쥐 골수 기질 세포 배양에서 조혈 세포를 줄이기 위해 낮은 산소 장력 활용

요약

골수 기질 세포(BMSC)의 일상적인 배양은 많은 세포가 조혈 기원인 이질적인 세포 집단의 분리로 이어집니다. 여기에서는 쥐 BMSC 배양에서 조혈 오염 물질을 크게 줄이기 위해 낮은 산소 장력을 활용하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

현재로서는 동질적인 골격 줄기 세포(SSC) 집단을 전향적으로 분리하기 위해 보편적으로 받아들여지는 마커가 부족합니다. 이러한 이유로 조혈을 지원하고 골격의 모든 기능에 기여하는 BMSC는 다능 중간엽 전구세포(MMP)를 연구하고 SSC 기능을 추론하는 데 계속 널리 사용되고 있습니다. 더욱이, 근골격계 질환을 연구하는 데 사용되는 형질전환 쥐 모델의 폭을 감안할 때, BMSC의 사용은 MMP와 SSC를 조절하는 분자 메커니즘을 조사하는 강력한 도구로도 작용합니다. 그러나 쥐 BMSC에 대한 일반적인 분리 절차로 인해 회수된 세포의 50% 이상이 조혈 기원이 되어 이러한 연구 중에 생성된 데이터의 해석을 방해할 수 있습니다. 여기에서는 BMSC 배양에서 CD45⁺ 세포를 선택적으로 제거하기 위해 낮은 산소 장력 또는 저산소증을 사용하는 방법을 설명합니다. 중요한 것은 이 방법을 쉽게 구현하여 조혈성 오염 물질을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 BMSC 배양에서 MMP 및 추정 SSC의 비율을 높일 수 있다는 것입니다.

서문

조혈모세포(HSC)와 유사하게, SSC는 뼈 미세환경 내에 존재합니다. 그러나 HSC와 달리 현재 SSC ^1,2,3을 전향적으로 식별하는 데 사용할 수 있는 보편적으로 허용되는 세포 표면 마커가 부족합니다. 그러나 체외 배양 시스템 및 생체 내 재구성 분석은 BMSC의 일부가 조혈을 지원할 수 있는 능력과 중간엽 계통의 모든 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있음을 보여줍니다 ^4,5. 따라서 BMSC는 매우 이질적인 집단을 나타내지만, 이러한 세포의 일부는 기원 조직의 모든 세포를 자가 재생하고 재구성하는 능력으로 정의되는 진정한 줄기 세포의 특징을 가지고 있습니다. 또한, 세포 표면 마커의 사용과 달리 BMSC는 조직 배양 플라스틱에 대한 빠른 부착을 기반으로 신속하게 분리할 수 있습니다 ^6,7. 이러한 이유로 BMSC는 종종 SSC의 대용으로 사용됩니다⁵.

조직 배양(TC) 플라스틱에 대한 우선적 준수는 인간 조직에서 BMSC를 성공적으로 분리하는 데 사용되었지만, 쥐 모델은 이 방법에 대한 추가적인 과제를 제시합니다. 특히 쥐 조혈 세포는 TC 플라스틱과 BMSC에 모두 부착할 수 있는 능력을 가지고 있기 때문에 이 모델 시스템에서 높은 조혈 오염이 발생하여 이 분리 방법⁶을 사용하여 생성된 데이터의 해석을 방해합니다.

특히 BMSC는 산소 장력이 1%-4%⁸ 범위의 뼈 미세환경에 존재합니다. 그러나 표준 조직 배양 조건에서 세포 배양 인큐베이터는 초생리학적 수준을 나타내는 21%의 대기 산소 수준으로 유지됩니다. 이러한 차이의 기능적 중요성을 강조하면서, 21% 산소에서 중간엽 기원의 세포를 배양하는 것은 세포 사멸 증가와 관련이 있습니다 ^9,10. 또한, 우리는 최근에 혈액 세포와 중간엽 세포가 낮은 산소 장력에 다르게 반응한다는 것을 입증했습니다. 특히, BMSC 배양이 낮은 산소 장력으로 유지될 때 CD45⁺ 조혈 세포의 수가 크게 감소합니다. 실제로, 우리는 이 기술을 사용하여 CD45⁺ 조혈 세포가 90% 감소한 것을 확인했습니다¹¹.

여기에서는 BMSC의 일상적인 배양 중에 조혈 오염을 크게 줄이고 중간엽 세포의 순도를 개선하기 위해 실험실에서 쉽게 구현할 수 있는 프로토콜을 공유합니다.

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프로토콜

쥐 모델을 사용하여 설명된 모든 방법은 승인된 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 프로토콜(A187-19-08)에 따라 수행되었습니다.

1. 뒷다리 뼈 절개

1. 10-12주 된 수컷 또는 암컷 C57BL/6 마우스를 2-4L/min의 유속을 사용하여 CO₂ 질식으로 안락사시킨 후 참수로 사망을 확인합니다. 암컷 또는 수컷 마우스를 이 분석에 사용할 수 있으며 결과에서 예상되는 차이는 없습니다. 털에 70% 에탄올을 뿌립니다.
2. 멸균 수술용 집게와 가위를 사용하여 흉골 아래 피부를 작게 절개합니다. 손을 사용하여 몸 둘레의 피부를 찢은 다음 피부를 뒷다리 쪽으로 원위적으로 당겨 아래 조직을 노출시킵니다.
3. 멸균된 수술용 집게와 가위를 사용하여 대퇴골두(볼)와 골반(엉덩이)의 비구(소켓)를 분리하여 뒷다리를 부드럽게 제거합니다. 멸균 집게와 메스를 사용하여 뼈를 따라 부드럽게 긁어 연조직을 최대한 많이 제거합니다.
4. 멸균 메스를 사용하여 최소한의 저항으로 대퇴골과 경골을 분리하고 두 뼈를 연결하는 인대(측면 및 내측 측부, 전방 및 후방 십자인대, 슬개건[인대])를 절단합니다. 중요한 것은 분리 후 원위 대퇴골과 근위 경골 모두의 과두를 그대로 유지하는 것입니다.
5. 원위 대퇴골의 경우, 대퇴골두와 제3 대퇴골 사이를 절개하고 성장판에 근접한 골단을 절개하여 성장판의 손상을 최소화합니다.
6. 근위 경골의 경우, 하나는 외측 상골(lateral malleolus) 근위부에 절단하고 다른 하나는 경골 고원(tibial plateau)의 원위부에 절단하여 성장판(growth plate)에 바로 근접하도록 합니다.
7. 대퇴골과 경골 절단면이 아래를 향하도록 개별 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 놓습니다.

2. 대퇴골 및 경골에서 BMSC의 분리

1. 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브를 탁상형 원심분리기에 놓고 10,000 x g , 4°C에서 1초 동안 회전합니다.
2. 멸균 핀셋을 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브에서 뼈를 조심스럽게 제거하고 마이크로 원심분리기 튜브 바닥에 빨간색 골수 마개를 남깁니다. 골수에 골수가 약간 남아 있으면 뼈를 새 튜브로 옮기고 빠른 회전을 반복한 다음 재부유 단계 2.3 동안 펠릿을 하나의 튜브에 결합합니다.
3. P1000 피펫을 사용하여 500μL의 성장 배지, 20% 소 태아 혈청 및 1,000U/ml 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 MEMa에 골수 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 골수 기질 세포를 4.5mL의 성장 배지가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

3. 적혈구의 용해

1. 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 셀을 스핀다운합니다. 성장 배지를 흡인하고 펠릿을 1.5mL의 적혈구 용해 완충액에 부드럽게 재현탁합니다.
2. 실온에서 75-90초 동안 배양합니다. 10mL의 성장 배지로 즉시 담금질합니다.
3. 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 셀을 스핀다운합니다. 배지를 흡입하고 계수를 위해 10mL의 성장 배지에 펠릿을 재현탁합니다(4단계 참조).
   알림: 세포 펠릿은 더 이상 빨간색이 아니라 흰색이어야 하며, 이는 적혈구의 성공적인 용해를 나타냅니다. 펠릿이 여전히 빨간색인 경우, 빨간색 세포 용해 버퍼의 추가 라운드를 수행할 수 있습니다.

4. BMSC 도금

1. 도금을 위해 살아있는 세포를 계수하려면 10μL의 세포 현탁액을 제거하고 10μL의 Trypan Blue 용액에 추가합니다.
2. 10μL의 cell:Trypan Blue 용액 혼합물을 혈구계에 놓고 생존 가능한(파란색이 아닌) 세포를 계수합니다. 대부분의 셀은 트리판 블루를 제외해야 합니다.
3. 콜로니 분석의 경우, 60,000 cells/^cm2 밀도로 세포를 T-25^cm2 조직 배양 플라스크에 플레이트링합니다. 고밀도 BMSC 배양의 경우 130,000 cells/^cm2 밀도의 플레이트셀을 100mm2 조직 배양 접시에 넣습니다. T-5cm²⁵ 플라스크의 경우 총 2mL, 100cm² 접시의 경우 총 10mL를 사용합니다.
4. 1%-2%(저산소증) 또는 21% 산소(정상 산소) 및 5% CO₂에서 3시간 동안 세포를 배양합니다. 낮은 산소 장력에서 BMSC의 일상적인 배양을 위해 저산소 세포 배양기 또는 저산소증 챔버를 사용할 수 있습니다. 질소와 이산화탄소의 가스 흐름이 원하는 범위의 산소와 CO₂가 되도록 제조업체의 지침에 따라 각 기기를 설정하십시오.
5. 3시간 후 1x PBS로 플레이트를 3x 조심스럽게 헹굽니다. 부착하기 시작한 세포를 방해하지 않으려면 천천히 흡입하고 조직 배양 접시 측면에 피펫팅하여 부드럽게 헹굽니다.
6. 최종 1x PBS 헹굼 후 PBS를 100cm² 접시를 사용하는 경우 10mL의 성장 배지로 교체하거나 T-25cm² 플라스크를 사용하는 경우 5mL의 성장 배지로 교체합니다. 헹굼 후에는 대부분의 떠 있는 세포를 제거해야 합니다.

5. 저산소 조건에서 BMSC 유지

1. 저산소 배양의 경우 1%-2% O₂ 및 5% CO₂로 설정된 저산소증 챔버 또는 인큐베이터에서 세포를 유지합니다. 규환 배양의 경우 세포를 21%_O2 및 5% CO 2로 유지합니다_. 저산소 인큐베이터를 사용하는 경우 대기 중 산소(21%)의 유입을 방지하기 위해 도어를 최소한으로 열어야 합니다. 2-3일마다 미디어를 교체하십시오.
2. 콜로니 분석의 경우, 7-10일 동안 세포를 배양한 후 콜로니를 열거하거나 분화 또는 기타 원하는 분석을 시작합니다. 저산소 조건에서는 50-120개의 군체를 예상할 수 있는 반면, 정상 산소 조건에서는 5-30개의 군체를 예상할 수 있습니다.
3. 고밀도 BMSC 배양의 경우, 저산소 배양의 경우 약 7-10일, 정상 산소 배양의 경우 약 14-21일이 융합될 때까지 세포를 배양합니다. 일단 융합되면 원하는 분석에 사용하기 위해 0.25% 트립신으로 세포를 트립신화합니다.
4. 세포를 시각화하려면 조직 배양 접시를 스테이지에 놓고, 위상 대물렌즈를 광학 경로로 회전하고, 해당 대물렌즈에 대해 위상차 슬라이더가 선택되어 있는지 확인합니다. 100x 또는 200x 배율로 셀을 봅니다.

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결과

7일간의 세포 분리 후 21% 산소에서 배양된 세포는 매우 이질적입니다. 구체적으로 말하자면, 크기가 큰 양극성 세포는 여러 개의 돌기를 포함하는 작은 세포와 간격을 두고 있습니다(그림 1A). 대조적으로, 저산소 조건에서 자란 세포는 매우 균질합니다. 군체 내의 세포는 크기가 비교적 비슷하고 양극성 모양을 가지고 있어 조직 배양 플라스틱에서 ?...

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토론

본 연구의 관찰에 따르면, BMSC는 대식세포 및 조혈 기원의 다른 세포보다 먼저 조직 배양 플라스틱에 부착된다¹¹. 이러한 이유로 도금 3시간 후 플레이트를 헹구는 것은 나중에 부착될 가능성이 있는 부유 조혈 세포를 제거하기 때문에 중요한 단계입니다. 또한, 이러한 헹굼은 아직 매트릭스를 배치하지 않고 조직 배양 접시에 퍼지지 않은 느슨하게 부착?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mm2 tissue culture dishes	Corning	353003
1x Phosphate Buffred Saline (PBS)	Gibco	100010-023
Bright-Line hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα, nucleosides	Gibco	12571-063
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
T-25cm2  tissue culture flasks	Corning	430168
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056