Nutzung einer niedrigen Sauerstoffspannung zur Reduzierung hämatopoetischer Zellen in stromalen Zellkulturen des murinen Knochenmarks

Zusammenfassung

Eine routinemäßige Kultivierung von Knochenmarkstromazellen (BMSCs) führt zur Isolierung heterogener Zellpopulationen, wobei viele Zellen hämatopoetischen Ursprungs sind. Hier beschreiben wir eine Methode, die eine niedrige Sauerstoffspannung nutzt, um hämatopoetische Verunreinigungen in murinen BMSC-Kulturen stark zu reduzieren.

Zusammenfassung

Derzeit fehlt es noch an allgemein akzeptierten Markern, um eine homogene Population von Skelettstammzellen (SSCs) prospektiv zu isolieren. Aus diesem Grund werden BMSCs, die die Hämatopoese unterstützen und zu allen Funktionen des Skeletts beitragen, weiterhin häufig verwendet, um multipotente mesenchymale Vorläuferzellen (MMPs) zu untersuchen und auf die SSC-Funktion zu schließen. Angesichts der Breite transgener Mausmodelle, die zur Untersuchung von Muskel-Skelett-Erkrankungen verwendet werden, dient die Verwendung von BMSCs auch als leistungsfähiges Instrument, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die MMPs und SSCs regulieren. Gängige Isolierungsverfahren für murine BMSCs führen jedoch dazu, dass über 50 % der gewonnenen Zellen hämatopoetischen Ursprungs sind, was die Interpretation der in diesen Studien gewonnenen Daten möglicherweise behindert. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur selektiven Eliminierung von CD45⁺ -Zellen in BMSC-Kulturen, bei der niedrige Sauerstoffspannung oder Hypoxie verwendet wird. Wichtig ist, dass diese Methode leicht implementiert werden kann, um nicht nur hämopoetische Kontaminanten zu reduzieren, sondern auch den Anteil von MMPs und putativen SSCs in BMSC-Kulturen zu erhöhen.

Einleitung

Ähnlich wie hämatopoetische Stammzellen (HSCs) sind SSCs in der Mikroumgebung des Knochens untergebracht. Im Gegensatz zu HSCs gibt es jedoch derzeit einen Mangel an allgemein akzeptierten Zelloberflächenmarkern, die zur prospektiven Identifizierung von SSCs^{verwendet werden können 1,2,3}. In-vitro-Kultursysteme und In-vivo-Rekonstitutionsassays zeigen jedoch, dass ein Teil der BMSCs in der Lage ist, die Hämatopoese zu unterstützen, sowie in der Fähigkeit, sich in alle Zellen der mesenchymalen Linien zu differenzieren ^4,5. Obwohl BMSC also eine sehr heterogene Population darstellen, weist ein Teil dieser Zellen Merkmale von Bona-fide-Stammzellen auf, die sich durch ihre Fähigkeit definieren, alle Zellen ihres Ursprungsgewebes selbst zu erneuern und zu rekonstituieren. Darüber hinaus können BMSCs im Gegensatz zur Verwendung von Zelloberflächenmarkern aufgrund ihrer schnellen Haftung an Gewebekulturkunststoffen schnell isoliert werden ^6,7. Aus diesen Gründen werden BMSCs häufig als Surrogat für SSCs⁵ verwendet.

Während die bevorzugte Adhärenz an Gewebekultur-Kunststoff (TC) verwendet wurde, um BMSCs erfolgreich aus menschlichem Gewebe zu isolieren, stellen Mausmodelle zusätzliche Herausforderungen für diese Methode dar. Da murine hämatopoetische Zellen in der Lage sind, sowohl an TC-Kunststoffen als auch an BMSCs zu haften, kommt es in diesem Modellsystem zu einer hohen hämatopoetischen Kontamination, was die Interpretation der mit dieser Isolationsmethode erzeugten Daten behindert⁶.

Bemerkenswert ist, dass sich BMSCs in der Mikroumgebung des Knochens befinden, wo die Sauerstoffspannungen zwischen 1 % und 4 % ^liegen8. Unter Standard-Gewebekulturbedingungen werden Zellkultur-Inkubatoren jedoch auf einem Luftsauerstoffgehalt von 21 % gehalten, was einem supraphysiologischen Niveau entspricht. Die funktionelle Bedeutung dieser Unterschiede wird dadurch unterstrichen, dass die Kultivierung von Zellen mesenchymalen Ursprungs mit 21 % Sauerstoff mit einem erhöhten Zelltod verbunden ist ^9,10. Darüber hinaus haben wir kürzlich gezeigt, dass hämatologische Zellen und mesenchymale Zellen unterschiedlich auf niedrige Sauerstoffspannungen reagieren. Insbesondere gibt es eine erhebliche Abnahme der Anzahl von CD45⁺ hämatopoetischen Zellen, wenn BMSCs-Kulturen bei niedrigen Sauerstoffspannungen gehalten werden. Tatsächlich stellten wir mit dieser Technik eine 90%ige Reduktion der hämatopoetischen CD45⁺-Zellen fest¹¹.

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das für Labore leicht implementiert werden kann, um die hämatopoetische Kontamination deutlich zu reduzieren und die Reinheit der mesenchymalen Zellen während der Routinekultur von BMSCs zu verbessern.

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Protokoll

Alle beschriebenen Methoden unter Verwendung von Mausmodellen wurden in Übereinstimmung mit den genehmigten Protokollen des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (A187-19-08) durchgeführt.

1. Dissektion von Knochen der Hintergliedmaßen

1. Euthanasieren Sie entweder 10-12 Wochen alte männliche oder weibliche C57BL/6-Mäuse durch CO₂ -Erstickung mit einer Flussrate von 2-4 L/min, gefolgt von der Bestätigung des Todes durch Enthauptung. In diesem Assay können entweder weibliche oder männliche Mäuse verwendet werden, ohne dass Unterschiede in den Ergebnissen zu erwarten sind. Sprühen Sie das Daunenfell mit 70% Ethanol ein.
2. Verwenden Sie eine sterile chirurgische Zange und Schere, um einen kleinen Schnitt in die Haut unter dem Brustbein zu machen. Reißen Sie mit den Händen die Haut um den Körperumfang herum auf und ziehen Sie die Haut dann distal zu den Hintergliedmaßen, um das darunter liegende Gewebe freizulegen.
3. Verwenden Sie eine sterilisierte chirurgische Zange und Schere, um die hintere Gliedmaße vorsichtig zu entfernen, indem Sie den Hüftkopf (Kugel) von der Hüftpfanne (Hüftpfanne) trennen. Kratzen Sie mit einer sterilen Pinzette und einem Skalpell vorsichtig an den Knochen entlang, um so viel Weichgewebe wie möglich zu entfernen.
4. Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um den Oberschenkelknochen und das Schienbein mit minimalem Widerstand zu trennen, um die Bänder (laterale und mediale Kollateralseite, vorderes und hinteres Kreuzband und Patellasehne), die die beiden Knochen verbinden, zu durchtrennen. Wichtig ist, dass nach der Trennung die Kondylen sowohl am distalen Femur als auch an der proximalen Tibia intakt bleiben.
5. Bei distalen Femuren machen Sie einen Schnitt zwischen dem Femurkopf und dem dritten Trochanter und einen Schnitt an der Epiphyse proximal der Wachstumsfuge, um die Schädigung der Wachstumsfuge zu minimieren.
6. Bei proximalen Tibiaen machen Sie einen Schnitt proximal des Malleolus lateralis und einen Schnitt distal des Tibiaplateaus gerade proximal zur Wachstumsfuge.
7. Legen Sie Femure und Tibien mit der Schnittseite nach unten in einzelne 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.

2. Isolierung von BMSCs aus Femuren und Tibien

1. Legen Sie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen in eine Tischzentrifuge und drehen Sie sie bei 10.000 x g bei 4 °C für 1 s.
2. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um vorsichtig Knochen aus den Mikrozentrifugenröhrchen zu entfernen, und lassen Sie einen roten Knochenmarkpfropfen am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zurück. Wenn noch etwas Mark im Knochenschaft verbleibt, übertrage den Knochen in ein neues Röhrchen, wiederhole das schnelle Schleudern und kombiniere die Pellets in einem Röhrchen während der Resuspension Schritt 2.3.
3. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um das Markpellet in 500 μl Wachstumsmedium sanft zu resuspendieren, MEMa, ergänzt mit 20 % fötalem Rinderserum und 1.000 U/ml Penicillin-Streptomycin. Übertragen Sie Knochenmarkstromazellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 4,5 mL Wachstumsmedium.

3. Lyse der roten Blutkörperchen

1. Die Zellen bei 300 x g bei 4 °C 5 min herunterschleudern. Aspirieren Sie das Wachstumsmedium und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 1,5 ml Erythrozyten-Lysepuffer.
2. Bei Raumtemperatur 75-90 s inkubieren. Sofort mit 10 mL Wachstumsmedium abschrecken.
3. Die Zellen bei 300 x g bei 4 °C 5 min herunterschleudern. Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL Wachstumsmedium zum Zählen (siehe Schritt 4).
   HINWEIS: Das Zellpellet sollte nicht mehr rot, sondern weiß sein, was auf eine erfolgreiche Lyse der roten Blutkörperchen hinweist. Wenn das Pellet noch rot ist, kann eine zusätzliche Runde Erythrozyten-Lysepuffer durchgeführt werden.

4. Beschichtung von BMSCs

1. Um lebende Zellen für die Beschichtung zu zählen, entfernen Sie 10 μl Zellsuspension und fügen Sie sie zu 10 μl Trypanblau-Lösung hinzu.
2. Geben Sie 10 μl Zell:Trypanblau-Lösungsgemisch auf ein Hämozytometer und zählen Sie die lebensfähigen (nicht blauen) Zellen. Die meisten Zellen sollten Trypanblau ausschließen.
3. Für Kolonie-Assays werden die Zellen mit einer Dichte von 60.000 Zellen/^cm2 in T-25 cm 2-Gewebekulturflaschen plattiert. Für BMSC-Kulturen mit hoher Dichte werden Zellen mit einer Dichte von 130.000 Zellen/^cm2 in 100 mm² Gewebekulturschalen gefüllt. Verwenden Sie ein Gesamtvolumen von 5 mL für T-25 cm² Kolben und ein Gesamtvolumen von 10 mL für 100 cm² Schalen.
4. Inkubieren Sie die Zellen 3 Stunden lang entweder mit 1 % bis 2 % (Hypoxie) oder 21 % Sauerstoff (Normoxie) und 5 % CO₂. Für die routinemäßige Kultivierung von BMSCs bei niedrigen Sauerstoffspannungen kann entweder ein hypoxischer Zellinkubator oder eine Hypoxiekammer verwendet werden. Stellen Sie jedes Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers so ein, dass der Gasfluss von Stickstoff und Kohlendioxid den gewünschten Bereich von Sauerstoff und CO₂ ergibt.
5. Spülen Sie die Platten nach 3x h vorsichtig 3x mit 1x PBS aus. Um eine Störung der Zellen zu vermeiden, die begonnen haben, sich anzuheften, spülen Sie vorsichtig aus, indem Sie das Aspirieren verlangsamen und an die Seite der Gewebekulturschalen pipettieren.
6. Ersetzen Sie nach der letzten 1x PBS-Spülung das PBS durch 10 ml Wachstumsmedium bei Verwendung von 100 cm² Schalen oder 5 ml Wachstumsmedium bei Verwendung von T-25 cm² Flaschen. Nach dem Spülen sollten die meisten schwimmenden Zellen entfernt werden.

5. Aufrechterhaltung von BMSCs unter hypoxischen Bedingungen

1. Bei hypoxischen Kulturen halten Sie die Zellen in einer Hypoxiekammer oder einem Inkubator, die auf 1 % bis 2 % O₂ und 5 % CO₂ eingestellt sind. Bei normoxischen Kulturen halten Sie die Zellen bei 21 %_O2 und 5 % CO_2. Wenn Sie einen hypoxischen Inkubator verwenden, achten Sie darauf, dass die Türen nur minimal geöffnet werden, um das Eindringen von Luftsauerstoff (21%) zu verhindern. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.
2. Für Kolonie-Assays inkubieren Sie die Zellen 7-10 Tage lang, danach zählen Sie entweder die Kolonien auf oder beginnen Sie mit der Differenzierung oder anderen gewünschten Assays. Unter hypoxischen Bedingungen kann mit 50-120 Völkern gerechnet werden, während unter normoxischen Bedingungen mit 5-30 Völkern gerechnet werden kann.
3. Bei BMSC-Kulturen mit hoher Dichte inkubieren Sie die Zellen bis zur Konfluentität, ca. 7-10 Tage für hypoxische Kulturen und ca. 14-21 Tage für normoxische Kulturen. Sobald die Zellen konfluiert sind, trypsinisieren Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin, um sie in den gewünschten Assays zu verwenden.
4. Um die Zellen zu visualisieren, stellen Sie die Gewebekulturschale auf einen Tisch, drehen Sie das Phasenobjektiv in den Strahlenweg und stellen Sie sicher, dass der Phasenkontrastschieberegler für das entsprechende Objektiv ausgewählt ist. Betrachten Sie die Zellen entweder mit 100-facher oder 200-facher Vergrößerung.

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Ergebnisse

Nach 7 Tagen Zellisolierung sind Zellen, die mit 21 % Sauerstoff kultiviert wurden, sehr heterogen. Insbesondere gibt es eine große Variation in der Größe, wobei größere bipolare Zellen mit kleineren Zellen mit mehreren Ausstülpungen abliegen (Abbildung 1A). Im Gegensatz dazu sind Zellen, die unter hypoxischen Bedingungen gezüchtet werden, sehr homogen. Die Zellen innerhalb der Kolonien sind relativ ähnlich groß und haben ein bipolares Aussehen, äh...

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Diskussion

Basierend auf unseren Beobachtungen haften BMSCs früher an Gewebekulturplastik als Makrophagen und andere Zellen hämopoetischen Ursprungs¹¹. Aus diesem Grund ist das Spülen der Platten 3 h nach der Beschichtung ein kritischer Schritt, da dadurch schwebende hämatopoetische Zellen entfernt werden, die das Potenzial haben, spätere Zeitpunkte anzuheften. Darüber hinaus sollten diese Spülungen mit Vorsicht durchgeführt werden, insbesondere durch Pipettieren von...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mm2 tissue culture dishes	Corning	353003
1x Phosphate Buffred Saline (PBS)	Gibco	100010-023
Bright-Line hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα, nucleosides	Gibco	12571-063
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
T-25cm2  tissue culture flasks	Corning	430168
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056