ניצול מתח חמצן נמוך להפחתת תאים המטופויאטיים בתרביות תאי סטרומה של מח עצם עכברים

Summary

תרבית שגרתית של תאי סטרומה של מח עצם (BMSCs) מובילה לבידוד של אוכלוסיות תאים הטרוגניות, כאשר תאים רבים הם ממקורות המטופויאטיים. כאן, אנו מתארים שיטה המשתמשת במתח חמצן נמוך כדי להפחית מאוד מזהמים המטופויאטיים בתרביות BMSC של עכברים.

Abstract

נכון לעכשיו, נותר מחסור בסמנים מקובלים אוניברסליים לבידוד פרוספקטיבי של אוכלוסייה הומוגנית של תאי גזע שלד (SSCs). מסיבה זו, BMSCs, התומכים בהמטופואיזיס ותורמים לכל תפקודי השלד, ממשיכים להיות בשימוש נרחב לחקר אבות מזנכימליים רב-פוטנטיים (MMPs) ולהסקת תפקוד SSC. יתר על כן, בהתחשב בהיקף המודלים של עכברים טרנסגניים המשמשים לחקר מחלות שרירים ושלד, השימוש ב-BMSCs משמש גם ככלי רב עוצמה לבחינת המנגנונים המולקולריים המווסתים MMPs ו-SSCs. עם זאת, הליכי בידוד נפוצים עבור BMSCs עכברים גורמים לכך שלמעלה מ-50% מהתאים המשוחזרים הם ממקור המטופויאטי מה שעלול לעכב את פירוש הנתונים שנוצרו במהלך מחקרים אלה. כאן, אנו מתארים שיטה המשתמשת במתח חמצן נמוך או היפוקסיה לחיסול סלקטיבי של תאי CD45⁺ בתרביות BMSC. חשוב לציין, ניתן ליישם שיטה זו בקלות לא רק כדי להפחית מזהמים המופויאטיים אלא גם כדי לשפר את אחוז ה-MMPs וה-SSCs המשוערים בתרביות BMSC.

Introduction

בדומה לתאי גזע המטופויאטיים (HSCs), SSCs שוכנים בתוך מיקרו-סביבת העצם; עם זאת, בניגוד ל-HSCs, כיום חסרים סמני פני תא מקובלים אוניברסליים שניתן להשתמש בהם כדי לזהות באופן פרוספקטיבי SSCs ^1,2,3. עם זאת, מערכות תרבית במבחנה ובדיקות בנייה מחדש in vivo מדגימות כי לחלק מה-BMSCs יש את היכולת לתמוך בהמטופואיזיס, כמו גם את היכולת להתמיין לכל התאים של השושלות המזנכימליות ^4,5. לפיכך, בעוד BMSCs מייצגים אוכלוסייה הטרוגנית מאוד, לחלק מהתאים הללו יש תכונות של תאי גזע אמיתיים, כפי שהם מוגדרים על ידי יכולתם לחדש את עצמם ולבנות מחדש את כל התאים מרקמת המקור שלהם. יתרה מכך, בניגוד לשימוש בסמני פני התא, ניתן לבודד במהירות BMSCs על סמך הדבקותם המהירה בפלסטיק תרבית רקמות ^6,7. מסיבות אלה, BMSCs משמשים לעתים קרובות כתחליף ל-SSCs⁵.

בעוד שהקפדה על פלסטיק תרבית רקמות (TC) שימשה לבידוד מוצלח של BMSCs מרקמה אנושית, מודלים של עכברים מציבים אתגרים נוספים לשיטה זו. בעיקר, מכיוון שלתאים המטופויאטיים של עכברים יש את היכולת להיצמד הן לפלסטיק TC והן ל-BMSCs, זיהום המטופויאטי גבוה מתרחש במערכת מודל זו, ובכך מעכב את פרשנות הנתונים שנוצרו באמצעות שיטת בידוד זו⁶.

יש לציין כי BMSCs שוכנים במיקרו-סביבת העצם שבה מתחי החמצן נעים בין 1%-4%⁸. עם זאת, בתנאי תרבית רקמה סטנדרטיים, חממות תרביות תאים נשמרות ברמות חמצן אטמוספריות של 21%, המייצגות רמות על-פיזיולוגיות. תוך הדגשת המשמעות התפקודית של הבדלים אלה, תרבית תאים ממוצא מזנכימלי ב-21% חמצן קשורה למוות תאים מוגבר ^9,10. יתר על כן, לאחרונה הראינו שתאים המטולוגיים ותאים מזנכימליים מגיבים באופן דיפרנציאלי למתחי חמצן נמוכים. באופן ספציפי, יש ירידה משמעותית במספר התאים ההמטופויאטיים CD45⁺ כאשר תרביות BMSCs נשמרות במתחי חמצן נמוכים. ואכן, ציינו ירידה של 90% בתאים המטופויאטיים CD45⁺ באמצעות טכניקה זו¹¹.

כאן, אנו חולקים פרוטוקול שניתן ליישם בקלות עבור מעבדות כדי להפחית משמעותית את הזיהום ההמטופויאטי ולשפר את הטוהר של תאים מזנכימליים במהלך תרבית שגרתית של BMSCs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל השיטות שתוארו תוך שימוש במודלים של עכברים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים המאושרים של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) (A187-19-08).

1. דיסקציה של עצמות הגפיים האחוריות

1. המתת חסד של עכברים זכרים או נקבות C57BL/6 בני 10-12 שבועות על ידי חנק CO₂ באמצעות קצב זרימה של 2-4 ליטר לדקה ואחריו אישור מוות על ידי עריפת ראש. ניתן להשתמש בעכברים נקבות או זכרים בבדיקה זו ללא הבדלים צפויים בתוצאות. רססו את הפרווה עם 70% אתנול.
2. השתמש במלקחיים ובמספריים כירורגיים סטריליים כדי לבצע חתך קטן בעור מתחת לעצם החזה. השתמש בידיים כדי לקרוע את העור סביב היקף הגוף ולאחר מכן משוך את העור דיסטלי לכיוון הגפיים האחוריות כדי לחשוף את הרקמה הבסיסית.
3. השתמש במלקחיים כירורגיים מעוקרים ובמספריים כדי להסיר בעדינות את הגפה האחורית על ידי הפרדת ראש הירך (כדור) מהאצטבולום (שקע) של האגן (הירך). השתמש במלקחיים סטריליים ובאזמל כדי לגרד בעדינות לאורך העצמות כדי להסיר כמה שיותר רקמות רכות.
4. השתמש באזמל סטרילי כדי להפריד בין עצם הירך לשוק תוך שימוש בהתנגדות מינימלית לחיתוך הרצועות (בטחונות לרוחב ומדיאלי, צולב קדמי ואחורי וגיד הפיקה [רצועה]) המחברים בין שתי העצמות. חשוב לציין, לאחר ההפרדה, שמור על הקונדילות הן על עצם הירך הדיסטלית והן על עצם השוק הפרוקסימלית.
5. עבור עצם הירך הדיסטלית, בצע חתך בין ראש הירך לטרוכנטר השלישי וחתך באפיפיזה הפרוקסימלית לצלחת הגידול, תוך מזעור הנזק ללוחית הגדילה.
6. עבור טיביה פרוקסימלית, בצע חתך אחד פרוקסימלי למלאולוס הצדדי וחתך אחד דיסטלי של רמת השוקה רק קרוב לצלחת הגדילה.
7. הנח את עצם הירך והשוקה החתוכות כלפי מטה בצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים של 1.5 מ"ל.

2. בידוד BMSCs מעצם הירך והשוקה

1. הנח צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל בצנטריפוגה ספסל וסובב ב-10,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 1 שניות.
2. השתמש בפינצטה סטרילית כדי להסיר בזהירות עצמות מצינורות המיקרו-צנטריפוגה, ולהשאיר פקק אדום של מח עצם בתחתית צינור המיקרו-צנטריפוגה. אם נשאר מח עצם כלשהו בפיר העצם, העבירו את העצם לצינור חדש, חזרו על הסיבוב המהיר ושלבו את הכדורים בצינור אחד במהלך ההשעיה מחדש שלב 2.3.
3. השתמש בפיפטה P1000 כדי להשעות בעדינות את גלולת המח ב-500 מיקרוליטר של מצע גדילה, MEMa בתוספת 20% סרום בקר עוברי ו-1,000 U/ml פניצילין-סטרפטומיצין. העבר תאי סטרומה של מח עצם לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 4.5 מ"ל של מצע גדילה.

3. ליזה של כדוריות דם אדומות

1. סובב תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שאפו את מצע הגידול והשעו בעדינות את הגלולה ב-1.5 מ"ל של מאגר ליזה של תאים אדומים.
2. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 75-90 שניות. מרווים מיד עם 10 מ"ל של אמצעי גידול.
3. סובב תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שאפו את המדיה והשעו מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של מצע גידול לספירה (ראה שלב 4).
   הערה: כדור התא כבר לא צריך להיות אדום אלא לבן, מה שמעיד על ליזה מוצלחת של כדוריות דם אדומות. אם הגלולה עדיין אדומה, ניתן לבצע סיבוב נוסף של מאגר ליזה של תאים אדומים.

4. ציפוי BMSCs

1. כדי לספור תאים חיים לציפוי, הסר 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים והוסף ל-10 מיקרוליטר של תמיסת טריפאן בלו.
2. מניחים 10 מיקרוליטר של תערובת תמיסת תא: טריפן כחול על המוציטומטר וסופרים את התאים הקיימים (שאינם כחולים). רוב התאים צריכים לא לכלול טריפן כחול.
3. לבדיקות מושבה, צלחו את התאים בצפיפות של 60,000 תאים/ס"מ² לתוך צלוחיות תרבית רקמה T-25 ס"מ² . עבור תרביות BMSC בצפיפות גבוהה, תאי צלחת בצפיפות של 130,000 תאים/ס"מ² לתוך 100 מ"מ² צלחות תרבית רקמה. השתמש בנפח כולל של 5 מ"ל עבור T-25 ס"מ² צלוחיות ונפח כולל של 10 מ"ל עבור 100 ס"מ² כלים.
4. דגרו על התאים למשך 3 שעות ב-1%-2% (היפוקסיה) או 21% חמצן (נורמוקסיה) ו-5% CO₂. לתרבית שגרתית של BMSCs במתחי חמצן נמוכים, ניתן להשתמש בחממת תאים היפוקסיים או בתא היפוקסיה. הגדר כל מכשיר בהתאם להוראות היצרן כך שזרימת הגז של חנקן ופחמן דו חמצני תביא לטווח הרצוי של חמצן ו-CO₂.
5. לאחר 3 שעות, שטפו בזהירות את הצלחות 3x עם 1x PBS. כדי למנוע הפרעה לתאים שהחלו להיצמד, יש לשטוף בעדינות על ידי האטת השאיבה והפיפטינג על הצד של כלי תרבית הרקמה.
6. לאחר שטיפת ה-PBS הסופית 1x, החלף את ה-PBS ב-10 מ"ל של מצע גידול אם משתמשים ב-100 ס"מ² כלים או 5 מ"ל של מצע גידול אם משתמשים בצלוחיות T-25 ס"מ² . לאחר השטיפה יש להסיר את רוב התאים הצפים.

5. שמירה על BMSCs בתנאים היפוקסיים

1. עבור תרביות היפוקסיות, שמור על תאים בתא היפוקסיה או באינקובטור המוגדרים ל-1%-2% O₂ ו-5% CO₂. עבור תרביות נורמוקסיות, שמור על תאים ב-21% O₂ ו-5% CO_2. אם אתה משתמש בחממה היפוקסית, ודא שהדלתות נפתחות באופן מינימלי כדי למנוע זרמים של חמצן אטמוספרי (21%). החלף את המדיה כל 2-3 ימים.
2. לבדיקות מושבה, דגרו על התאים למשך 7-10 ימים, ולאחר מכן ספרו את המושבות או התחילו בהתמיינות או בבדיקות רצויות אחרות. בתנאים היפוקסיים ניתן לצפות בין 50-120 מושבות, ואילו בתנאים נורמוקסיים ניתן לצפות בין 5-30 מושבות.
3. עבור תרביות BMSC בצפיפות גבוהה, דגרו את התאים עד להתכנסות, כ-7-10 ימים לתרביות היפוקסיות וכ-14-21 ימים לתרביות נורמוקסיות. לאחר שהתלכד, נסה את התאים עם 0.25% טריפסין לשימוש במבחנים הרצויים.
4. כדי לדמיין את התאים, הנח את צלחת תרבית הרקמה על במה, סובב את מטרת הפאזה למסלול האופטי וודא שמחוון ניגודיות הפאזה נבחר עבור המטרה המתאימה. הצג את התאים בהגדלה של 100x או 200x.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

לאחר 7 ימים של בידוד תאים, תאים שגודלו ב-21% חמצן הם הטרוגניים מאוד. באופן ספציפי, יש שונות גדולה בגודל, כאשר תאים דו-קוטביים גדולים יותר נמצאים במרווחים עם תאים קטנים יותר שמכילים בליטות מרובות (איור 1A). לעומת זאת, תאים הגדלים בתנאים היפוקסיים הם הומוגניים מ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בהתבסס על התצפיות שלנו, BMSCs נצמדים לפלסטיק תרבית רקמות מוקדם יותר מאשר מקרופאגים ותאים אחרים ממקורות המופויאטיים¹¹. מסיבה זו, שטיפת צלחות 3 שעות לאחר הציפוי היא שלב קריטי מכיוון שהדבר מסיר תאים המטופויאטיים צפים שיש להם פוטנציאל להצמיד נקודות זמן מאוחרות יות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mm2 tissue culture dishes	Corning	353003
1x Phosphate Buffred Saline (PBS)	Gibco	100010-023
Bright-Line hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα, nucleosides	Gibco	12571-063
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
T-25cm2  tissue culture flasks	Corning	430168
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056