נטרול יחסי הגומלין בין תאי הרג טבעיים לבין נוירונים של נוסיצפטורים

Summary

נוירונים Nociceptor ותאי NK אינטראקציה פעילה בהקשר דלקתי. גישה של תרבות משותפת מאפשרת ללמוד את יחסי הגומלין האלה.

Abstract

נוירונים סומטוסנסוריים התפתחו כדי לזהות גירויים רעילים ולהפעיל רפלקסים הגנתיים. על ידי שיתוף אמצעי תקשורת, נוירונים nociceptor גם לכוון את הגנות המארח על ידי שליטה על הפעילות של המערכת החיסונית. התקשורת בין מערכות אלה היא בעיקר אדפטיבית, עוזר להגן על הומאוסטזיס, זה יכול גם להוביל, או לקדם, את הופעת מחלות כרוניות. שתי המערכות התפתחו יחד כדי לאפשר אינטראקציה מקומית כזו, כפי שנמצאת ברקמות לימפה ראשוניות ומשניות וברירית. מחקרים אחרונים הראו כי nociceptors מזהים ומגיבים ישירות לאנטיגנים זרים, ציטוקינים שמקורם בתאי מערכת החיסון ומיקרובים.

הפעלת Nociceptor לא רק גורמת לרגישות יתר לכאב וגירוד, אלא מורידה את סף ירי הנוציצפטור, מה שמוביל לשחרור מקומי של נוירופפטידים. הפפטידים המיוצרים על ידי, ומשוחררים, הטרמינלים ההיקפיים של nociceptors יכול לחסום את chemotaxis ואת הקיטוב של לימפוציטים, שליטה על לוקליזציה, משך, וסוג של דלקת. עדויות עדכניות מראות כי נוירונים תחושתיים מתקשרים עם תאי חיסון מולדים באמצעות מגע בין תאים, לדוגמה, תוך הפעלת קולטני דו-ממד מקבוצה (NKG2D) על תאי הרג טבעי (NK).

בהתחשב בכך שתאי NK מבטאים את הקולטנים הקוגנטיים עבור מתווכים שונים המיוצרים על ידי nociceptor, ניתן להעלות על הדעת כי nociceptors להשתמש נוירופפטידים כדי לשלוט על הפעילות של תאי NK. כאן, אנו מפתחים שיטת תרבית משותפת כדי לחקור אינטראקציות נוירון-NK של nociceptor בצלחת. באמצעות גישה זו, מצאנו כי נוירונים של nociceptor מותני מפחיתים את ביטוי הציטוקינים של תאי NK. באופן כללי, שיטה רדוקציוניסטית כזו יכולה להיות שימושית כדי לחקור כיצד נוירונים מעוררי גידול שולטים בתפקוד האנטי-סרטני של תאי NK, וכיצד תאי NK שולטים בחיסול תאי עצב פצועים.

Introduction

גופי התאים של נוירונים חושיים מקורם בגרעיני השורש הגבי (DRG). ה- DRG ממוקמים במערכת העצבים ההיקפית (PNS), בין הקרן הגבית של חוט השדרה לבין קצות העצבים ההיקפיים. האופי הפסאודו-חד קוטבי של נוירוני DRG מאפשר העברת מידע מהענף ההיקפי, אשר innervates את רקמת המטרה, אל הענף המרכזי, אשר נושא את המידע הסומטוסנסורי אל חוט השדרה¹. באמצעות קולטני תעלות יונים מיוחדים, נוירונים מסדר ראשון חשים איומים הנשקפים מפתוגנים, אלרגנים ומזהמים², מה שמוביל לזרם הקטיונים (Na+, Ca²⁺) וליצירת פוטנציאל פעולה 3,4,5.

תאי עצב אלה גם שולחים פוטנציאל פעולה אנטי-דרומי לכיוון הפריפריה, שם התרחשה חישת הסכנה הראשונית, מה שמוביל לשחרור מקומי של נוירופפטידים ^1,4. לכן, נוירונים nociceptor לשמש מנגנון הגנה, התראה המארח על סכנה סביבתית 4,5,6,7.

כדי לתקשר עם נוירונים מסדר שני, הנוציצפטורים משחררים מוליכים עצביים שונים (למשל, גלוטמט) ונוירופפטידים (למשל, פפטיד הקשור לגנים קלציטונין (CGRP), חומר P (SP) ופפטיד מעיים vasoactive (VIP)^)6,7. פפטידים אלה פועלים על נימים ומקדמים אקסטרווזיה של פלזמה, בצקת, ואת הזרימה והמודולציה המקומית של תאי מערכת החיסון ^2,4,7.

המערכת הסומטוסנסורית ומערכת החיסון משתמשות במערכת תקשורת משותפת המורכבת מציטוקינים ונוירופפטידים, והקולטנים הקוגנטיים שלהם⁴. בעוד שתקשורת דו-כיוונית זו מסייעת בהגנה מפני סכנה ובשימור הומאוסטזיס, היא יכולה גם לתרום לפתופיזיולוגיה של מחלות⁴.

תאי NK מסווגים כתאי לימפה מולדים והם מתמחים בחיסול תאים נגועים ויראליים. תפקוד תאי NK נשלט על ידי איזון של קולטנים מגרים ומעכבים, כולל הקולטן המפעיל NKG2D⁸. הליגנד האנדוגני של NKG2D, חומצה רטינואית מוקדמת1 (RAE1), מתבטא בתאים העוברים עקה כגון גידולים וזיהום ^8,9.

מחקרים אחרונים הראו כי פגיעה עצבית היקפית מניעה נוירונים תחושתיים לבטא מולקולות לא מסתגלות כגון stathmin 2 (STMN2) ו- RAE1. כך, באמצעות מגע בין תאים, תאי NK המבטאים NKG2D הופעלו על ידי אינטראקציה עם נוירונים המבטאים RAE1. בתורו, תאי NK היו מסוגלים לחסל נוירונים nociceptor פצוע קהה רגישות יתר כאב קשורה בדרך כלל עם פגיעה עצבית¹⁰. בנוסף לציר NKG2D-RAE1, תאי NK מבטאים את הקולטנים הקוגנטיים עבור מתווכים שונים המיוצרים על ידי nociceptor. לכן ייתכן שהמתווכים האלה מווסתים את פעילות תאי ה-NK. מאמר זה מציג שיטת תרבית משותפת כדי לחקור את הביולוגיה של האינטראקציה בין תאי הנוירון-NK של nociceptor. גישה זו תסייע לקדם את ההבנה כיצד נוירונים של nociceptor מווסתים תגובות של תאי חיסון מולדים לפציעה, זיהום או ממאירות.

Protocol

הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מונטריאול (#22053, #22054) אישרו את כל ההליכים לבעלי חיים. ראה טבלה 1 לקבלת רשימה של פתרונות והרכבם וטבלת החומרים לקבלת רשימה של חומרים, ציוד וריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. בידוד תאי NK, תרבית וגירוי

1. צור נוירון nociceptor שלם (שליטה littermate; TRPV1 wt::D TA fl/wt) ועכברים אבלטים (TRPV1 cre::D TA fl/wt) על ידי חציית עכברי רעלן לוקס-סטופ-לוקס-דיפתריה (DTA fl/^fl) עם עכברי TRPV1 ^cre/wt.
2. באמצעות שאיפת CO₂, הרדימו עכבר תמים (TRPV1 wt::D TA^fl/wt).
3. אסוף את הטחול בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל 500 μL של תמיסת מלח סטרילית עם אגירת פוספט (PBS).
4. הומוגניזציה של הטחול באמצעות מזיק.
5. לדלל את התאים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי.
6. מסננים את התערובת דרך מסננת תאים בקוטר 50 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל.
7. טען את עוצמת הקול (10 מ"ל) עם PBS סטרילי.
8. לאסוף 10 μL ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
9. צנטריפוגה של התאים (500 × גרם, 5 דקות) ולהסיר את supernatant.
10. השהה את התאים בריכוז של 10^{8 תאים} למ"ל בתוספת RPMI 1640 בינונית.
11. עקוב אחר הוראות היצרן לטיהור מגנטי של תאי NK בטחול באמצעות ערכת בידוד תאי NK של עכבר. אשר את טוהר תאי NK באמצעות ציטומטריה של זרימה¹¹.
12. לאסוף 10 μL ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
13. צנטריפוגה של התאים (500 × גרם, 5 דקות) ולהסיר את supernatant.
14. יש להשעות את תאי ה-NK בתרבית RPMI 1640 בתוספת (המכילה IL-2 ו-IL-15).
15. תרבית 2 × 10⁶ תאי NK / מ"ל בצלחת תחתית U 96 היטב במשך 48 שעות.

2. בידוד ותרבית נוירונים DRG

1. ב-24 שעות לפני סיום גירוי תאי ה-NK (שלב 1.15), צפו צלחת של 96 באר עם 100 μL/באר של למינין (1 ng/mL) ודגרו במשך 45 דקות (37 °C).
2. לאחר הדגירה, הסר את התמיסה ואפשר לבארות להתייבש באוויר בארון בטיחות ביולוגית.
3. באמצעות שאיפת CO₂, להרדים נוירון nociceptor שלם (בקרת פסולת; TRPV1 wt::D TA fl/wt) או עכברים אבלטים (TRPV1^cre::D TA^fl/wt).
   הערה: שאיפת CO₂ עדיפה על פריקת צוואר הרחם מכיוון שהיא מונעת הפרעה לעצבי עמוד השדרה המחוברים ל- DRG.
4. הצמידו את העכבר על הלוח במצב נוטה, הרימו את העור וחתכו את העור לאורך העמוד הגבי. עיין ב- Perner et al. לסרטון מפורט¹².
5. חותכים את המפרק המותני ומפרידים את העצה מעמוד השדרה המותני באמצעות מספריים.
6. הפרד את עמוד השדרה על ידי חיתוך השרירים והצלעות משני צידי עמוד השדרה בכיוון הגולגולת עד להגעה לבסיס הגולגולת.
7. באמצעות מספריים, לחתוך את עמוד השדרה במפרק atlanto-occipital.
8. הסר שריר ורקמת שומן מעמוד השדרה.
9. הצמד ופתח את עמוד השדרה כדי להסיר את חוט השדרה ולקבל גישה ל- DRG. חפשו את ה-DRG בפורמינה הבין-חולייתית המחוברת לחוט השדרה דרך השורש הגבי אך מופרדת מקרום המוח.
10. קצור את ה-DRGs לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל מלא ב-10 מ"ל של תוסף DMEM קר כקרח.
11. צנטריפוגה את ההכנה (200 × גרם, 5 דקות, טמפרטורת החדר) ולהסיר את supernatant.
12. יש להוסיף 250 μL של PBS המכיל קולגןאז IV (1 מ"ג/מ"ל) ו-Dispase II (2.4 U/mL).
13. דגירה של DRG עם תמיסת קולגן IV/Dispase II (C/D) (80 דקות, 37 מעלות צלזיוס, תסיסה קלה). בעת איגום גרעינים ממספר עכברים, יש לשמור על יחס של 125 μL של תמיסת C/D לכל גנגליון.
14. כדי להשבית את האנזימים, יש להוסיף 5 מ"ל של תוסף DMEM בינוני.
15. צנטריפוגה את התמיסה (200 × גרם, 5 דקות) ולהסיר בעדינות את supernatant באמצעות פיפטה.
16. כדי למנוע אובדן תאים לא רצוי, השאירו ~ 100 μL של הסופר-נטנט.
17. יש להוסיף 1 מ"ל של תוסף DMEM בינוני.
18. באמצעות אקדח פיפטה ושלושה פיפטות פסטר זכוכית בגדלים הולכים ופוחתים, טריטוראט בעדינות (~ 10 למעלה / למטה לכל גודל פיפטה פסטר) את ה- DRG להכנת תא יחיד.
19. בארון בטיחות ביולוגית, יש לדלל אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS סטרילי לריכוז סופי של 15%. אחסן 1 מ"ל aliquots ב -20 °C.
20. צור גרדיאנט BSA בצינור חרוטי של 15 מ"ל על ידי הוספת 2 מ"ל של PBS סטרילי וחלוקה איטית של 1 מ"ל של 15% תמיסת BSA בתחתית הצינור. הימנע מהפרעה לשיפוע על ידי הסרה עדינה של הפיפטה.
21. באמצעות פיפטה P200, לאט לאט פיפטה את תרחיף הגרעינים המשולשים (המכיל את הנוירונים) על צד הצינור לתוך השיפוע.
22. צנטריפוגה של שיפוע BSA המכיל נוירון (200 × גרם, 12 דקות, טמפרטורת החדר). הגדר את ההאצה וההאטה של הצנטריפוגה למהירות המינימלית.
    הערה: לאחר צנטריפוגה, הנוירונים יהיו בתחתית הצינור בעוד שפסולת התאים תילכד בשיפוע BSA.
23. יש להסיר בעדינות את כל הסופרנטנט באמצעות פיפטה.
24. השהה את התאים ב-500 μL של Neurobasal.
25. צלחת 10⁴ נוירונים לכל באר (200 μL של נוירובסל/באר) בצלחת 96 באר מצופה למינין, בעלת תחתית שטוחה.
    הערה: בממוצע, חוקר יוכל למלא ~ 8 בארות לכל עכבר.
26. תרבית את הנוירונים (37 מעלות צלזיוס, לילה) כדי לאפשר התקשרות.

3. תרבות משותפת וציטומטריה של זרימה

1. לאט לאט להסיר את neurobasal מתרבית נוירון.
2. לאחר גירוי של 48 שעות עם IL-2 ו-IL-15 (ראה שלבים 1.14-1.15), יש להשעות את תאי ה-NK ולהוסיף 10 תאי NK⁵ /באר לתרבית הנוירונים (צלחת תחתונה שטוחה 96 היטב).
   הערה: בממוצע, החוקר יוכל למלא ~ 6 בארות לכל עכבר.
3. תרבית משותפת של התאים בתוספת MX נוירובסאלי (37 °C, 48 שעות).
4. לאסוף את התאים, לשטוף עם PBS (3x), צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס).
5. השליכו את הסופרנאטנט והכתימו את התאים ב-Viability Dye eFlour-780 (1:1,000, 15 דקות, 4 מעלות צלזיוס).
6. לאסוף את התאים, לשטוף עם PBS (3x), צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס).
7. חסום אתרים לא ספציפיים בתאים באמצעות CD16/32 (1:100, 15 דקות, 4 °C).
8. לאסוף את התאים, לשטוף עם PBS (3x), צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות, 4 °C).
9. כתם (15 דקות, 4 מעלות צלזיוס) התאים עם BV421 anti-NK-1.1 (1:100), פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC) אנטי-NKp46 (1:100), ופיקואריתרין (PE) אנטי-GM-CSF (1:100).
10. לאסוף את התאים, לשטוף עם PBS (3x), צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס).
11. יש להשליך את הסופר-נטנט, לתלות מחדש את התאים במאגר FACS (500 μL) ואת האימונופנוטיפ של תאי ה-NK על ידי ציטומטריה של זרימה¹¹. ראו איור 1A עבור אסטרטגיית ה-gating.

תוצאות

תאי NK טוהרו באופן מגנטי מבקרת פסולת (TRPV1 wt::D TA^fl/wt) של עכברים ספלנוציטים ועוררו (48 שעות) עם IL-2 ו-IL-15. לאחר מכן תאי ה-NK גודלו בתרבית בלבד או בתרבית משותפת עם נוירוני DRG שנקטפו מנוירון נוסיצפטור שלם (בקרת פסולת; TRPV1 wt::D TA fl/wt) או עכברים אבלטים (TRPV1^cre::D TA^fl/wt). לאחר מכן נ...

Discussion

Davies et ^al.11 מצאו שתאי עצב פצועים מווסתים את RAE1. באמצעות מגע בין תאים, תאי NK המבטאים NKG2D הצליחו לזהות ולחסל נוירונים ^RAE1+ , אשר בתורם מגבילים כאב כרוני¹¹. בהתחשב בכך שתאי NK מבטאים גם קולטני נוירופפטידים שונים, וכי נוירופפטידים אלה ידועים ביכולותיהם האימונומוד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse CD16/32	Jackson Laboratory	Cat no: 017769
B-27	Jackson Laboratory	Cat no: 009669
Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade	World Precision Instruments	Cat no: 504167
BV421 anti-mouse NK-1.1	Fisher Scientific	Cat no: 12430112
Cell strainer (50 μm)	Fisher Scientific	Cat no: A3160702
Collagenase IV	Fisher Scientific	Cat no: 15140148
Diphteria toxinfl/fl	Fisher Scientific	Cat no: SH3057402
Dispase II	Fisher Scientific	Cat no: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	Cat no: 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit	Sigma	Cat no: CLS2595
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	Cat no: C0130
FACSAria III	Sigma	Cat no: 04942078001
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	Cat no: 806552
FITC anti-mouse NKp46	Sigma	Cat no: L2020
Flat bottom 96-well plate	Sigma	Cat no: 03690
Glass Pasteur pipette	Sigma	Cat no: 470236-274
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)	VWR	Cat no: 02-0131
Laminin	Cedarlane	Cat no: 03-50/31
L-Glutamine	Gibco	Cat no: A14867-01
Mouse recombinant IL-15	Gibco	Cat no: 22400-089
Mouse recombinant IL-2	Gibco	Cat no: 21103-049
Nerve Growth Factor (NGF)	Life Technologies	Cat no: 13257-019
Neurobasal media	PeproTech	Cat no: 450-51-10
PE anti-mouse GM-CSF	PeproTech	Cat no: 212-12
Penicillin and Streptomycin	PeproTech	Cat no: 210-15
Pestles	Stem Cell Technology	Cat no: 19855
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biolegend	Cat no: 108732	Clone PK136
RPMI 1640 media	Biolegend	Cat no: 137606	Clone 29A1.4
TRPV1Cre	Biolegend	Cat no: 505406	Clone MP1-22E9
Tweezers and dissection tools.	Biolegend	Cat no: 65-0865-14
U-Shaped-bottom 96-well plate	Biolegend	Cat no: 101319
Viability Dye eFlour-780	Becton Dickinson