利用低氧分压降低小鼠骨髓基质细胞培养物中的造血细胞

摘要

骨髓基质细胞 （BMSC） 的常规培养导致分离异质性细胞群，其中许多细胞来源于造血。在这里，我们描述了一种利用低氧张力大大减少小鼠 BMSC 培养物中的造血污染物的方法。

摘要

目前，仍然缺乏普遍接受的标志物来前瞻性地分离骨骼干细胞 （SSC） 的同质群体。因此，支持造血并有助于骨骼所有功能的 BMSC 继续被广泛用于研究多能间充质祖细胞 （MMP） 和推断 SSC 功能。此外，鉴于用于研究肌肉骨骼疾病的转基因小鼠模型的广度，BMSCs 的使用也是检查调节 MMP 和 SSCs 的分子机制的有力工具。然而，小鼠 BMSCs 的常见分离程序导致超过 50% 的回收细胞来自造血，这可能会阻碍对这些研究期间生成的数据的解释。在这里，我们描述了一种使用低氧分压或缺氧选择性消除 BMSC 培养物中 CD45 ⁺ 细胞的方法。重要的是，这种方法可以很容易地实施，不仅可以减少造血污染物，还可以提高 BMSC 培养物中 MMP 和推定 SSC 的百分比。

引言

与造血干细胞 （HSC） 类似，SSC 位于骨微环境中;然而，与 HSC 不同的是，目前缺乏普遍接受的细胞表面标志物可用于前瞻性鉴定 SSC ^1,2,3。然而，体外培养系统和体内重建测定表明，一部分 BMSC 具有支持造血的能力，以及分化为间充质谱系的所有细胞的能力 ^4,5。因此，虽然 BMSC 代表了高度异质的群体，但这些细胞中的一部分具有真正干细胞的特征，其定义是它们能够自我更新和重建其来源组织的所有细胞。此外，与使用细胞表面标志物不同，BMSCs 可以根据其对组织培养塑料的快速粘附性快速分离 ^6,7。由于这些原因，BMSCs 通常用作 SSCs 的替代物⁵。

虽然优先粘附组织培养 （TC） 塑料已被用于从人体组织中成功分离 BMSC，但小鼠模型为该方法带来了额外的挑战。最值得注意的是，由于小鼠造血细胞具有粘附在 TC 塑料和 BMSC 上的能力，因此该模型系统中会发生高度造血污染，从而阻碍了对使用这种分离方法生成的数据的解释⁶。

值得注意的是，BMSCs 存在于氧分压为 1%-4%⁸ 的骨微环境中。然而，在标准组织培养条件下，细胞培养箱保持在 21% 的大气氧含量，代表超生理水平。强调这些差异的功能意义，在 21% 氧气下培养间充质来源的细胞与细胞死亡增加有关 ^9,10。此外，我们最近证明血液细胞和间充质细胞对低氧张力的反应不同。具体来说，当 BMSCs 培养物保持在低氧分压下时，CD45 ⁺ 造血细胞的数量显着减少。事实上，我们注意到使用这种技术使 CD45⁺ 造血细胞减少了 90%¹¹。

在这里，我们分享了一个可以轻松实施的方案，该方案可以很容易地用于实验室，以显着减少造血污染并提高 BMSC 常规培养过程中间充质细胞的纯度。

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研究方案

使用小鼠模型描述的所有方法均按照批准的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 方案 （A187-19-08） 进行。

1. 后肢骨解剖

1. 使用 2-4 L/min 的流速通过 CO₂ 窒息对 10-12 周龄雄性或雌性 C57BL/6 小鼠实施安乐死，然后通过斩首确认死亡。雌性或雄性小鼠都可以用于该测定，结果没有预期的差异。用 70% 乙醇喷洒羽绒毛皮。
2. 使用无菌手术钳和剪刀在胸骨下方的皮肤上做一个小切口。用手撕开身体周围周围的皮肤，然后将皮肤向远端拉向后肢，露出下面的组织。
3. 使用消毒的手术钳和剪刀将股骨头（球）与骨盆（髋关节）的髋臼（窝）分开，轻轻地去除后肢。使用无菌镊子和手术刀轻轻刮擦骨骼，以去除尽可能多的软组织。
4. 使用无菌手术刀将股骨和胫骨分开，以最小的阻力切割连接两块骨头的韧带（外侧和内侧支、前交叉和后交叉以及髌腱 [韧带]）。重要的是，分离后，保持股骨远端和胫骨近端的髁突完好无损。
5. 对于股骨远端，在股骨头和第三转子之间切开，并在生长板近端的骨骺处切开，以尽量减少对生长板的损伤。
6. 对于胫骨近端，在外踝近端切开一个，在胫骨平台远端靠近生长板切开一个。
7. 将股骨和胫骨切口面朝下放入单独的 1.5 mL 微量离心管中。

2. 从股骨和胫骨中分离 BMSC

1. 将 1.5 mL 微量离心管放入台式离心机中，并在 4 °C 下以 10,000 x g 旋转 1 秒。
2. 使用无菌镊子小心地从微量离心管中取出骨头，在微量离心管底部留下一个红色的骨髓塞。如果骨干中仍有骨髓，将骨头转移到新管中，重复快速旋转，并在重悬步骤 2.3 期间将颗粒合并在一个管中。
3. 使用 P1000 移液器将骨髓沉淀轻轻重悬于 500 μL 生长培养基、补充有 20% 胎牛血清和 1,000 U/ml 青霉素-链霉素的 MEMa 中。将骨髓基质细胞转移到含有 4.5 mL 生长培养基的 15 mL 锥形管中。

3. 红细胞裂解

1. 在 4 °C 下以 300 x g 旋转细胞 5 分钟。吸出生长培养基，并将沉淀轻轻重悬于 1.5 mL 红细胞裂解缓冲液中。
2. 在室温下孵育 75-90 秒。立即用 10 mL 生长培养基淬灭。
3. 在 4 °C 下以 300 x g 旋转细胞 5 分钟。吸出培养基并将沉淀重悬于 10 mL 生长培养基中进行计数（参见步骤 4）。
   注：细胞沉淀不应再为红色而是白色，表明红细胞裂解成功。如果沉淀仍然是红色的，则可以进行另一轮红细胞裂解缓冲液。

4. 电镀 BMSC

1. 要对活细胞进行计数以进行铺板，请去除 10 μL 细胞悬液，并加入 10 μL 台盼蓝溶液中。
2. 将 10 μL 细胞：台盼蓝溶液混合物置于血细胞计数器上，对活细胞（非蓝色）进行计数。大多数细胞应排除台盼蓝。
3. 对于集落测定，以 60,000 个细胞/cm² 的密度将细胞接种到 T-25 cm² 组织培养瓶中。对于高密度 BMSC 培养物，以 130,000 个细胞/cm² 的密度将细胞接种到 100 mm² 组织培养皿中。对于 T-25 cm² 培养瓶，使用总体积为 5 mL，对于 100 cm² 培养皿，使用总体积为 10 mL。
4. 将细胞在 1%-2%（缺氧）或 21% 氧气（常氧）和 5% CO₂ 下孵育 3 小时。对于低氧分压下 BMSC 的常规培养，可以使用低氧细胞培养箱或缺氧室。根据制造商的说明设置每台仪器，使氮气和二氧化碳的气流产生所需的氧气和 CO₂ 范围。
5. 3 小时后，用 1x PBS 小心冲洗板 3 次。为避免破坏已经开始附着的细胞，请减慢吸液速度并将移液移液到组织培养皿的侧面，轻轻冲洗。
6. 在最后的 1x PBS 冲洗后，如果使用 100 cm² 培养皿，则用 10 mL 生长培养基替换 PBS，如果使用 T-25cm² 培养瓶，则用 5 mL 生长培养基替换 PBS。冲洗后，应去除大多数漂浮细胞。

5. 在低氧条件下维持 BMSC

1. 对于缺氧培养物，将细胞维持在设置为 1%-2% O₂ 和 5% CO₂ 的缺氧室或培养箱中。对于常氧培养物，将细胞维持在 21% O₂ 和 5% CO_{2 中。} 如果使用低氧培养箱，请确保门至少打开，以防止大气中的氧气流入 （21%）。每 2-3 天更换一次媒体。
2. 对于集落检测，将细胞孵育 7-10 天，然后计数集落或开始分化或其他所需的检测。在低氧条件下，可以预期 50-120 个菌落，而在常氧条件下，可以预期 5-30 个菌落。
3. 对于高密度 BMSC 培养物，孵育细胞直至汇合，低氧培养大约需要 7-10 天，常氧培养大约需要 14-21 天。汇合后，用 0.25% 胰蛋白酶对细胞进行胰蛋白酶消化，用于所需的检测。
4. 要观察细胞，请将组织培养皿放在载物台上，将相位物镜旋转到光路中，并确保为相应的物镜选择相差滑块。以 100 倍或 200 倍放大倍率查看细胞。

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结果

细胞分离 7 天后，在 21% 氧气下培养的细胞具有高度异质性。具体来说，大小差异很大，较大的双极细胞与包含多个突起的较小细胞隔开（图 1A）。相比之下，在缺氧条件下生长的细胞是高度均匀的。菌落内的细胞大小相对相似，并且具有双极外观，类似于在组织培养塑料上生长的其他间充质来源的细胞（图 1B）。在培养后 14 ...

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讨论

根据我们的观察，BMSCs 比巨噬细胞和其他造血细胞更早粘附在组织培养塑料上¹¹。因此，接种后 3 小时冲洗板是一个关键步骤，因为这会去除有可能附着较晚时间点的漂浮造血细胞。此外，这些冲洗应小心进行，特别是将培养基移液到培养皿的侧面，以防止破坏尚未铺设基质并扩散到组织培养皿上的松散连接的圆形 BMSC。冲洗 3 次后，应去除大多数漂浮?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mm2 tissue culture dishes	Corning	353003
1x Phosphate Buffred Saline (PBS)	Gibco	100010-023
Bright-Line hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα, nucleosides	Gibco	12571-063
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
T-25cm2  tissue culture flasks	Corning	430168
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056