JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kemik iliği stromal hücrelerinin (BMSC'ler) rutin bir kültürü, birçok hücrenin hematopoietik kökenli olduğu heterojen hücre popülasyonlarının izolasyonuna yol açar. Burada, murin BMSC kültürlerinde hematopoietik kirleticileri büyük ölçüde azaltmak için düşük oksijen gerilimi kullanan bir yöntemi açıklıyoruz.

Özet

Şu anda, homojen bir iskelet kök hücre (SSC) popülasyonunu prospektif olarak izole etmek için evrensel olarak kabul edilmiş belirteçlerin eksikliği devam etmektedir. Bu nedenle, hematopoezi destekleyen ve iskeletin tüm fonksiyonlarına katkıda bulunan BMSC'ler, multipotent mezenkimal progenitörleri (MMP'ler) incelemek ve SSC fonksiyonunu çıkarmak için yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir. Ayrıca, kas-iskelet sistemi hastalıklarını incelemek için kullanılan transgenik murin modellerinin genişliği göz önüne alındığında, BMSC'lerin kullanımı, MMP'leri ve SSC'leri düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için güçlü bir araç olarak da hizmet eder. Bununla birlikte, murin BMSC'leri için yaygın izolasyon prosedürleri, geri kazanılan hücrelerin %50'sinden fazlasının hematopoietik kökenli olmasına neden olur ve bu çalışmalar sırasında üretilen verilerin yorumlanmasını potansiyel olarak engeller. Burada, BMSC kültürlerinde CD45+ hücrelerinin seçici olarak elimine edilmesi için düşük oksijen gerilimi veya hipoksi kullanan bir yöntemi tarif ediyoruz. Daha da önemlisi, bu yöntem sadece hemopoietik kontaminantları azaltmak için değil, aynı zamanda BMSC kültürlerindeki MMP'lerin ve varsayılan SSC'lerin yüzdesini artırmak için de kolayca uygulanabilir.

Giriş

Hematopoietik kök hücrelere (HSC'ler) benzer şekilde, SSC'ler kemik mikroçevresi içinde barındırılır; bununla birlikte, HSC'lerden farklı olarak, şu anda SSC'leri 1,2,3 prospektif olarak tanımlamak için kullanılabilecek evrensel olarak kabul edilmiş hücre yüzeyi belirteçlerinin eksikliği vardır. Bununla birlikte, in vitro kültür sistemleri ve in vivo sulandırma deneyleri, BMSC'lerin bir kısmının hematopoezi destekleme kapasitesinin yanı sıra mezenkimal soyların tüm hücrelerine farklılaşma yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir 4,5. Bu nedenle, BMSC'ler oldukça heterojen bir popülasyonu temsil ederken, bu hücrelerin bir kısmı, köken dokularının tüm hücrelerini kendi kendine yenileme ve yeniden oluşturma yetenekleri ile tanımlandığı gibi, iyi niyetli kök hücrelerin özelliklerine sahiptir. Ayrıca, hücre yüzey belirteçlerinin kullanımından farklı olarak, BMSC'ler, doku kültürü plastiğine hızlı yapışmalarına bağlı olarak hızlı bir şekilde izole edilebilir 6,7. Bu nedenlerden dolayı, BMSC'ler genellikle SSC'ler için bir vekil olarak kullanılır5.

BMSC'leri insan dokusundan başarılı bir şekilde izole etmek için doku kültürü (TC) plastiğine tercihli bağlılık kullanılmış olsa da, murin modelleri bu yöntem için ek zorluklar sunmaktadır. En önemlisi, murin hematopoetik hücreleri hem TC plastiğine hem de BMSC'lere yapışma kapasitesine sahip olduğundan, bu model sistemde yüksek hematopoietik kontaminasyon meydana gelir ve böylece bu izolasyon yöntemi kullanılarak üretilen verilerin yorumlanmasını engeller6.

Özellikle, BMSC'ler, oksijen gerilimlerinin %1-4 arasında değiştiği kemik mikro ortamında bulunur8. Bununla birlikte, standart doku kültürü koşulları altında, hücre kültürü inkübatörleri, suprafizyolojik seviyeleri temsil eden %21'lik atmosferik oksijen seviyelerinde tutulur. Bu farklılıkların fonksiyonel önemini vurgulamak, mezenkimal kökenli hücrelerin %21 oksijende kültürlenmesi, hücre ölümünün artmasıyla ilişkilidir 9,10. Ayrıca, son zamanlarda hematolojik hücrelerin ve mezenkimal hücrelerin düşük oksijen gerilimlerine farklı şekilde yanıt verdiğini gösterdik. Spesifik olarak, BMSC kültürleri düşük oksijen gerilimlerinde tutulduğunda CD45 + hematopoietik hücrelerin sayısında önemli bir azalma vardır. Gerçekten de, bu tekniği kullanarak CD45 + hematopoietik hücrelerde %90'lık bir azalma kaydettik11.

Burada, hematopoietik kontaminasyonu önemli ölçüde azaltmak ve BMSC'lerin rutin kültürü sırasında mezenkimal hücrelerin saflığını iyileştirmek için laboratuvarlar için kolayca uygulanabilecek bir protokolü paylaşıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Fare modelleri kullanılarak açıklanan tüm yöntemler, onaylanmış Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) protokollerine (A187-19-08) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Arka bacak kemiklerinin diseksiyonu

  1. 10-12 haftalık erkek veya dişi C57BL / 6 fareleri, 2-4 L / dk'lık bir akış hızı kullanarak CO2 boğulması ile ötenazi yapın ve ardından dekapitasyon ile ölümün doğrulanması ile ötenazi yapın. Bu testte dişi veya erkek fareler, sonuçlarda beklenen bir fark olmaksızın kullanılabilir. Kürkü %70 etanol ile püskürtün.
  2. Sternumun altındaki deride küçük bir kesi yapmak için steril cerrahi forseps ve makas kullanın. Vücudun çevresindeki cildi yırtmak için ellerinizi kullanın ve ardından alttaki dokuyu ortaya çıkarmak için cildi distal olarak arka ayaklara doğru çekin.
  3. Femur başını (top) pelvisin (kalça) asetabulumundan (soket) ayırarak arka ayağı nazikçe çıkarmak için sterilize cerrahi forseps ve makas kullanın. Mümkün olduğunca fazla yumuşak dokuyu çıkarmak için kemikleri nazikçe kazımak için steril forseps ve neşter kullanın.
  4. İki kemiği birbirine bağlayan bağları (lateral ve medial kollateral, ön ve arka çapraz ve patellar tendon [ligament]) kesmek için minimum direnç kullanarak femur ve tibiayı ayırmak için steril bir neşter kullanın. Daha da önemlisi, ayrılmadan sonra, hem distal femur hem de proksimal tibia üzerindeki kondilleri sağlam tutun.
  5. Distal femurlar için, femur başı ile üçüncü trokanter arasında bir kesi yapın ve büyüme plakasının proksimalindeki epifizde bir kesi yapın, bu da büyüme plakasına verilen hasarı en aza indirir.
  6. Proksimal tibialar için, lateral malleolün proksimalinde bir kesi ve büyüme plakasının hemen proksimalinde tibial platonun distalinde bir kesi yapın.
  7. Femurları ve tibiaları kesilmiş tarafı aşağı bakacak şekilde ayrı ayrı 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin.

2. BMSC'lerin femur ve tibialardan izolasyonu

  1. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini bir tezgah üstü santrifüje yerleştirin ve 1 saniye boyunca 4 ° C'de 10.000 x g'da döndürün.
  2. Mikrosantrifüj tüplerinden kemikleri dikkatlice çıkarmak için steril cımbız kullanın ve mikrosantrifüj tüpünün altında kırmızı bir kemik iliği tıkaç bırakın. Kemik şaftında bir miktar ilik kalırsa, kemiği yeni bir tüpe aktarın, hızlı dönüşü tekrarlayın ve yeniden süspansiyon sırasında peletleri tek bir tüpte birleştirin Adım 2.3.
  3. İlik peletini 500 μL büyüme ortamında nazikçe yeniden süspanse etmek için bir P1000 pipeti kullanın, MEMa %20 fetal sığır serumu ve 1.000 U/ml penisilin-streptomisin ile desteklenmiştir. Kemik iliği stromal hücrelerini, 4.5 mL büyüme ortamı içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.

3. Kırmızı kan hücrelerinin parçalanması

  1. Hücreleri 300 x g'da 4 ° C'de 5 dakika döndürün. Büyüme ortamını aspire edin ve peleti 1.5 mL kırmızı hücre lizis tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin.
  2. Oda sıcaklığında 75-90 s inkübe edin. Hemen 10 mL büyüme ortamı ile söndürün.
  3. Hücreleri 300 x g'da 4 ° C'de 5 dakika döndürün. Ortamı aspire edin ve peleti sayım için 10 mL büyüme ortamında yeniden süspanse edin (bkz. Adım 4).
    NOT: Hücre peleti artık kırmızı değil, beyaz olmalıdır, bu da kırmızı kan hücrelerinin başarılı bir şekilde parçalandığını gösterir. Pelet hala kırmızıysa, ek bir kırmızı hücre lizis tamponu turu gerçekleştirilebilir.

4. BMSC'lerin Kaplanması

  1. Kaplama için canlı hücreleri saymak için, 10 μL hücre süspansiyonunu çıkarın ve 10 μL Tripan Mavisi çözeltisine ekleyin.
  2. 10 μL hücre: Tripan Mavi çözelti karışımını bir hemositometre üzerine yerleştirin ve canlı (mavi olmayan) hücreleri sayın. Çoğu hücre Tripan mavisini dışlamalıdır.
  3. Koloni tahlilleri için, hücreleri 60.000 hücre /cm2 yoğunluğunda T-25cm2 doku kültürü şişelerine yerleştirin. Yüksek yoğunluklu BMSC kültürleri için, 130.000 hücre/cm2 yoğunlukta plaka hücreleri 100mm2 doku kültürü kabına dönüştürülür. T-25 cm2 şişe için toplam 5 mL hacim ve 100 cm2 tabak için toplam 10 mL hacim kullanın.
  4. Hücreleri 3 saat boyunca% 1 -% 2 (hipoksi) ve% 21 oksijen (normoksi) ve% 5 CO2'de inkübe edin. Düşük oksijen gerilimlerinde BMSC'lerin rutin kültürü için, bir hipoksik hücre inkübatörü veya bir hipoksi odası kullanılabilir. Her bir cihazı üreticinin talimatlarına göre ayarlayın, böylece nitrojen ve karbondioksit gaz akışı istenen oksijen veCO2 aralığına neden olacaktır.
  5. 3 saat sonra, plakaları 3x 1x PBS ile dikkatlice durulayın. Yapışmaya başlayan hücrelerin bozulmasını önlemek için, doku kültürü kaplarının yan tarafına yavaşlayarak, aspire ederek ve pipetleyerek nazikçe durulayın.
  6. Son 1x PBS durulamasının ardından, 100 cm2 tabak kullanıyorsanız PBS'yi 10 mL büyüme ortamı veya T-25 cm2 şişe kullanıyorsanız 5 mL büyüme ortamı ile değiştirin. Durulamadan sonra, yüzen hücrelerin çoğu çıkarılmalıdır.

5. BMSC'lerin hipoksik koşullarda sürdürülmesi

  1. Hipoksik kültürler için, hücreleri %1-2O2 ve %5 CO2'ye ayarlanmış bir hipoksi odasında veya inkübatörde tutun. Normolik kültürler için hücreleri %21O2 ve %5 CO2'de tutun. Hipoksik bir inkübatör kullanıyorsanız, atmosferik oksijen akışını önlemek için kapıların minimum düzeyde açıldığından emin olun (% 21). Medyayı 2-3 günde bir değiştirin.
  2. Koloni tahlilleri için, hücreleri 7-10 gün inkübe edin, ardından kolonileri numaralandırın veya farklılaşmaya veya istenen diğer tahlillere başlayın. Hipoksik koşullar altında 50-120 koloni beklenebilirken, normoksik koşullar altında 5-30 koloni beklenebilir.
  3. Yüksek yoğunluklu BMSC kültürleri için, hücreleri birleşene kadar, hipoksik kültürler için yaklaşık 7-10 gün ve normoksik kültürler için yaklaşık 14-21 gün inkübe edin. Bir kez birleştikten sonra, istenen tahlillerde kullanılmak üzere hücreleri% 0.25 tripsin ile tripsinize edin.
  4. Hücreleri görselleştirmek için doku kültürü kabını bir sahneye yerleştirin, faz objektifini optik yola döndürün ve ilgili objektif için faz kontrast kaydırıcısının seçili olduğundan emin olun. Hücreleri 100x veya 200x büyütme ile görüntüleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

7 günlük hücre izolasyonundan sonra,% 21 oksijende kültürlenen hücreler oldukça heterojendir. Spesifik olarak, daha büyük bipolar hücrelerin çoklu çıkıntılar içeren daha küçük hücrelerle iç içe geçtiği boyutta büyük bir varyasyon vardır (Şekil 1A). Buna karşılık, hipoksik koşullarda yetiştirilen hücreler oldukça homojendir. Koloniler içindeki hücreler boyut olarak nispeten benzerdir ve doku kültürü plastiği üzerinde ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Gözlemlerimize dayanarak, BMSC'ler doku kültürü plastiğine makrofajlardan ve diğer hemopoietik kökenli hücrelerden daha erken yapışır11. Bu nedenle, plakaların kaplanmasından 3 saat sonra durulanması, daha sonraki zaman noktalarına bağlanma potansiyeline sahip yüzen hematopoietik hücreleri ortadan kaldırdığı için kritik bir adımdır. Ayrıca, bu durulamalar, özellikle henüz matrisi bırakmamış ve doku kültürü kaplarına yayılmamış...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Duke Üniversitesi Ortopedik Cerrahi Anabilim Dalı tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100mm2 tissue culture dishesCorning353003
1x Phosphate Buffred Saline (PBS)Gibco100010-023
Bright-Line hemocytometerSigma-AldrichZ359629
C57BL/6JThe Jackson Laboratory664
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), CharacterizedGE Healthcare Life SciencesSH30071.03
InvivO2 400Baker Ruskinnhttps://bakerco.com
MEMα, nucleosidesGibco12571-063
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-MaxSigma-AldrichR7757
T-25cm2  tissue culture flasksCorning430168
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200-056

Referanslar

  1. Chen, K. G., Johnson, K. R., Robey, P. G. Mouse genetic analysis of bone marrow stem cell niches: technological pitfalls, challenges, and translational considerations. Stem Cell Reports. 9 (5), 1343-1358 (2017).
  2. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  3. Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
  4. Friedenstein, A. J., Chailakhjan, R. K., Lalykina, K. S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinetics. 3 (4), 393-403 (1970).
  5. Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
  6. Bearpark, A. D., Gordon, M. Y. Adhesive properties distinguish sub-populations of haemopoietic stem cells with different spleen colony-forming and marrow repopulating capacities. Bone Marrow Transplantation. 4 (6), 625-628 (1989).
  7. Kerk, D. K., Henry, E. A., Eaves, A. C., Eaves, C. J. Two classes of primitive pluripotent hemopoietic progenitor cells: separation by adherence. Journal Cell Physiology. 125 (1), 127-134 (1985).
  8. Spencer, J. A., et al. Direct measurement of local oxygen concentration in the bone marrow of live animals. Nature. 508 (7495), 269-273 (2014).
  9. Boregowda, S. V., et al. Atmospheric oxygen inhibits growth and differentiation of marrow-derived mouse mesenchymal stem cells via a p53-dependent mechanism: implications for long-term culture expansion. Stem Cells. 30 (5), 975-987 (2012).
  10. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nature Cell Biology. 5 (8), 741-747 (2003).
  11. Guo, W., et al. Hypoxia depletes contaminating CD45(+) hematopoietic cells from murine bone marrow stromal cell (BMSC) cultures: Methods for BMSC culture purification. Stem Cell Research. 53, 102317(2021).
  12. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. The Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  13. Naserian, S., Shamdani, S., Arouche, N., Uzan, G. Regulatory T cell induction by mesenchymal stem cells depends on the expression of TNFR2 by T cells. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 534(2020).
  14. Razazian, M., et al. Differences and similarities between mesenchymal stem cell and endothelial progenitor cell immunoregulatory properties against T cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 971-984 (2021).
  15. Ambrosi, T. H., Longaker, M. T., Chan, C. K. F. A revised perspective of skeletal stem cell biology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 189(2019).
  16. Krebsbach, P. H., Kuznetsov, S. A., Bianco, P., Robey, P. G. Bone marrow stromal cells: characterization and clinical application. Critical Reviews in Oral Biology and Medicine: An Official Publication of the American Association of Oral Biologists. 10 (2), 165-181 (1999).
  17. Harvey, D. M., Levine, A. J. p53 alteration is a common event in the spontaneous immortalization of primary BALB/c murine embryo fibroblasts. Genes and Development. 5 (12), 2375-2385 (1991).
  18. Buravkova, L. B., Andreeva, E. R., Gogvadze, V., Zhivotovsky, B. Mesenchymal stem cells and hypoxia: where are we. Mitochondrion. 19, 105-112 (2014).
  19. Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Molecular Cell. 30 (4), 393-402 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

D k Oksijen TansiyonuHematopoetik H crelerMurin Kemik li i Stromal H creleriBMSC lerskelet K k H creleriSSC lerMultipotent Mezenkimal Progenit rlerMMP lerHipoksiCD45 H cre EliminasyonuH cre zolasyon Y ntemleriKas skelet Sistemi Hastal klar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır