梳理自然杀伤细胞和伤害感受神经元之间的相互作用

摘要

伤害感受器神经元和NK细胞在炎症环境中积极相互作用。共同文化方法可以研究这种相互作用。

摘要

体感神经元已经进化到可以检测有害刺激并激活防御反射。通过共享通信方式，伤害感受器神经元还通过控制免疫系统的活动来调整宿主的防御。这些系统之间的通信大多是自适应的，有助于保护体内平衡，它也可以导致或促进慢性疾病的发作。这两个系统共同进化以允许这种局部相互作用，如在原发性和继发性淋巴组织和粘膜中发现的那样。最近的研究表明，伤害感受器直接检测和响应外来抗原、免疫细胞来源的细胞因子和微生物。

伤害感受器激活不仅会导致疼痛超敏反应和瘙痒，而且会降低伤害感受器的发射阈值，导致神经肽的局部释放。由伤害感受器的外周末端产生和释放的肽可以阻断淋巴细胞的趋化性和极化，控制炎症的定位、持续时间和类型。最近的证据表明，感觉神经元通过细胞间接触与先天免疫细胞相互作用，例如， 与 自然杀伤（NK）细胞上的2D组（NKG2D）受体接触。

鉴于NK细胞表达各种伤害感受器产生的介质的同源受体，可以想象伤害感受器使用神经肽来控制NK细胞的活性。在这里，我们设计了一种共培养方法来研究培养皿中的伤害感受器神经元-NK细胞相互作用。使用这种方法，我们发现腰椎伤害感受器神经元降低NK细胞因子表达。总体而言，这种还原论方法可能有助于研究肿瘤支配神经元如何控制NK细胞的抗癌功能以及NK细胞如何控制受损神经元的消除。

引言

感觉神经元的细胞体起源于背根神经节（DRG）。DRG位于周围神经系统（PNS）中，位于脊髓背角和周围神经末梢之间。DRG神经元的伪单极性质允许将信息从支配靶组织的外周分支传递到中枢分支，中央分支将体感信息传递到脊髓¹。使用专门的离子通道受体，一级神经元感知病原体、过敏原和污染物带来的威胁²，导致阳离子（Na⁺、Ca²⁺）的流入和动作电位³，^4，5 的产生。

这些神经元还将反潜动作电位发送到发生初始危险感知的外围，这导致神经肽1^，4的局部释放。因此，伤害感受器神经元作为一种保护机制，提醒宿主注意环境危险⁴，⁵，^6，7。

为了与二级神经元通信，伤害感受器释放各种神经递质（例如谷氨酸）和神经肽（例如降钙素基因相关肽（CGRP），P物质（SP）和血管活性肠肽（VIP））^6，7。这些肽作用于毛细血管，促进血浆外渗、水肿以及^{免疫细胞的}局部流入和调节2，^4，7。

体感和免疫系统利用由细胞因子和神经肽及其各自的同源受体组成的共享通信系统⁴。虽然这种双向通信有助于防止危险并保持体内平衡，但它也有助于疾病病理生理学⁴。

NK细胞被归类为先天淋巴细胞，专门用于消除病毒感染的细胞。NK细胞功能由刺激性和抑制性受体的平衡控制，包括激活受体NKG2D⁸。NKG2D的内源性配体，维甲酸早期诱导1（RAE1），由经历肿瘤发生^和感染等应激的细胞表达8^，9。

最近的研究表明，周围神经损伤驱动感觉神经元表达适应不良的分子，如stathmin 2（STMN2）和RAE1。因此， 通过 细胞间接触，表达NKG2D的NK细胞通过与表达RAE1的神经元相互作用而被激活。反过来，NK细胞能够消除通常与神经损伤相关的损伤伤害感受器神经元和钝性疼痛超敏反应¹⁰。除了NKG2D-RAE1轴外，NK细胞还表达各种伤害感受器产生的介质的同源受体。因此，这些介质有可能调节NK细胞活性。本文提出了一种共培养方法来研究伤害感受器神经元-NK细胞相互作用的生物学。这种方法将有助于促进对伤害感受神经元如何调节先天免疫细胞对损伤、感染或恶性肿瘤的反应的理解。

研究方案

蒙特利尔大学的机构动物护理和使用委员会（#22053，#22054）批准了所有动物程序。有关溶液及其组成的列表，请参阅表 1 ，有关本协议中使用的材料，设备和试剂的列表，请参阅 材料表 。

1. NK细胞分离、培养和刺激

1. 产生完整的伤害感受器神经元（同窝控制;TRPV1^wt::D TA^fl/wt）和消融（TRPV1^cre::D TA^fl/wt）小鼠通过将lox-stop-lox-白喉毒素小鼠（DTA fl^/fl）与TRPV1^cre/wt 小鼠杂交。
2. 使用 CO₂ 吸入，对幼稚同窝对照 （TRPV1^wt::D TA^fl/wt） 小鼠实施安乐死。
3. 将脾脏收集在含有 500 μL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的 1.5 mL 微量离心管中。
4. 用杵使脾脏均匀化。
5. 用 1 mL 无菌 PBS 稀释细胞。
6. 通过 50 μm 细胞过滤器将混合物过滤到 15 mL 锥形管中。
7. 用无菌 PBS 加满体积 （10 mL）。
8. 收集 10 μL 并使用血细胞计数器计数细胞。
9. 离心细胞（500× g，5分钟）并除去上清液。
10. 将细胞以 10⁸ 个细胞/mL 的浓度重悬于补充的 RPMI 1640 培养基中。
11. 按照制造商的说明，使用小鼠NK细胞分离试剂盒对脾脏NK细胞进行磁性纯化。使用流式细胞术确认NK细胞纯度¹¹。
12. 收集 10 μL 并使用血细胞计数器计数细胞。
13. 离心细胞（500× g，5分钟）并除去上清液。
14. 将NK细胞重悬于补充的RPMI 1640培养基（含有IL-2和IL-15）中。
15. 在96孔U底板中培养2×10^6NK 细胞/ mL48小时。

2. DRG神经元分离与培养

1. 在NK细胞刺激结束前24小时（步骤1.15），用100μL /孔层粘连蛋白（1ng / mL）涂覆96孔板并孵育45分钟（37°C）。
2. 孵育后，取出溶液，让孔在生物安全柜中风干。
3. 使用CO₂ 吸入，对伤害感受器神经元完整实施安乐死（同窝控制;TRPV1^wt::D TA^fl/wt）或消融（TRPV1^cre::D TA^fl/wt）小鼠。
   注意:吸入CO₂ 优于颈椎脱位，因为它可避免破坏连接到DRG的脊神经。
4. 将鼠标固定在板上的俯卧位置，抬起皮肤，并沿背柱切开皮肤。有关详细视频，请参阅Perner等人¹²。
5. 切断腰骶关节，用剪刀将骶骨与腰椎分开。
6. 通过在颅骨方向切割脊柱两侧的肌肉和肋骨来分离脊柱，直到到达颅底。
7. 用剪刀剪掉寰枕关节处的脊柱。
8. 从脊柱上去除肌肉和脂肪组织。
9. 固定并打开椎柱以去除脊髓并进入DRG。在椎间孔中寻找通过背根连接到脊髓但与脑膜分离的 DRG。
10. 将 DRG 收获到装有 10 mL 冰冷补充 DMEM 的 15 mL 锥形管中。
11. 离心制剂（200× g，5分钟，室温）并除去上清液。
12. 加入 250 μL 含有胶原酶 IV （1 mg/mL） 和分散酶 II （2.4 U/mL） 的 PBS。
13. 用胶原酶IV /分散酶II（C / D）溶液（80分钟，37°C，轻度搅拌）孵育DRG。当汇集来自几只小鼠的神经节时，保持每个神经节 125 μL C/D 溶液的比例。
14. 要灭活酶，请加入 5 mL 补充的 DMEM 培养基。
15. 离心溶液（200× g，5分钟），并使用移液管轻轻除去上清液。
16. 为避免不必要的细胞损失，留下~100μL上清液。
17. 加入 1 mL 补充的 DMEM 培养基。
18. 使用移液枪和三个尺寸递减的玻璃巴斯德移液器，将DRG轻轻研磨（每个巴斯德移液器尺寸~10上/下）到单细胞制剂中。
19. 在生物安全柜中，将牛血清白蛋白（BSA）在无菌PBS中稀释至终浓度为15%。将1mL等分试样储存在-20°C。
20. 通过添加 2 mL 无菌 PBS 并在管底部缓慢分配 1 mL 15% BSA 溶液，在 15 mL 锥形管中创建 BSA 梯度。通过轻轻取出移液器来避免破坏梯度。
21. 使用 P200 移液器，将研磨的神经节悬浮液（包含神经元）缓慢移液到管的一侧进入梯度。
22. 离心含有神经元的BSA梯度（200× g，12分钟，室温）。将离心机的加速和减速设置为最小速度。
    注意:离心后，神经元将位于管的底部，而细胞碎片将被困在BSA梯度中。
23. 使用移液管轻轻除去所有上清液。
24. 将细胞重悬于500μL神经基础中。
25. 板 10 每孔^{4 个} 神经元（200 μL 神经基础/孔）在层粘连蛋白包被的平底 96 孔板中。
    注意:平均而言，研究者每只小鼠将能够填充~8个孔。
26. 培养神经元（37°C，过夜）以允许附着。

3. 共培养和流式细胞术

1. 从神经元培养物中缓慢去除神经基底。
2. 用IL-2和IL-15刺激48小时后（参见步骤1.14-1.15），重悬NK细胞并向神经元培养物（96孔平底板）中加入10个⁵ 个NK细胞/孔。
   注意:平均而言，研究者将能够为每只小鼠填充~6个孔。
3. 在补充的神经基础MX（37°C，48小时）中共培养细胞。
4. 收集细胞，用PBS（3x）洗涤，离心（500× g，5分钟，4°C）。
5. 弃去上清液并用活力染料eFlour-780（1:1，000，15分钟，4°C）染色细胞。
6. 收集细胞，用PBS（3x）洗涤，并离心（500× g，5分钟，4°C）。
7. 用CD16 / 32（1:100，15分钟，4°C）阻断细胞上的非特异性位点。
8. 收集细胞，用PBS（3x）洗涤并离心（500× g，5分钟，4°C）。
9. 用BV421抗NK-1.1（1:100），异硫氰酸荧光素（FITC）抗NKp46（1:100）和藻红蛋白（PE）抗GM-CSF（1:100）染色（15分钟，4°C）细胞。
10. 收集细胞，用PBS（3x）洗涤，离心（500× g，5分钟，4°C）。
11. 弃去上清液，将细胞重悬于FACS缓冲液（500μL）中，并通过流式细胞术对NK细胞进行免疫表型分析¹¹。有关门控策略，请参见 图1A 。

结果

从同窝对照（TRPV1^wt::D TA^{fl / wt}）小鼠脾细胞中磁纯化NK细胞，并用IL-2和IL-15刺激（48小时）。然后将NK细胞单独培养或与从伤害感受器神经元中收获的DRG神经元共培养（同窝对照;TRPV1^wt::D TA^fl/wt）或消融（TRPV1^cre::D TA^fl/wt）小鼠。然后将细胞暴露于TRPV1激动剂辣椒素（1μM）或其载体中。共培养24小时后，对NK细胞进行FACS纯化，并使用流式细胞术对其活化?...

讨论

Davies等人¹¹ 发现受伤的神经元上调RAE1。 通过 细胞间接触，表达NKG2D的NK细胞能够识别和消除RAE1⁺ 神经元，这反过来又限制了慢性疼痛¹¹。鉴于NK细胞也表达各种神经肽受体，并且这些神经肽以其免疫调节能力而闻名，因此在 体外研究NK细胞与伤害感受器神经元之间的相互作用似乎越来越重要。在这里，我们设计了一个简单的共培养方案，允...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse CD16/32	Jackson Laboratory	Cat no: 017769
B-27	Jackson Laboratory	Cat no: 009669
Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade	World Precision Instruments	Cat no: 504167
BV421 anti-mouse NK-1.1	Fisher Scientific	Cat no: 12430112
Cell strainer (50 μm)	Fisher Scientific	Cat no: A3160702
Collagenase IV	Fisher Scientific	Cat no: 15140148
Diphteria toxinfl/fl	Fisher Scientific	Cat no: SH3057402
Dispase II	Fisher Scientific	Cat no: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	Cat no: 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit	Sigma	Cat no: CLS2595
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	Cat no: C0130
FACSAria III	Sigma	Cat no: 04942078001
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	Cat no: 806552
FITC anti-mouse NKp46	Sigma	Cat no: L2020
Flat bottom 96-well plate	Sigma	Cat no: 03690
Glass Pasteur pipette	Sigma	Cat no: 470236-274
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)	VWR	Cat no: 02-0131
Laminin	Cedarlane	Cat no: 03-50/31
L-Glutamine	Gibco	Cat no: A14867-01
Mouse recombinant IL-15	Gibco	Cat no: 22400-089
Mouse recombinant IL-2	Gibco	Cat no: 21103-049
Nerve Growth Factor (NGF)	Life Technologies	Cat no: 13257-019
Neurobasal media	PeproTech	Cat no: 450-51-10
PE anti-mouse GM-CSF	PeproTech	Cat no: 212-12
Penicillin and Streptomycin	PeproTech	Cat no: 210-15
Pestles	Stem Cell Technology	Cat no: 19855
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biolegend	Cat no: 108732	Clone PK136
RPMI 1640 media	Biolegend	Cat no: 137606	Clone 29A1.4
TRPV1Cre	Biolegend	Cat no: 505406	Clone MP1-22E9
Tweezers and dissection tools.	Biolegend	Cat no: 65-0865-14
U-Shaped-bottom 96-well plate	Biolegend	Cat no: 101319
Viability Dye eFlour-780	Becton Dickinson