Поддразнивание взаимодействия между естественными клетками-киллерами и нейронами ноцицепторов

Резюме

Ноцицепторные нейроны и NK-клетки активно взаимодействуют в воспалительном контексте. Кокультурный подход позволяет изучать это взаимодействие.

Аннотация

Соматосенсорные нейроны эволюционировали для обнаружения вредных раздражителей и активации защитных рефлексов. Разделяя средства связи, ноцицепторные нейроны также настраивают защиту хозяина, контролируя активность иммунной системы. Связь между этими системами в основном адаптивная, помогая защитить гомеостаз, она также может привести или способствовать возникновению хронических заболеваний. Обе системы совместно эволюционировали, чтобы обеспечить такое локальное взаимодействие, как в первичных и вторичных лимфоидных тканях и слизистой оболочке. Недавние исследования показали, что ноцицепторы непосредственно обнаруживают и реагируют на чужеродные антигены, цитокины, полученные из иммунных клеток, и микробы.

Активация ноцицепторов не только приводит к гиперчувствительности к боли и зуду, но и снижает порог срабатывания ноцицепторов, что приводит к локальному высвобождению нейропептидов. Пептиды, которые вырабатываются периферическими терминалами ноцицепторов и высвобождаются из них, могут блокировать хемотаксис и поляризацию лимфоцитов, контролируя локализацию, продолжительность и тип воспаления. Последние данные показывают, что сенсорные нейроны взаимодействуют с врожденными иммунными клетками через клеточный контакт, например, привлекая рецепторы группы 2D (NKG2D) на клетках-естественных киллерах (NK).

Учитывая, что NK-клетки экспрессируют родственные рецепторы для различных медиаторов, продуцируемых ноцицепторами, вполне возможно, что ноцицепторы используют нейропептиды для контроля активности NK-клеток. Здесь мы разрабатываем метод кокультуры для изучения взаимодействия ноцицепторных нейронов и NK-клеток в чашке. Используя этот подход, мы обнаружили, что поясничные ноцицепторные нейроны уменьшают экспрессию цитокинов NK-клеток. В целом, такой редукционистский метод может быть полезен для изучения того, как иннервирующие опухоль нейроны контролируют противоопухолевую функцию NK-клеток и как NK-клетки контролируют устранение поврежденных нейронов.

Введение

Клеточные тела сенсорных нейронов берут свое начало в дорсальных корневых ганглиях (ДРГ). ДРГ расположены в периферической нервной системе (ПНС), между дорсальным рогом спинного мозга и периферическими нервными окончаниями. Псевдоуниполярная природа нейронов ДРГ позволяет передавать информацию от периферической ветви, которая иннервирует ткань-мишень, к центральной ветви, которая несет соматосенсорную информацию к спинному мозгу¹. Используя специализированные рецепторы ионных каналов, нейроны первого порядка ощущают угрозы, создаваемые патогенами, аллергенами и загрязняющими веществами², что приводит к притоку катионов (Na⁺, Ca²⁺) и генерации потенциала действия ^3,4,5.

Эти нейроны также посылают антидромный потенциал действия к периферии, где произошло первоначальное ощущение опасности, что приводит к локальному высвобождению нейропептидов ^1,4. Поэтому нейроны ноцицептора служат защитным механизмом, предупреждая хозяина об экологической опасности 4,5,6,7.

Для связи с нейронами второго порядка ноцицепторы высвобождают различные нейротрансмиттеры (например, глутамат) и нейропептиды (например, пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP), вещество P (SP) и вазоактивный кишечный пептид (VIP))^6,7. Эти пептиды действуют на капилляры и способствуют экстравазации плазмы, отекам, а также местному притоку и модуляции иммунных клеток ^2,4,7.

Соматосенсорная и иммунная системы используют общую систему связи, состоящую из цитокинов и нейропептидов, и их соответствующих родственных рецепторов⁴. Хотя эта двунаправленная связь помогает защитить от опасности и сохранить гомеостаз, она также может способствовать патофизиологии заболевания⁴.

NK-клетки классифицируются как врожденные лимфоидные клетки и специализируются на устранении вирусно инфицированных клеток. Функция NK-клеток регулируется балансом стимулирующих и тормозных рецепторов, включая активирующий рецептор NKG2D⁸. Эндогенный лиганд NKG2D, ранняя индуцируемая ретиноевая кислота1 (RAE1), экспрессируется клетками, подвергающимися стрессу, такому как опухолевый генез и инфекция ^8,9.

Недавние исследования показали, что повреждение периферических нервов заставляет сенсорные нейроны экспрессировать дезадаптивные молекулы, такие как статмин 2 (STMN2) и RAE1. Таким образом, через клеточно-клеточный контакт NKG2D-экспрессирующие NK-клетки активировались взаимодействием с RAE1-экспрессирующими нейронами. В свою очередь, NK-клетки смогли устранить поврежденные нейроны ноцицептора и тупую болевую гиперчувствительность, обычно связанную с повреждением нерва¹⁰. В дополнение к оси NKG2D-RAE1, NK-клетки экспрессируют родственные рецепторы для различных медиаторов, продуцируемых ноцицепторами. Поэтому возможно, что эти медиаторы модулируют активность NK-клеток. В данной работе представлен метод кокультуры для исследования биологии взаимодействия нейрон-NK-клетка ноцицептора. Этот подход поможет продвинуть понимание того, как нейроны ноцицепторов модулируют врожденные иммунные клеточные реакции на травму, инфекцию или злокачественность.

протокол

Институциональные комитеты по уходу за животными и их использованию Монреальского университета (#22053, #22054) одобрили все процедуры для животных. Список растворов и их состав см. в Таблице 1 , а в Таблице материалов — список материалов, оборудования и реагентов, используемых в настоящем протоколе.

1. Выделение, культивирование и стимуляция NK-клеток

1. Генерация неповрежденного ноцицепторного нейрона (контроль помета; TRPV1^wt::D TA^fl/wt) и абляционные (TRPV1^cre::D TA^fl/wt) мыши путем скрещивания мышей с токсином lox-stop-lox-diphtheria (DTA^fl/fl) с мышами TRPV1^cre/wt .
2. Используя ингаляцию_CO2 , усыплите наивную мышь для контроля помета (TRPV1^wt: :D TA^{fl / wt}).
3. Соберите селезенку в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую 500 мкл стерильного фосфат-буферного физиологического раствора (PBS).
4. Гомогенизируйте селезенку с помощью пестика.
5. Разбавить клетки 1 мл стерильного PBS.
6. Отфильтруйте смесь через клеточный сетчатый фильтр 50 мкм в коническую трубку объемом 15 мл.
7. Доливайте объем (10 мл) стерильным PBS.
8. Соберите 10 мкл и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
9. Центрифугируют клетки (500 × г, 5 мин) и удаляют супернатант.
10. Повторное суспендирование клеток в концентрации 10⁸ клеток/мл в дополненной среде RPMI 1640.
11. Следуйте инструкциям производителя для магнитной очистки NK-клеток селезенки с помощью комплекта изоляции NK-клеток мыши. Подтвердите чистоту NK-клеток с помощью проточной цитометрии¹¹.
12. Соберите 10 мкл и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
13. Центрифугируют клетки (500 × г, 5 мин) и удаляют супернатант.
14. Повторное суспендирование NK-клеток в дополненной питательной среде RPMI 1640 (содержащей IL-2 и IL-15).
15. Культивирование 2 × 10⁶ NK-клеток/мл в 96-луночной U-образной нижней пластине в течение 48 ч.

2. Изоляция и культивирование нейронов DRG

1. За 24 ч до окончания стимуляции NK-клеток (стадия 1.15) покрывают 96-луночную пластину 100 мкл/лунку ламинина (1 нг/мл) и инкубируют в течение 45 мин (37°С).
2. После инкубации удалите раствор и дайте лункам высохнуть на воздухе в шкафу для биобезопасности.
3. Используя ингаляцию_CO2 , усыпляют неповрежденный нейрон ноцицептора (контроль помета; TRPV1^wt: :D TA^{fl / wt}) или абляционные (TRPV1^cre: :D TA^{fl / wt}) мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вдыхание CO₂ предпочтительнее шейного вывиха, поскольку оно позволяет избежать нарушения спинномозговых нервов, связанных с DRG.
4. Закрепите мышь на доске в положении лежа, поднимите кожу и прорежьте кожу вдоль спинного столба. Обратитесь к Perner et al. для подробного видео¹².
5. Отрежьте пояснично-крестцовый сустав и отделите крестец от поясничного отдела позвоночника ножницами.
6. Отделите позвоночник, разрезав мышцы и ребра с обеих сторон позвоночника в черепном направлении, пока не будет достигнуто основание черепа.
7. С помощью ножниц отрежьте позвоночник в атланто-затылочном суставе.
8. Удалить мышечную и жировую ткань из позвоночника.
9. Закрепите и откройте позвоночный столб, чтобы удалить спинной мозг и получить доступ к DRG. Ищите ДРГ в межпозвоночной форамине, соединенной со спинным мозгом через дорсальный корень, но отделенной от мозговых оболочек.
10. Соберите DRG в коническую трубку объемом 15 мл, заполненную 10 мл DMEM, дополненной ледяным холодом.
11. Центрифугируют препарат (200 × г, 5 мин, комнатной температуры) и удаляют надосадочное вещество.
12. Добавьте 250 мкл PBS, содержащего коллагеназу IV (1 мг/мл) и диспазу II (2,4 Ед/мл).
13. Инкубировать ДРГ с раствором коллагеназы IV/Dispase II (C/D) (80 мин, 37 °C, легкое перемешивание). При объединении ганглиев от нескольких мышей поддерживайте соотношение 125 мкл раствора C/D на ганглий.
14. Чтобы инактивировать ферменты, добавьте 5 мл добавленной среды DMEM.
15. Центрифугируют раствор (200 × г, 5 мин) и аккуратно удаляют супернатант с помощью пипетки.
16. Чтобы избежать нежелательной потери клеток, оставьте ~ 100 мкл супернатанта.
17. Добавьте 1 мл дополненной среды DMEM.
18. Используя пипетку и три стеклянные пипетки Пастера уменьшающихся размеров, аккуратно тритурируйте (~ 10 вверх / вниз на размер пипетки Пастера) DRG в одноклеточный препарат.
19. В кабинете биобезопасности разводят бычий сывороточный альбумин (BSA) в стерильном PBS до конечной концентрации 15%. Хранить 1 мл аликвоты при −20 °C.
20. Создайте градиент BSA в конической трубке объемом 15 мл, добавив 2 мл стерильного PBS и медленно дозируя 1 мл 15% раствора BSA в нижней части трубки. Избегайте нарушения градиента, аккуратно удалив пипетку.
21. Используя пипетку P200, медленно пипетку тритурированной суспензии ганглиев (которая содержит нейроны) на стороне трубки в градиент.
22. Центрифуга нейронсодержащего градиента BSA (200 × г, 12 мин, комнатная температура). Установите ускорение и замедление центрифуги на минимальную скорость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования нейроны будут находиться в нижней части трубки, в то время как обломки клеток будут захвачены в градиенте BSA.
23. Аккуратно удалите все супернатанты с помощью пипетки.
24. Повторное суспендирование клеток в 500 мкл нейробазала.
25. Пластина 10⁴ нейрона на лунку (200 мкл нейробазальной/луночной) в пластине с ламининовым покрытием и плоским дном из 96 лунок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, исследователь сможет заполнить ~ 8 скважин на мышь.
26. Культивируйте нейроны (37 °C, ночью), чтобы обеспечить прикрепление.

3. Кокультура и проточная цитометрия

1. Медленно удаляют нейробазаль из культуры нейронов.
2. После 48 ч стимуляции IL-2 и IL-15 (см. шаги 1.14-1.15) повторно суспендировать NK-клетки и добавить 10⁵ NK-клеток/лунку в культуру нейронов (96-луночная плоская нижняя пластина).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, исследователь сможет заполнить ~ 6 скважин на мышь.
3. Совместно культивирование клеток в дополненном нейробазальном MX (37 °C, 48 ч).
4. Соберите ячейки, промыть PBS (3x) и центрифугой (500 × g, 5 мин, 4 °C).
5. Откажитесь от надотворного вещества и окрашивайте клетки красителем жизнеспособности eFlour-780 (1:1000, 15 мин, 4 °C).
6. Собрать ячейки, промыть PBS (3x) и центрифугой (500 × г, 5 мин, 4 °C).
7. Блокирует неспецифические участки на клетках с CD16/32 (1:100, 15 мин, 4 °C).
8. Собрать ячейки, промыть PBS (3x) и центрифугой (500 × г, 5 мин, 4 °C).
9. Окрашивание (15 мин, 4 °C) клеток анти-NK-1.1 (1:100), флуоресцеина изотиоцианата (FITC) анти-NKp46 (1:100) и фикоэритрина (PE) анти-GM-CSF (1:100).
10. Собрать ячейки, промыть PBS (3x) и центрифугой (500 × г, 5 мин, 4 °C).
11. Отбросьте супернатант, повторно суспендируйте клетки в буфере FACS (500 мкл) и иммунофенотипе NK-клеток методом проточной цитометрии¹¹. См. рисунок 1A для стратегии гатинга.

Результаты

NK-клетки были магнитно очищены от контрольных (TRPV1^wt: :D TA^{fl / wt}) спленоцитов мышей и стимулировали (48 ч) IL-2 и IL-15. Затем NK-клетки культивировали отдельно или совместно культивировали с нейронами DRG, собранными из неповрежденного ноцицепторного нейрона (контроль помета; TRPV1^wt: ...

Обсуждение

Davies et ^al.11 обнаружили, что поврежденные нейроны повышают регуляцию RAE1. Благодаря клеточно-клеточному контакту NKG2D-экспрессирующие NK-клетки смогли идентифицировать и устранить нейроны RAE1⁺ , которые, в свою очередь, ограничивают хроническую боль¹¹. Учит?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse CD16/32	Jackson Laboratory	Cat no: 017769
B-27	Jackson Laboratory	Cat no: 009669
Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade	World Precision Instruments	Cat no: 504167
BV421 anti-mouse NK-1.1	Fisher Scientific	Cat no: 12430112
Cell strainer (50 μm)	Fisher Scientific	Cat no: A3160702
Collagenase IV	Fisher Scientific	Cat no: 15140148
Diphteria toxinfl/fl	Fisher Scientific	Cat no: SH3057402
Dispase II	Fisher Scientific	Cat no: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	Cat no: 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit	Sigma	Cat no: CLS2595
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	Cat no: C0130
FACSAria III	Sigma	Cat no: 04942078001
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	Cat no: 806552
FITC anti-mouse NKp46	Sigma	Cat no: L2020
Flat bottom 96-well plate	Sigma	Cat no: 03690
Glass Pasteur pipette	Sigma	Cat no: 470236-274
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)	VWR	Cat no: 02-0131
Laminin	Cedarlane	Cat no: 03-50/31
L-Glutamine	Gibco	Cat no: A14867-01
Mouse recombinant IL-15	Gibco	Cat no: 22400-089
Mouse recombinant IL-2	Gibco	Cat no: 21103-049
Nerve Growth Factor (NGF)	Life Technologies	Cat no: 13257-019
Neurobasal media	PeproTech	Cat no: 450-51-10
PE anti-mouse GM-CSF	PeproTech	Cat no: 212-12
Penicillin and Streptomycin	PeproTech	Cat no: 210-15
Pestles	Stem Cell Technology	Cat no: 19855
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biolegend	Cat no: 108732	Clone PK136
RPMI 1640 media	Biolegend	Cat no: 137606	Clone 29A1.4
TRPV1Cre	Biolegend	Cat no: 505406	Clone MP1-22E9
Tweezers and dissection tools.	Biolegend	Cat no: 65-0865-14
U-Shaped-bottom 96-well plate	Biolegend	Cat no: 101319
Viability Dye eFlour-780	Becton Dickinson