Descubrir la interacción entre las células asesinas naturales y las neuronas nociceptoras

Resumen

Las neuronas nociceptoras y las células NK interactúan activamente en un contexto inflamatorio. Un enfoque de co-cultura permite estudiar esta interacción.

Resumen

Las neuronas somatosensoriales han evolucionado para detectar estímulos nocivos y activar reflejos defensivos. Al compartir medios de comunicación, las neuronas nociceptoras también sintonizan las defensas del huésped al controlar la actividad del sistema inmunológico. La comunicación entre estos sistemas es principalmente adaptativa, ayudando a proteger la homeostasis, también puede conducir a, o promover, la aparición de enfermedades crónicas. Ambos sistemas coevolucionaron para permitir dicha interacción local, como se encuentra en los tejidos linfoides primarios y secundarios y la mucosa. Estudios recientes han demostrado que los nociceptores detectan y responden directamente a antígenos extraños, citoquinas derivadas de células inmunes y microbios.

La activación de los nociceptores no solo produce hipersensibilidad al dolor y picazón, sino que también reduce el umbral de disparo del nociceptor, lo que lleva a la liberación local de neuropéptidos. Los péptidos que son producidos por, y liberados de, los terminales periféricos de los nociceptores pueden bloquear la quimiotaxis y la polarización de los linfocitos, controlando la localización, la duración y el tipo de inflamación. La evidencia reciente muestra que las neuronas sensoriales interactúan con las células inmunes innatas a través del contacto célula-célula, por ejemplo, involucrando receptores del grupo 2D (NKG2D) en células asesinas naturales (NK).

Dado que las células NK expresan los receptores afines para varios mediadores producidos por nociceptores, es concebible que los nociceptores utilicen neuropéptidos para controlar la actividad de las células NK. Aquí, ideamos un método de cocultivo para estudiar las interacciones neuronal-célula NK nociceptor en un plato. Usando este enfoque, encontramos que las neuronas nociceptoras lumbares disminuyen la expresión de citoquinas de las células NK. En general, tal método reduccionista podría ser útil para estudiar cómo las neuronas inervantes de tumores controlan la función anticancerígena de las células NK y cómo las células NK controlan la eliminación de las neuronas lesionadas.

Introducción

Los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales se originan en los ganglios de la raíz dorsal (DRG). Los DRG se encuentran en el sistema nervioso periférico (SNP), entre el asta dorsal de la médula espinal y las terminales nerviosas periféricas. La naturaleza pseudo-unipolar de las neuronas DRG permite la transferencia de información de la rama periférica, que inerva el tejido diana, a la rama central, que lleva la información somatosensorial a la médula espinal¹. Utilizando receptores de canales iónicos especializados, las neuronas de primer orden detectan las amenazas planteadas por patógenos, alérgenos y contaminantes², lo que lleva a la afluencia de cationes (Na+,^Ca2+) y a la generación de un potencial de acción 3,4,5.

Estas neuronas también envían potencial de acción antidrómica hacia la periferia, donde se había producido la detección inicial del peligro, lo que conduce a la liberación local de neuropéptidos ^1,4. Por lo tanto, las neuronas nociceptoras sirven como un mecanismo de protección, alertando al huésped sobre el peligro ambiental 4,5,6,7.

Para comunicarse con las neuronas de segundo orden, los nociceptores liberan varios neurotransmisores (por ejemplo, glutamato) y neuropéptidos (por ejemplo, péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), sustancia P (SP) y péptido intestinal vasoactivo (VIP)^)6,7. Estos péptidos actúan sobre los capilares y promueven la extravasación plasmática, el edema y la afluencia local y la modulación de las células inmunes ^2,4,7.

Los sistemas somatosensorial e inmune utilizan un sistema de comunicación compartido compuesto de citoquinas y neuropéptidos, y sus respectivos receptores afines⁴. Si bien esta comunicación bidireccional ayuda a proteger del peligro y preservar la homeostasis, también puede contribuir a la fisiopatología de la enfermedad⁴.

Las células NK se clasifican como células linfoides innatas y están especializadas para eliminar las células infectadas por virus. La función de las células NK está gobernada por un equilibrio de receptores estimulantes e inhibitorios, incluido el receptor activador NKG2D⁸. El ligando endógeno de NKG2D, ácido retinoico inducible temprano1 (RAE1), es expresado por células sometidas a estrés como tumorigénesis e infección ^8,9.

Investigaciones recientes han demostrado que la lesión de los nervios periféricos impulsa a las neuronas sensoriales a expresar moléculas desadaptativas como la estatina 2 (STMN2) y la RAE1. Por lo tanto, a través del contacto célula-célula, las células NK que expresan NKG2D se activaron mediante la interacción con las neuronas que expresan RAE1. A su vez, las células NK fueron capaces de eliminar las neuronas nociceptoras lesionadas y la hipersensibilidad al dolor contundente normalmente asociada con la lesión nerviosa¹⁰. Además del eje NKG2D-RAE1, las células NK expresan los receptores afines para varios mediadores producidos por nociceptores. Por lo tanto, es posible que estos mediadores modulen la actividad de las células NK. Este artículo presenta un método de cocultivo para investigar la biología de la interacción neurona-célula NK nociceptora. Este enfoque ayudará a avanzar en la comprensión de cómo las neuronas nociceptoras modulan las respuestas inmunitarias innatas de las células a lesiones, infecciones o neoplasias malignas.

Protocolo

Los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Montreal (#22053, #22054) aprobaron todos los procedimientos con animales. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de soluciones y su composición y la Tabla de materiales para obtener una lista de materiales , equipos y reactivos utilizados en este protocolo.

1. Aislamiento, cultivo y estimulación de células NK

1. Generar neurona nociceptora intacta (control de camada; Ratones TRPV1 wt::D TA fl/wt) y ablacionados (TRPV1 cre::D TA fl/wt) cruzando ratones con toxina lox-stop-lox-diftérica (DTA fl/^fl) con ratones TRPV1 ^cre/wt.
2. Usando la inhalación de_CO2, eutanasia a un ratón de control de compañero de camada ingenuo (TRPV1 wt: :D TA^{fl / wt}).
3. Recoger el bazo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 500 μL de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS).
4. Homogeneizar el bazo con un mortero.
5. Diluir las células con 1 ml de PBS estéril.
6. Filtrar la mezcla a través de un filtro celular de 50 μm en un tubo cónico de 15 ml.
7. Rellene el volumen (10 ml) con PBS estéril.
8. Recoja 10 μL y cuente las células con un hemocitómetro.
9. Centrifugar las células (500 × g, 5 min) y retirar el sobrenadante.
10. Resuspender las células a una concentración de 10⁸ células/ml en medio suplementado RPMI 1640.
11. Siga las instrucciones del fabricante para purificar magnéticamente las células NK del bazo utilizando un kit de aislamiento de células NK de ratón. Confirmar la pureza de las células NK mediante citometría de flujo¹¹.
12. Recoja 10 μL y cuente las células con un hemocitómetro.
13. Centrifugar las células (500 × g, 5 min) y retirar el sobrenadante.
14. Resuspender las células NK en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado (que contiene IL-2 e IL-15).
15. Cultivo 2 × 10⁶ células NK/ml en una placa de fondo en U de 96 pocillos durante 48 h.

2. Aislamiento y cultivo de neuronas DRG

1. A las 24 h anteriores al final de la estimulación de células NK (paso 1.15), cubrir una placa de 96 pocillos con 100 μL/pocillo de laminina (1 ng/ml) e incubar durante 45 min (37 °C).
2. Después de la incubación, retire la solución y deje que los pocillos se sequen al aire en un gabinete de bioseguridad.
3. Usando la inhalación de_CO2, eutanasia la neurona nociceptora intacta (control de compañero de camada; TRPV1^wt::D TA fl/wt) o ratones ablacionados (TRPV1^cre::D TA^fl/wt).
   NOTA: La inhalación de_CO2 es preferible a la dislocación cervical, ya que evita alterar los nervios espinales conectados a la DRG.
4. Asegure el mouse en la tabla en posición prona, levante la piel e incise la piel a lo largo de la columna dorsal. Consulte Perner et al. para un video detallado¹².
5. Cortar la articulación lumbosacra y separar el sacro de la columna lumbar con tijeras.
6. Separe la columna vertebral cortando los músculos y las costillas a ambos lados de la columna vertebral en la dirección craneal hasta que se alcance la base del cráneo.
7. Usando tijeras, corte la columna vertebral en la articulación atlanto-occipital.
8. Eliminar el músculo y el tejido graso de la columna vertebral.
9. Fije y abra la columna vertebral para extirpar la médula espinal y obtener acceso al DRG. Busque el DRG en los agujeros intervertebrales conectados a la médula espinal a través de la raíz dorsal pero separados de las meninges.
10. Coseche los DRG en un tubo cónico de 15 ml lleno de 10 ml de DMEM suplementado con hielo frío.
11. Centrifugar la preparación (200 × g, 5 min, temperatura ambiente) y retirar el sobrenadante.
12. Añadir 250 μL de PBS que contiene colagenasa IV (1 mg/ml) y dispasa II (2,4 U/ml).
13. Incubar el DRG con solución de colagenasa IV/Dispasa II (C/D) (80 min, 37 °C, agitación leve). Al agrupar ganglios de varios ratones, mantener una proporción de 125 μL de solución C / D por ganglio.
14. Para inactivar las enzimas, agregue 5 ml de medio DMEM suplementado.
15. Centrifugar la solución (200 × g, 5 min) y retirar suavemente el sobrenadante con una pipeta.
16. Para evitar la pérdida celular no deseada, deje ~ 100 μL del sobrenadante.
17. Agregue 1 ml de medio DMEM suplementado.
18. Con una pistola de pipeta y tres pipetas Pasteur de vidrio de tamaños decrecientes, triture suavemente (~10 arriba/abajo por tamaño de pipeta Pasteur) el DRG en una preparación de una sola celda.
19. En un gabinete de bioseguridad, diluir la albúmina sérica bovina (BSA) en PBS estéril hasta una concentración final del 15%. Conservar 1 ml de alícuotas a −20 °C.
20. Cree un gradiente de BSA en un tubo cónico de 15 ml agregando 2 ml de PBS estéril y dispensando lentamente 1 ml de solución de BSA al 15% en la parte inferior del tubo. Evite interrumpir el gradiente retirando suavemente la pipeta.
21. Con una pipeta P200, pipetea lentamente la suspensión de ganglios triturados (que contiene las neuronas) hacia el lado del tubo en el gradiente.
22. Centrifugar el gradiente BSA que contiene neuronas (200 × g, 12 min, temperatura ambiente). Ajuste la aceleración y desaceleración de la centrífuga a la velocidad mínima.
    NOTA: Después de la centrifugación, las neuronas estarán en la parte inferior del tubo, mientras que los restos celulares quedarán atrapados en el gradiente BSA.
23. Retire suavemente todo el sobrenadante con una pipeta.
24. Resuspender las células en 500 μL de Neurobasal.
25. Placa 10⁴ neuronas por pocillo (200 μL de neurobasal/pocillo) en una placa de 96 pocillos de fondo plano recubierta de laminina.
    NOTA: En promedio, un investigador podrá llenar ~ 8 pocillos por ratón.
26. Cultivar las neuronas (37 °C, durante la noche) para permitir la unión.

3. Cocultivo y citometría de flujo

1. Retire lentamente el neurobasal del cultivo neuronal.
2. Después de 48 h de estimulación con IL-2 e IL-15 (ver pasos 1.14-1.15), resuspender las células NK y añadir 10⁵ células NK/pocillo al cultivo neuronal (placa inferior plana de 96 pocillos).
   NOTA: En promedio, el investigador podrá llenar ~ 6 pocillos por ratón.
3. Cocultivo de las células en MX neurobasal suplementado (37 °C, 48 h).
4. Recoger las celdas, lavar con PBS (3x) y centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
5. Desechar el sobrenadante y teñir las células con Viability Dye eFlour-780 (1:1.000, 15 min, 4 °C).
6. Recoger las células, lavar con PBS (3x) y centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
7. Bloquear sitios inespecíficos en las células con CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).
8. Recoger las células, lavar con PBS (3x) y centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
9. Tinción (15 min, 4 °C) de las células con BV421 anti-NK-1.1 (1:100), isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-NKp46 (1:100) y ficoeritrina (PE) anti-GM-CSF (1:100).
10. Recoger las células, lavar con PBS (3x) y centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
11. Desechar el sobrenadante, resuspender las células en tampón FACS (500 μL) e inmunofenotipar las células NK mediante citometría de flujo¹¹. Consulte la Figura 1A para conocer la estrategia de acceso.

Resultados

Las células NK se purificaron magnéticamente a partir de esplenocitos de ratones de control de camada (TRPV1 wt: :D TA^{fl / wt}) y estimulados (48 h) con IL-2 e IL-15. Las células NK se cultivaron solas o cocultivadas con neuronas DRG recolectadas de la neurona nociceptora intacta (control de compañero de camada; TRPV1^wt::D TA fl/wt) o ratones ablacionados (TRPV1^cre::D TA^fl/wt). Luego, las células se expusieron al agonista capsaicina TRPV1 (1 μM) o su ...

Discusión

Davies et ^al.11 encontraron que las neuronas lesionadas regulan al alza la RAE1. A través del contacto célula-célula, las células NK que expresan NKG2D fueron capaces de identificar y eliminar las neuronas RAE1⁺ , que a su vez limitan el dolor crónico¹¹. Dado que las células NK también expresan varios receptores de neuropéptidos, y que esos neuropéptidos son conocidos por sus capacidades inmunomoduladoras, parece cada vez más importante estudia...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse CD16/32	Jackson Laboratory	Cat no: 017769
B-27	Jackson Laboratory	Cat no: 009669
Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade	World Precision Instruments	Cat no: 504167
BV421 anti-mouse NK-1.1	Fisher Scientific	Cat no: 12430112
Cell strainer (50 μm)	Fisher Scientific	Cat no: A3160702
Collagenase IV	Fisher Scientific	Cat no: 15140148
Diphteria toxinfl/fl	Fisher Scientific	Cat no: SH3057402
Dispase II	Fisher Scientific	Cat no: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	Cat no: 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit	Sigma	Cat no: CLS2595
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	Cat no: C0130
FACSAria III	Sigma	Cat no: 04942078001
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	Cat no: 806552
FITC anti-mouse NKp46	Sigma	Cat no: L2020
Flat bottom 96-well plate	Sigma	Cat no: 03690
Glass Pasteur pipette	Sigma	Cat no: 470236-274
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)	VWR	Cat no: 02-0131
Laminin	Cedarlane	Cat no: 03-50/31
L-Glutamine	Gibco	Cat no: A14867-01
Mouse recombinant IL-15	Gibco	Cat no: 22400-089
Mouse recombinant IL-2	Gibco	Cat no: 21103-049
Nerve Growth Factor (NGF)	Life Technologies	Cat no: 13257-019
Neurobasal media	PeproTech	Cat no: 450-51-10
PE anti-mouse GM-CSF	PeproTech	Cat no: 212-12
Penicillin and Streptomycin	PeproTech	Cat no: 210-15
Pestles	Stem Cell Technology	Cat no: 19855
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biolegend	Cat no: 108732	Clone PK136
RPMI 1640 media	Biolegend	Cat no: 137606	Clone 29A1.4
TRPV1Cre	Biolegend	Cat no: 505406	Clone MP1-22E9
Tweezers and dissection tools.	Biolegend	Cat no: 65-0865-14
U-Shaped-bottom 96-well plate	Biolegend	Cat no: 101319
Viability Dye eFlour-780	Becton Dickinson