Provocando a interação entre células assassinas naturais e neurônios nociceptores

Resumo

Os neurônios nociceptores e as células NK interagem ativamente em um contexto inflamatório. Uma abordagem de co-cultura permite estudar essa interação.

Resumo

Os neurônios somatossensoriais evoluíram para detectar estímulos nocivos e ativar reflexos defensivos. Ao compartilhar meios de comunicação, os neurônios nociceptores também ajustam as defesas do hospedeiro, controlando a atividade do sistema imunológico. A comunicação entre esses sistemas é principalmente adaptativa, ajudando a proteger a homeostase, também pode levar a, ou promover, o aparecimento de doenças crônicas. Ambos os sistemas co-evoluíram para permitir essa interação local, como encontrado nos tecidos linfoides primários e secundários e na mucosa. Estudos recentes demonstraram que os nociceptores detectam e respondem diretamente a antígenos estranhos, citocinas derivadas de células imunes e micróbios.

A ativação do nociceptor não só resulta em hipersensibilidade à dor e coceira, mas reduz o limiar de disparo do nociceptor, levando à liberação local de neuropeptídeos. Os peptídeos que são produzidos e liberados a partir dos terminais periféricos dos nociceptores podem bloquear a quimiotaxia e a polarização dos linfócitos, controlando a localização, a duração e o tipo de inflamação. Evidências recentes mostram que os neurônios sensoriais interagem com células imunes inatas através do contato célula-célula, por exemplo, envolvendo receptores de grupo 2D (NKG2D) em células natural killer (NK).

Dado que as células NK expressam os receptores cognatos para vários mediadores produzidos por nociceptores, é concebível que os nociceptores usem neuropeptídeos para controlar a atividade das células NK. Aqui, elaboramos um método de co-cultura para estudar as interações entre o neurônio nociceptor e as células NK em um prato. Usando essa abordagem, descobrimos que os neurônios nociceptores lombares diminuem a expressão de citocinas de células NK. No geral, esse método reducionista poderia ser útil para estudar como os neurônios inervantes de tumores controlam a função anticancerígena das células NK e como as células NK controlam a eliminação de neurônios lesionados.

Introdução

Os corpos celulares dos neurônios sensoriais se originam nos gânglios da raiz dorsal (DRG). Os DRG estão localizados no sistema nervoso periférico (SNP), entre o corno dorsal da medula espinhal e os terminais nervosos periféricos. A natureza pseudo-unipolar dos neurônios DRG permite a transferência de informações do ramo periférico, que inerva o tecido alvo, para o ramo central, que transporta a informação somatossensorial para a medula espinhal¹. Usando receptores de canais iônicos especializados, os neurônios de primeira ordem detectam ameaças representadas por patógenos, alérgenos e poluentes², levando ao influxo de cátions (Na+, Ca²⁺) e à geração de um potencial de ação 3,4,5.

Esses neurônios também enviam potencial de ação antidrômica para a periferia, onde ocorreu a detecção inicial de perigo, o que leva à liberação local de neuropeptídeos ^1,4. Portanto, os neurônios nociceptores servem como mecanismo de proteção, alertando o hospedeiro para o perigo ambiental 4,5,6,7.

Para se comunicar com neurônios de segunda ordem, os nociceptores liberam vários neurotransmissores (por exemplo, glutamato) e neuropeptídeos (por exemplo, peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), substância P (SP) e peptídeo intestinal vasoativo (VIP))^)6,7. Esses peptídeos atuam sobre os capilares e promovem extravasamento plasmático, edema e influxo e modulação locais de células imunes ^2,4,7.

Os sistemas somatossensorial e imunológico utilizam um sistema de comunicação compartilhado composto por citocinas e neuropeptídeos, e seus respectivos receptores cognatos⁴. Embora essa comunicação bidirecional ajude a proteger do perigo e preservar a homeostase, também pode contribuir para a fisiopatologia da doença⁴.

As células NK são classificadas como células linfoides inatas e são especializadas para eliminar células infectadas por vírus. A função das células NK é governada por um equilíbrio de receptores estimulatórios e inibitórios, incluindo o receptor ativador NKG2D⁸. O ligante endógeno do NKG2D, ácido retinóico induzível precoce1 (RAE1), é expresso por células submetidas a estresse, como tumorigênese e infecção ^8,9.

Investigações recentes mostraram que a lesão do nervo periférico leva os neurônios sensoriais a expressar moléculas desadaptativas, como a estatina 2 (STMN2) e a RAE1. Assim, através do contato célula-célula, as células NK que expressam NKG2D foram ativadas pela interação com neurônios que expressam RAE1. Por sua vez, as células NK foram capazes de eliminar neurônios nociceptores lesados e hipersensibilidade à dor contusa normalmente associada à lesão nervosa¹⁰. Além do eixo NKG2D-RAE1, as células NK expressam os receptores cognatos para vários mediadores produzidos por nociceptores. Portanto, é possível que esses mediadores modulem a atividade das células NK. Este trabalho apresenta um método de co-cultura para investigar a biologia da interação nociceptor neurônio-célula NK. Essa abordagem ajudará a avançar a compreensão de como os neurônios nociceptores modulam as respostas inatas das células imunes a lesões, infecções ou malignidades.

Protocolo

Os Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Université de Montréal (#22053, #22054) aprovaram todos os procedimentos para animais. Consulte a Tabela 1 para uma lista de soluções e sua composição e a Tabela de Materiais para uma lista de materiais, equipamentos e reagentes usados neste protocolo.

1. Isolamento, cultura e estimulação de células NK

1. Gerar neurônio nociceptor intacto (controle de companheiro de ninhada; TRPV1^wt::D TA fl/wt) e camundongos ablados (TRPV1 cre::D TA fl/wt) cruzando camundongos com toxina lox-stop-lox-diphtheria (DTA fl/^fl) com camundongos TRPV1^cre/wt.
2. Usando a inalação de CO₂, eutanasie um rato ingênuo de controle de companheiro de ninhada (TRPV1 wt::D TA^fl/wt).
3. Recolher o baço num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 500 μL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).
4. Homogeneize o baço usando um pilão.
5. Diluir as células com 1 mL de PBS estéril.
6. Filtrar a mistura através de um filtro de células de 50 μm para um tubo cónico de 15 ml.
7. Aumente o volume (10 mL) com PBS estéril.
8. Colete 10 μL e conte as células usando um hemocitômetro.
9. Centrifugar as células (500 × g, 5 min) e remover o sobrenadante.
10. Ressuspender as células a uma concentração de 10⁸ células/ml em meio RPMI 1640 suplementado.
11. Siga as instruções do fabricante para purificar magneticamente as células NK do baço usando um kit de isolamento de células NK de camundongo. Confirmar a pureza das células NK usando citometria de fluxo¹¹.
12. Colete 10 μL e conte as células usando um hemocitômetro.
13. Centrifugar as células (500 × g, 5 min) e remover o sobrenadante.
14. Ressuspender as células NK em meio de cultura RPMI 1640 suplementado (contendo IL-2 e IL-15).
15. Cultura 2 × 10⁶ células NK/mL em uma placa de fundo U de 96 poços por 48 h.

2. Isolamento e cultura de neurônios DRG

1. Às 24 h antes do final da estimulação com células NK (etapa 1.15), revestir uma placa de 96 poços com 100 μL/poço de laminina (1 ng/mL) e incubar por 45 min (37 °C).
2. Após a incubação, remova a solução e deixe os poços secarem ao ar em um armário de biossegurança.
3. Usando a inalação de CO₂, eutanasiar o neurônio nociceptor intacto (controle do companheiro de ninhada; TRPV1^wt: :D TA fl/wt) ou ratos ablados (TRPV1^cre::D TA^fl/wt).
   NOTA: A inalação de CO₂ é preferível à luxação cervical, pois evita interromper os nervos espinhais conectados ao DRG.
4. Prenda o rato na prancha em posição prona, levante a pele e incite a pele ao longo da coluna dorsal. Consulte Perner et al. para um vídeo detalhado¹².
5. Corte a articulação lombossacra e separe o sacro da coluna lombar com uma tesoura.
6. Separe a coluna cortando os músculos e costelas em ambos os lados da coluna vertebral na direção craniana até que a base do crânio seja atingida.
7. Usando uma tesoura, corte a coluna vertebral na articulação atlanto-occipital.
8. Remova o músculo e o tecido adiposo da coluna vertebral.
9. Prenda e abra a coluna vertebral para remover a medula espinhal e obter acesso ao DRG. Procure o DRG nos forames intervertebrais conectados à medula espinhal através da raiz dorsal, mas separados das meninges.
10. Colha os DRGs em um tubo cônico de 15 mL preenchido com 10 mL de DMEM suplementado gelado.
11. Centrifugar a preparação (200 × g, 5 min, temperatura ambiente) e remover o sobrenadante.
12. Adicionar 250 μL de PBS contendo colagenase IV (1 mg/mL) e Dispase II (2,4 U/mL).
13. Incubar o DRG com solução de colagenase IV/Dispase II (C/D) (80 min, 37 °C, agitação ligeira). Ao agrupar gânglios de vários camundongos, mantenha uma proporção de 125 μL de solução C/D por gânglio.
14. Para inativar as enzimas, adicione 5 mL de meio DMEM suplementado.
15. Centrifugar a solução (200 × g, 5 min) e remover suavemente o sobrenadante utilizando uma pipeta.
16. Para evitar a perda de células indesejadas, deixe ~ 100 μL do sobrenadante.
17. Adicione 1 mL de meio DMEM suplementado.
18. Usando uma pistola de pipeta e três pipetas Pasteur de vidro de tamanhos decrescentes, triturate suavemente (~ 10 para cima / para baixo por tamanho de pipeta Pasteur) o DRG em uma preparação de célula única.
19. Em um gabinete de biossegurança, diluir a albumina sérica bovina (BSA) em PBS estéril até uma concentração final de 15%. Armazenar alíquotas de 1 ml a -20 °C.
20. Crie um gradiente de BSA em um tubo cônico de 15 mL adicionando 2 mL de PBS estéril e dispensando lentamente 1 mL de solução de BSA a 15% na parte inferior do tubo. Evite interromper o gradiente removendo suavemente a pipeta.
21. Usando uma pipeta P200, pipete lentamente a suspensão triturada dos gânglios (que contém os neurônios) para o lado do tubo no gradiente.
22. Centrifugar o gradiente de BSA contendo neurônios (200 × g, 12 min, temperatura ambiente). Ajuste a aceleração e a desaceleração da centrífuga para a velocidade mínima.
    NOTA: Após a centrifugação, os neurônios estarão na parte inferior do tubo, enquanto os detritos celulares ficarão presos no gradiente BSA.
23. Remova suavemente todo o sobrenadante usando uma pipeta.
24. Ressuspender as células em 500 μL de Neurobasal.
25. Placa 10⁴ neurônios por poço (200 μL de neurobasal/poço) em uma placa de 96 poços revestida de laminina e fundo plano.
    NOTA: Em média, um investigador será capaz de preencher ~ 8 poços por mouse.
26. Cultura dos neurônios (37 °C, durante a noite) para permitir a fixação.

3. Co-cultura e citometria de fluxo

1. Remova lentamente o neurobasal da cultura de neurônios.
2. Após 48 h de estimulação com IL-2 e IL-15 (ver passos 1.14-1.15), ressussuscite as células NK e adicione 10⁵ células NK/poço à cultura de neurónios (placa inferior plana de 96 poços).
   NOTA: Em média, o investigador será capaz de preencher ~ 6 poços por mouse.
3. Co-cultura das células em MX neurobasal suplementado (37 °C, 48 h).
4. Recolher as células, lavar com PBS (3x) e centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
5. Descarte o sobrenadante e manche as células com o Corante de Viabilidade eFlour-780 (1:1.000, 15 min, 4 °C).
6. Recolher as células, lavar com PBS (3x) e centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
7. Bloquear locais inespecíficos nas células com CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).
8. Recolher as células, lavar com PBS (3x) e centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
9. Coloração (15 min, 4 °C) das células com BV421 anti-NK-1.1 (1:100), isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-NKp46 (1:100) e ficoeritrina (PE) anti-GM-CSF (1:100).
10. Recolher as células, lavar com PBS (3x) e centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
11. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em tampão FACS (500 μL) e imunofenótipo as células NK por citometria de fluxo¹¹. Consulte a Figura 1A para ver a estratégia de bloqueio.

Resultados

As células NK foram purificadas magneticamente a partir de esplenócitos de camundongos controle de ninhada (TRPV1 wt::D TA^fl/wt) e estimuladas (48 h) com IL-2 e IL-15. As células NK foram então cultivadas isoladamente ou co-cultivadas com neurônios DRG colhidos do neurônio nociceptor intacto (controle littermate; TRPV1^wt: :D TA fl/wt) ou ratos ablados (TRPV1^cre::D TA^fl/wt). As células foram então expostas ao agonista TRPV1 capsaicina (1 μM) ou seu...

Discussão

Davies et ^al.11 encontraram que os neurônios lesados regulam positivamente a RAE1. Através do contato célula-célula, as células NK que expressam NKG2D foram então capazes de identificar e eliminar neurônios RAE1⁺ , que por sua vez limitam a dor crônica¹¹. Dado que as células NK também expressam vários receptores neuropeptídicos, e que esses neuropeptídeos são conhecidos por suas capacidades imunomoduladoras, parece cada vez mais importante ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse CD16/32	Jackson Laboratory	Cat no: 017769
B-27	Jackson Laboratory	Cat no: 009669
Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade	World Precision Instruments	Cat no: 504167
BV421 anti-mouse NK-1.1	Fisher Scientific	Cat no: 12430112
Cell strainer (50 μm)	Fisher Scientific	Cat no: A3160702
Collagenase IV	Fisher Scientific	Cat no: 15140148
Diphteria toxinfl/fl	Fisher Scientific	Cat no: SH3057402
Dispase II	Fisher Scientific	Cat no: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	Cat no: 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit	Sigma	Cat no: CLS2595
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	Cat no: C0130
FACSAria III	Sigma	Cat no: 04942078001
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	Cat no: 806552
FITC anti-mouse NKp46	Sigma	Cat no: L2020
Flat bottom 96-well plate	Sigma	Cat no: 03690
Glass Pasteur pipette	Sigma	Cat no: 470236-274
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)	VWR	Cat no: 02-0131
Laminin	Cedarlane	Cat no: 03-50/31
L-Glutamine	Gibco	Cat no: A14867-01
Mouse recombinant IL-15	Gibco	Cat no: 22400-089
Mouse recombinant IL-2	Gibco	Cat no: 21103-049
Nerve Growth Factor (NGF)	Life Technologies	Cat no: 13257-019
Neurobasal media	PeproTech	Cat no: 450-51-10
PE anti-mouse GM-CSF	PeproTech	Cat no: 212-12
Penicillin and Streptomycin	PeproTech	Cat no: 210-15
Pestles	Stem Cell Technology	Cat no: 19855
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biolegend	Cat no: 108732	Clone PK136
RPMI 1640 media	Biolegend	Cat no: 137606	Clone 29A1.4
TRPV1Cre	Biolegend	Cat no: 505406	Clone MP1-22E9
Tweezers and dissection tools.	Biolegend	Cat no: 65-0865-14
U-Shaped-bottom 96-well plate	Biolegend	Cat no: 101319
Viability Dye eFlour-780	Becton Dickinson