסף להשגת תוצאות תיוג EdU אופטימליות.
   2. שטפו את הלסת התחתונה עם PBST במשך 30 דקות על שייקר של 37°C.
   3. שטפו את הלסת התחתונה עם PBS שלוש פעמים במשך 3 דקות בכל פעם.
   4. יש לדגור על הלסתות בקוקטייל תיוג EdU טרי על שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   5. שטפו את הלסת התחתונה עם PBS שלוש פעמים במשך 3 דקות בכל פעם.
5. בצע דה-ליפידציה טורית בכל אחת מהפתרונות הבאים במשך 6 שעות על 37°C:
   30% תמיסת טרט-בוטנול (tB): 75% v/v H₂O, 22% v/v tB ו-3% v/v Quadrol.
   פתרון 50% tB: 50% v/v H₂O, 47% v/v tB ו- 3% v/v Quadrol.
   פתרון 70% tB: 30% v/v H₂O, 67% v/v tB ו- 3% v/v Quadrol
   הערה: שלב הסרת השומנים הוא קריטי. דה-ליפידיזציה יכולה להיעשות בין 4-6 שעות בתמיסת 30% עד 50% tB ולמשך יום אחד בתמיסת 70% tB.
6. יש לייבש את הלסת התחתונה בתמיסת tB-PEG למשך יומיים עם השינוי היומי היומי הבא: 75% tB, 22% v/v פוליאתילן גליקול מתיל-אתר מתקרילט ממוצע MMA500, ו-3% v/v Quadrol ב-37°C.
7. נקה את הלסת התחתונה בתווך ניקוי בנזיל בנזואט (BB)-PEG כדי לקבל התאמת אינדקס שבירה: 75% v/v BB, 22% v/v PEG-MMA500 ו-3% Quadrol עד להשגת שקיפות.
   הערה: יש לנו מידע על התאמת אינדקס שבירה. המרכיבים האנאורגניים והאורגניים ברקמות כגון מים, שומנים, חלבונים, מינרלים, אברונים וכו '. בעלי מקדם שבירה שונה (RI) בטווח של 1.33 עד 1.55. חוסר התאמה זה של RI בין מרכיבי הרקמה מעכב את תהליך ההדמיה. שקיפות יכולה להיות מושגת על ידי ביטול חוסר התאמה RI בתוך הרקמה. מומלץ לטבול את הדגימות שעברו ניקוי רקמות במדיום הניקוי של BB-PEG. שלב זה ייתן RI פנימי אחיד של ~1.54 (נקרא התאמת RI) לכל הדגימה, ויקל על תהליך ההדמיה.
8. שמרו על הלסת התחתונה בתווך ניקוי רקמות BB-PEG בטמפרטורת החדר לצורך אחסון והדמיה.
   הערה: כדאי להשלים את ההדמיה בהקדם האפשרי כדי למנוע אובדן הדרגתי של כתבי פלורסנט. עם זאת, שיטת פגסוס תשמור על כתבי פלואורסצנטיות שמורים היטב גם לאחר מספר שבועות של אחסון^20,21. לאחסון לטווח ארוך, ניתן לאחסן את הדגימות גם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

5. הדמיה קונפוקלית של הלסת התחתונה המפונה מרקמה

1. הרכיבו את הרקמה שפינה את כל הלסת התחתונה על מגלשות חלל המותג במדיום ניקוי BB-PEG וכסו בשקופיות כיסוי זכוכית. הימנעו מבועות.
2. בצע רכישת תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי מתאים לסריקת לייזר. בחר רכוש והגדר את פרמטרי רכישת התמונה ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים ומהירות רכישה של 400 הרץ. הגדרות אלה נמצאות בתפריט מצב הרכישה של התוכנה השולטת במיקרוסקופ.
3. בלוח לעירור פלואורסצנטי, הפעל את הלייזר הנדרש (TRITC) כדי לעורר פלואורופורים בצורה אופטימלית (לבדיקה שהשתמשנו בה להדמיית LRCs יש תכונות פלואורסצנטיות כגון Cy3 עם עירור ב 548 ננומטר ופליטה ב 563 ננומטר של אורך גל לייזר).
4. בחלונית לזיהוי פלואורסצנטי, הזז את המחוון כדי לבחור את אורכי הגל שיימדדו (לדוגמה, בין 555 ל- 625 ננומטר עבור פלואורופור דמוי Cy3).
5. הניחו את הלסת התחתונה המותקנת על במת המיקרוסקופ כדי לדמיין ולמצוא את הדגימה באמצעות אור לבן ויעד הגדלה נמוך יותר (2-10x).
6. הוסיפו טיפת שמן טבילה עם מקדם שבירה של 1.52 על גבי הכיסוי, כדי להתאים למקדם השבירה של כיסוי הזכוכית ולמטרה.
   הערה: התאם את אינדקס השבירה של מטרות, מדיית הדמיה ורקמות קרוב ככל האפשר כדי למזער את הופעת העיוותים האופטיים במהלך רכישת תמונה.
7. הפעל את מנורות הפלואורסצנט ובחר מטרת הגדלה מתאימה לתמונת אזורי עניין. השתמשנו בעדשה אובייקטיבית 20x עם צמצם מספרי של 0.9 עם מרחק עבודה של 1.95 מ"מ. עדשה למרחק עבודה ארוך יותר עשויה להידרש בעת הדמיה של דגימות רקמה גדולות יותר במיקרוסקופ קונפוקלי. לחלופין, הדמיה יכולה להיעשות בקלות באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור עבור דגימות רקמה גדולות יותר.
8. בתוכנת ההדמיה הקונפוקלית, לחץ על הלחצן Live כדי להפעיל מצב סריקה חיה. להגדלת הטווח הדינמי של התמונות ולמניעת רוויית פיקסלים, התאימו את עוצמת הרווח והלייזר לערוץ שנבחר.
9. זהה את שדה הראייה כדי להמחיש את כל האזור של הלסת התחתונה במידות X ו- Y. הגדר את פרמטרי הרכישה של שלב Z העליון והתחתון המכסים במדויק את נפח גומחת תאי הגזע בחותך העכברים. השתמש בגודל Z-step של 2 מיקרומטר או בהתאם לדרישות שלך. הגרסאות החדשות יותר של מיקרוסקופים קונפוקליים אמורות להיות מסוגלות לרכוש באופן אוטומטי ערימות z של האזורים החופפים השונים.
10. רכוש ושמור קובצי תמונה מסוג Z-stack בתבנית .lif.
    הערה: ניתן להמיר את זבובי ה- .lif לקבצי .tiff ולהשתמש בהם עבור תוכנות ניתוח תלת-ממד אחרות.

6. עיבוד תמונה, שחזור תמונה תלת מימדית וכימות תאים שומרי תוויות על ידי יצירת משטח, פילוח אזור העניין (ROI), מיסוך החזר ההשקעה ויצירת כתמים

הערה: השתמשנו ב- Imaris (Bitplane 9.0.1) לעיבוד תמונה ושחזור תלת מימד, אך ניתן לבצע שלבי עיבוד תמונה דומים באמצעות חבילות תוכנה אחרות (לדוגמה, ImageJ / פיג'י, 3D slicer, Avizo, Arivis, Amira וכו ').

1. בתוכנת ההדמיה, לחץ/י על הכפתור ״ארנה ״ ולאחר מכן בחר /י ״תמונה״. בחר את קובץ ה- .lif המקורי ובחר קובץ ממוזג, התמונות ייובאו לתוכנת ההדמיה.
   הערה: לחלופין, השתמש בממיר קבצים של תוכנת הדמיה כדי להמיר קובץ תמונה מסוג Z stack לסוג הקובץ המקורי של התוכנה. לדוגמה: המר את קבצי ה- .lif לקבצי .ims באמצעות Imaris File Converter ופתח את קבצי ה- .ims בתוכנת ההדמיה. המרת נתונים לפורמט הקובץ המקורי של התוכנה תאפשר המרת קבצים מהירה ותמזער שגיאות.
2. לחץ פעמיים על הקובץ המיובא כדי לפתוח את ערכת נתוני התמונה.
3. בקר בחלונית Display Adjustment , לחץ על שם הערוץ. הוא מסומן בדרך כלל כאדום במצב ברירת מחדל.
   1. בחלון מאפייני תמונה , לחץ על הכרטיסייה צבע ממופה . באפשרות Color Table File , בחרו Fire Flow ולחצו על OK. צבע התצוגה נבחר בדרך כלל כדי להבחין בין פלואורסצנטיות הרקע לבין הפלואורסצנטיות החיובית מהדגימה.
4. בצד השמאלי העליון של המסך בחלונית סצנה – מאפיינים , לחץ על הסמל הכחול שכותרתו הוסף משטח חדש. בטל את הבחירה בסמל עוצמת הקול אשר יסיר את רוב פלואורסצנטיות הרקע והפלואורסצנטיות החיובית גלויה בבירור (ראה שלב 6.4.2).
   1. התחל את התהליך של פילוח ידני של אזור עניין (ROI) על ידי לחיצה על הכרטיסייה צור ובחירה בכרטיסייה דלג על יצירה אוטומטית, ערוך ידנית . באשף יצירת המשטחים הידני, לחץ על הכרטיסייה מתאר כדי לבחור את הכיוון (XY, או YZ, או XZ) בהתבסס על הדגימות כדי לעצב בקלות את קווי המתאר של החזר ההשקעה. כאן, אנו בוחרים כיוון XY.
   2. לאחר מכן, ודא שתפריט המצביע בפינה השמאלית נמצא במצב בחירה . התאם את מיקום הפרוסה כדי לאתר את החזר ההשקעה ברקמה. תבחין שרוב פלואורסצנטיות הרקע הוסרה עם פלואורסצנטיות חיובית מובהקת כפי שהוזכר בשלב 6.4. לחץ על כפתור ציור וצייר אזור עניין לא סופי. בחר באפשרות ניראות ללא כדי למנוע הפרעות מאזורים אחרים מלבד החזר ההשקעה.
   3. חזור על שלב 6.4.2. פרוסה אחר פרוסה כדי לצייר את כל אזור העניין.
   4. לאחר סיום ציור החזר ההשקעה, לחץ על צור משטח כדי לקבל גיאומטריה תלת-ממדית של החזר ההשקעה.
   5. לחץ על לערוך כפתור באשף יצירת פני השטח הידני ובחר מסיכה הכל.
   6. בחלון 'ערוץ מסיכה ' שהוקפץ, בחרו 'ערוץ 1 ' באפשרויות בחירת הערוץ. לאחר מכן, בחרו 'שכפל ערוץ' לפני החלת המסיכה. בקביעות המסיכה, בחרו 'קבוע בפנים/בחוץ ' וקבעו את משטח הווקסל החיצוני על 0.
   7. בחלונית Scene-Properties , בטל את הבחירה בעצם Surface ובחר בעצם עוצמת הקול. בכוונון הצג, בטלו את הבחירה בערוץ "אדום" המקורי ובחרו בערוץ 'אדום מסיכה ' וכווננו את עוצמות הצבע כדי לקבל את החזר ההשקעה הרצוי על הפלואורסצנטיות בעיבוד תלת-ממדי ובתווית חיובית.
5. צרו עצם ספוט חדש. התחל על ידי לחיצה על הוסף על ספוט סמל כדי לכמת את LRCs המעובדים בתלת-ממד על ידי יצירת כתמים תלת-ממדיים החופפים באופן דומה ל- LRCs שעובדו בתלת-ממד. השתמש בחצים התחתונים כדי לעבור בין שלבים באשף יצירת הספוט.
   1. באשף יצירת הספוטים, יהיו ארבעה שלבים עוקבים של הוראות ליצירת כתמים באופן אוטומטי באמצעות התוכנה. ודא שהאפשרות מקטע רק אזור עניין נבחרה בשלב הראשון. לחץ על הסמל הבא .
   2. בשלב השני, תהיה "תיבת XYZ 3D". התאם את התיבה XYZ כך שתכסה את החזר ההשקעה. לחץ על הסמל הבא .
   3. בשלב השלישי, עבור אל אפשרויות ערוץ המקור . בחר את הערוץ האדום רעול הפנים; הזן את קוטר הספוט המשוער XY הדומה כדי להתאים ולחפוף את נקודות הפלואורסצנטיות של הדגימה. לחץ על הסמל הבא .
   4. בשלב הרביעי, הוסף את סוג מסנן "איכות" וכוונן את סף העוצמה הנמוך יותר על ידי הזזת חלון ההזזה על פני היסטוגרמה 'איכות' עד שרוב ה- LRCs הניתנים לזיהוי מסומנים.
      הערה: הפילוח ולכן הקריאות הסטטיסטיות (לדוגמה: מספר התאים) תלויים מאוד בערכי סף העוצמה. הקפד להגדיר במדויק את ערכי הסף המתאימים.
   5. לחץ על כפתור סיום ובחר את סטטיסטיקה לחצן. בחרו בכרטיסייה 'כולל ' כדי למצוא את הערך של מספר המקומות הכולל בתמונה.
   6. ייצא סטטיסטיקה על ידי לחיצה על כרטיסייה הצג לקובץ כפתור וקבל את התוצאות בקובץ .xls.
   7. השתמש בתרשים מתאים כדי להציג את תוצאות הכימות.

תוצאות

לאחר תיוג EdU ותהליך ניקוי רקמות פגסוס (איור 2), הלסת התחתונה השקופה התקבלה כפי שמוצג בתמונה שלנו (איור 3B). השווינו את הדגימה שעברה שינוי ללסת תחתונה רגילה ללא תהליך ניקוי רקמות (איור 3A). הלסת התחתונה השקופה (איור 3B) עם תיוג EdU עבר?...

Discussion

מינונים מרובים של זריקות (BrdU, EdU) משמשים בדרך כלל על עכברים ילודים גדלים כדי לתייג תאים מתרבים ככל האפשר ^1,6,13. תקופת המרדף נחשבת לצעד קריטי לגבי קצב ההתחדשות של רקמות ^6,13. החותכת לעכבר מחדשת את עצמה מדי חודש. תכ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Sigma Aldrcih	E9884
20 × Objective/NA 0.9	Leica	507702
50 mL Falcon Centrifuge Tubes	Falcon	352070
BD PrecisionGlide Needle	BD	REF 305111
Bezyl benzoate (BB)	Sigma Aldrcih	409529
Bitplane 9.0.1	Imaris
BRAND cavity slides	Millipore Sigma	BR475505
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Strain #:000664
Circulation Pump	VWR	23609-170
CuSO4	Sigma Aldrcih	451657
DMSO	Sigma Aldrcih	D8418
EdU	Carboynth	NE08701
Heparin	Miiilipore Sigma	H3149
Imaging System	Olympus	DP27
LAS X Software	Leica
Olympus Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Paraformaldehye	Sigma Aldrich	P6148
PBS	Sigma Aldrich	P4417
PEGMMA500	Sigma Aldrich	447943
Quadrol	Sigma Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma Aldrich	11140
Sulfa-Cyanine 3 Azide	Lumiprobe	D1330
TBS-10X	Cell Signaling Technology	12498
TCS SP8 Confocal Microscope	Leica
tert-butanol (tB)	Sigma Aldrich	360538
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100