Utilisation d’une faible tension d’oxygène pour réduire les cellules hématopoïétiques dans des cultures de cellules stromales de moelle osseuse murine

Résumé

Une culture régulière de cellules stromales de moelle osseuse (BMSC) conduit à l’isolement de populations cellulaires hétérogènes, de nombreuses cellules étant d’origine hématopoïétique. Ici, nous décrivons une méthode qui utilise une faible tension d’oxygène pour réduire considérablement les contaminants hématopoïétiques dans les cultures murines de BMSC.

Résumé

À l’heure actuelle, il existe un manque de marqueurs universellement acceptés pour isoler prospectivement une population homogène de cellules souches squelettiques (SSC). Pour cette raison, les BMSC, qui soutiennent l’hématopoïèse et contribuent à toutes les fonctions du squelette, continuent d’être largement utilisés pour étudier les progéniteurs mésenchymateux multipotents (MMP) et pour déduire la fonction des SSC. De plus, compte tenu de l’étendue des modèles murins transgéniques utilisés pour étudier les maladies musculo-squelettiques, l’utilisation des BMSC constitue également un outil puissant pour examiner les mécanismes moléculaires régulant les MMP et les SSC. Cependant, les procédures d’isolement courantes pour les BMSC murines font en sorte que plus de 50 % des cellules récupérées sont d’origine hématopoïétique, ce qui pourrait entraver l’interprétation des données générées au cours de ces études. Ici, nous décrivons une méthode utilisant une faible tension d’oxygène ou une hypoxie pour l’élimination sélective des cellules CD45⁺ dans les cultures BMSC. Il est important de noter que cette méthode peut être facilement mise en œuvre non seulement pour réduire les contaminants hémopoïétiques, mais aussi pour augmenter le pourcentage de MMP et de SSC présumés dans les cultures BMSC.

Introduction

À l’instar des cellules souches hématopoïétiques (CSH), les CSP sont logées dans le microenvironnement osseux ; cependant, contrairement aux CSH, il y a actuellement un manque de marqueurs de surface cellulaire universellement acceptés qui peuvent être utilisés pour identifier prospectivement les CSS^{1, 2 et 3}. Cependant, les systèmes de culture in vitro et les essais de reconstitution in vivo démontrent qu’une proportion de BMSC ont la capacité de soutenir l’hématopoïèse, ainsi que la capacité de se différencier en toutes les cellules des lignées mésenchymateuses ^4,5. Ainsi, alors que les BMSC représentent une population très hétérogène, une proportion de ces cellules présente des caractéristiques de cellules souches authentiques, définies par leur capacité à s’auto-renouveler et à reconstituer toutes les cellules de leur tissu d’origine. De plus, contrairement à l’utilisation de marqueurs de surface cellulaire, les BMSC peuvent être rapidement isolés grâce à leur adhérence rapide au plastique^de culture tissulaire ^6,7. Pour ces raisons, les BMSC sont souvent utilisés comme substitut des SSC⁵.

Bien que l’adhérence préférentielle au plastique de culture tissulaire (TC) ait été utilisée pour isoler avec succès les BMSC des tissus humains, les modèles murins présentent des défis supplémentaires pour cette méthode. Plus particulièrement, comme les cellules hématopoïétiques murines ont la capacité d’adhérer à la fois au plastique TC et aux BMSC, une forte contamination hématopoïétique se produit dans ce système modèle, entravant ainsi l’interprétation des données générées à l’aide de cette méthode d’isolement⁶.

Notamment, les BMSC résident dans le microenvironnement osseux où les tensions d’oxygène varient de 1 % à 4 %⁸. Cependant, dans des conditions standard de culture tissulaire, les incubateurs de culture cellulaire sont maintenus à des niveaux d’oxygène atmosphérique de 21 %, ce qui représente des niveaux supraphysiologiques. Soulignant l’importance fonctionnelle de ces différences, la culture de cellules d’origine mésenchymateuse à 21 % d’oxygène est associée à une augmentation de la mort cellulaire ^9,10. De plus, nous avons récemment démontré que les cellules hématologiques et les cellules mésenchymateuses répondent différemment à de faibles tensions d’oxygène. Plus précisément, il y a une diminution substantielle du nombre de cellules hématopoïétiques CD45⁺ lorsque les cultures de BMSC sont maintenues à de faibles tensions d’oxygène. En effet, nous avons noté une réduction de 90 % des cellules hématopoïétiques CD45⁺ en utilisant cette technique¹¹.

Ici, nous partageons un protocole qui peut être facilement mis en œuvre par les laboratoires afin de réduire considérablement la contamination hématopoïétique et d’améliorer la pureté des cellules mésenchymateuses lors de la culture de routine de BMSC.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites à l’aide de modèles murins ont été exécutées conformément aux protocoles approuvés par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (A187-19-08).

1. Dissection des os des membres postérieurs

1. Euthanasier des souris C57BL/6 mâles ou femelles âgées de 10 à 12 semaines par asphyxie au CO₂ à un débit de 2 à 4 L/min, suivie d’une confirmation de la mort par décapitation. Des souris femelles ou mâles peuvent être utilisées dans cet essai sans qu’aucune différence ne soit attendue dans les résultats. Vaporisez la fourrure avec 70 % d’éthanol.
2. Utilisez des pinces chirurgicales stériles et des ciseaux pour faire une petite incision dans la peau sous le sternum. Utilisez les mains pour déchirer la peau autour de la circonférence du corps, puis tirez la peau distalement vers les membres postérieurs pour exposer le tissu sous-jacent.
3. À l’aide d’une pince chirurgicale et de ciseaux stérilisés, vous enlevez délicatement la patte postérieure en séparant la tête fémorale (boule) de l’acétabulum (cavité) du bassin (hanche). À l’aide d’une pince stérile et d’un scalpel, grattez doucement le long des os afin d’enlever le plus de tissus mous possible.
4. Utilisez un scalpel stérile pour séparer le fémur et le tibia en utilisant une résistance minimale pour couper les ligaments (collatéral latéral et médial, croisé antérieur et postérieur et tendon rotulien [ligament]) reliant les deux os. Il est important de noter qu’après la séparation, gardez intacts les condyles du fémur distal et du tibia proximal.
5. Pour les fémurs distaux, faites une incision entre la tête fémorale et le troisième trochanter et une incision au niveau de l’épiphyse proximale de la plaque de croissance, minimisant ainsi les dommages à la plaque de croissance.
6. Pour les tibias proximaux, faites une coupe proximale à la malléole latérale et une coupe distale du plateau tibial juste à proximité de la plaque de croissance.
7. Placer les fémurs et les tibias, côté coupé vers le bas, dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,5 ml.

2. Isolement des BMSC des fémurs et des tibias

1. Placez les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL dans une centrifugeuse de paillasse et faites-les tourner à 10 000 x g à 4 °C pendant 1 s.
2. À l’aide d’une pince à épiler stérile, retirez soigneusement les os des tubes de microcentrifugation, en laissant un bouchon rouge de moelle osseuse au fond du tube de microcentrifugation. S’il reste de la moelle osseuse dans la tige osseuse, transférez l’os dans un nouveau tube, répétez l’essorage rapide et combinez les granulés dans un seul tube pendant la remise en suspension Étape 2.3.
3. À l’aide d’une pipette P1000, la pastille de moelle osseuse est remise en suspension dans 500 μL de milieu de croissance, MEMa complété par 20 % de sérum de veau fœtal et 1 000 U/ml de pénicilline-streptomycine. Transférez les cellules stromales de la moelle osseuse dans un tube conique de 15 ml contenant 4,5 ml de milieu de croissance.

3. Lyse des globules rouges

1. Faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min. Aspirez le milieu de croissance et remettez doucement la pastille en suspension dans 1,5 mL de tampon de lyse des globules rouges.
2. Incuber à température ambiante pendant 75 à 90 s. Tremper immédiatement avec 10 mL de milieu de croissance.
3. Faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min. Aspirez le milieu et remettez la pastille en suspension dans 10 mL de milieu de croissance pour le comptage (voir l’étape 4).
   REMARQUE : La pastille cellulaire ne doit plus être rouge mais blanche, indiquant une lyse réussie des globules rouges. Si la pastille est encore rouge, une série supplémentaire de tampons de lyse des globules rouges peut être effectuée.

4. Placage BMSC

1. Pour compter les cellules vivantes à plaquer, prélever 10 μL de suspension cellulaire et les ajouter à 10 μL de solution de Trypan Blue.
2. Placez 10 μL du mélange de solution cellule :Trypan Blue sur un hémocytomètre et comptez les cellules viables (non bleues). La plupart des cellules doivent exclure le bleu trypan.
3. Pour les essais en colonie, plaquez les cellules à une densité de 60 000 cellules/^cm2 dans des flacons de culture tissulaire T-25 cm² . Pour les cultures BMSC à haute densité, les cellules sur plaque à une densité de 130 000 cellules/^cm2 sont placées dans des boîtes de culture tissulaire de 100 mm² . Utiliser un volume total de 5 mL pour les flacons T-25 cm² et un volume total de 10 mL pour 100 cm² plats.
4. Incuber les cellules pendant 3 h à 1 % à 2 % (hypoxie) ou à 21 % d’oxygène (normoxie) et 5 % de CO₂. Pour la culture régulière de BMSC à de faibles tensions d’oxygène, un incubateur de cellules hypoxiques ou une chambre d’hypoxie peut être utilisé. Réglez chaque instrument selon les instructions du fabricant afin que le flux gazeux d’azote et de dioxyde de carbone se traduise par la plage souhaitée d’oxygène et de CO₂.
5. Après 3 h, rincez soigneusement les plaques 3x avec 1x PBS. Pour éviter de perturber les cellules qui ont commencé à se fixer, rincez doucement en ralentissant l’aspiration et le pipetage sur le côté des boîtes de culture tissulaire.
6. Après le rinçage final 1 fois le PBS, remplacer le PBS par 10 ml de milieu de culture si vous utilisez^{des boîtes de 100 cm 2} ou 5 ml de milieu de culture si vous utilisez des^{2 flacons} de T-25cm. Après le rinçage, la plupart des cellules flottantes doivent être éliminées.

5. Maintien des BMSC dans des conditions hypoxiques

1. Pour les cultures hypoxiques, maintenez les cellules dans une chambre d’hypoxie ou un incubateur réglé à 1 %-2 % d’O2 et 5 % de CO₂. Pour les cultures normoxiques, maintenir les cellules à 21 %_d’O2 et 5 % de CO_2. Si vous utilisez un incubateur hypoxique, assurez-vous que les portes sont ouvertes au minimum pour éviter les afflux d’oxygène atmosphérique (21 %). Changez de support tous les 2-3 jours.
2. Pour les essais de colonie, incubez les cellules pendant 7 à 10 jours, après quoi soit énumérez les colonies, soit commencez la différenciation ou d’autres essais souhaités. Dans des conditions hypoxiques, entre 50 et 120 colonies peuvent être anticipées, tandis que dans des conditions normoxiques, entre 5 et 30 colonies peuvent être anticipées.
3. Pour les cultures BMSC à haute densité, incuber les cellules jusqu’à ce qu’elles confluent, environ 7 à 10 jours pour les cultures hypoxiques et environ 14 à 21 jours pour les cultures normoxiques. Une fois confluents, essayez de tester les cellules avec de la trypsine à 0,25 % pour les utiliser dans les dosages souhaités.
4. Pour visualiser les cellules, placez la boîte de culture tissulaire sur une platine, faites pivoter l’objectif de phase dans la voie optique et assurez-vous que le curseur de contraste de phase est sélectionné pour l’objectif correspondant. Affichez les cellules avec un grossissement de 100x ou 200x.

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Résultats

Après 7 jours d’isolement cellulaire, les cellules cultivées à 21 % d’oxygène sont très hétérogènes. Plus précisément, il existe une grande variation de taille, avec des cellules bipolaires plus grandes espacées avec des cellules plus petites contenant de multiples protubérances (Figure 1A). En revanche, les cellules cultivées dans des conditions hypoxiques sont très homogènes. Les cellules à l’intérieur des colonies sont de taille re...

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Discussion

D’après nos observations, les BMSC adhèrent au plastique de culture tissulaire plus tôt que les macrophages et autres cellules d’origine hémopoïétique¹¹. Pour cette raison, le rinçage des plaques 3 h après le placage est une étape critique car elle élimine les cellules hématopoïétiques flottantes qui ont le potentiel de se fixer plus tard. De plus, ces rinçages doivent être effectués avec soin, en particulier en pipetant le milieu sur le côté...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mm2 tissue culture dishes	Corning	353003
1x Phosphate Buffred Saline (PBS)	Gibco	100010-023
Bright-Line hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα, nucleosides	Gibco	12571-063
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
T-25cm2  tissue culture flasks	Corning	430168
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056