使用循环死亡供体心脏的异位大鼠心脏移植模型

摘要

在这里，我们描述了利用循环死亡供体心脏进行小鼠异位心脏移植的准备和技术细节。

摘要

该方案的目的是建立循环死亡 （DCD） 供体心脏后捐献的大鼠异位心脏移植模型。该协议有两种设置：心脏供体设置和受体设置。在心脏供体设置中，麻醉 Sprague Dawley 大鼠，气管插管和通气。右颈动脉插管以输送肝素和麻痹剂维库溴铵。DCD 过程是通过终止通气来启动的。20 分钟后，心脏暴露，头臂支远端的主动脉被夹住。在终止呼吸机后 25 分钟，通过颈动脉导管灌注冰冷的威斯康星大学 （UW） 溶液以冲洗心脏。心脏是通过分裂主动脉、肺动脉、腔静脉和肺静脉获得的，并储存在 UW 溶液中用于植入。在受体设置中，用异氟醚麻醉 Lewis 大鼠。缓释丁丙诺啡皮下给药，以促进术后顺利恢复。通过腹部中线切口，肾下主动脉和下腔静脉被隔离并用无创伤血管夹夹住。供体心脏主动脉和肺动脉分别缝合到受体腹主动脉和腔静脉，以 8-0 的运行速度Prolene.移除血管夹以重新灌注心脏。腹壁闭合，大鼠被回收。在设定的间隔 （24 小时至 2 周） 后，麻醉受体大鼠，暴露移植的心脏，并通过心尖将球囊尖端导管插入左心室，以使用数据采集系统记录发展的压力和 dP / dt。收集心脏组织用于组织学、免疫学或分子分析。成功的 DCD 供体大鼠心脏移植模型将允许进一步研究心脏保护方法以改善 DCD 供体的心脏移植结果。

引言

心脏移植 （HTx） 的小动物模型对于进行影响移植心脏的病理生理状况的研究至关重要。正如 Oto 和 Lindsey 所描述的，小鼠模型中的异位 HTx 使研究人员能够研究在缺血和再灌注¹ 条件下观察到的病理生理学变化。传统上，用于移植的供体心脏是从跳动的心脏供体那里获得的，也称为脑死亡后捐献 （DBD） 供体;然而，需要 HTx² 的患者数量出现了不成比例的增加。最近，来自循环死亡供体的心脏，也称为循环死亡后供体 （DCD） 供体，已被用于实验环境中的移植³。DBD 和 DCD 供体心脏之间的主要区别在于，在后者中，心脏会经历不同持续时间的缺血，因此无法在常规 HTx 实践中使用。

先前描述的关于小鼠异位 HTx 的文献仅使用了跳动的心脏供体条件 ^4,5,6。异位 DCD 心脏移植需要细微的修饰，没有这些修饰，移植的心脏将无法跳动⁷。该协议旨在与读者分享大鼠 DCD HTx 的精细技术。整体性心肌缺血是 DCD 器官捐献所固有的。模拟全面心肌缺血的实验装置仅在离体装置⁵ 中进行了研究。离体研究的结果可能不适用于 DCD HTx 工作，因为体内 （DCD） 和离体整体缺血模型之间存在显着差异⁵。在离体模型中缓解再灌注心肌缺血的干预措施的结果或缺乏结果在 DCD HTx 模型中可能无法重现。因此，必须在动物模型中模拟人类 DCD HTx，其结果可能具有更高的翻译价值。此处描述的 DCD HTx 模型将允许研究人员密切模拟临床 DCD HTx，并提供通过对供体心脏和受体进行干预来减轻再灌注损伤的机会。受受体大鼠恢复后，可以从移植时间开始在不同时间间隔研究移植心脏的功能、组织病理学和免疫学。

研究方案

所有动物实验均按照机构指南和美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物第 86-23 号，2011 年修订）⁸ 进行。以下程序已获得弗吉尼亚联邦大学机构动物护理和使用委员会的批准。所有程序均按照 OSHA（职业安全与健康管理局）指南和推荐的无菌技术进行⁹。将 Sprague Dawley 大鼠饲养在 23 °C 的受控湿度下，进行 12 小时的暗/光循环。

1. 设置实验室

注意：分配一个专用空间，用手术显微镜进行无菌啮齿动物生存手术。保持手术室的环境温度为温暖;在手术和恢复过程中使用加热垫对于维持受体大鼠的体温至关重要。

1. 保持基本用品（材料表），包括注射器、0.9% 生理盐水 （NaCl）、麻醉剂（异氟烷、氯胺酮/甲苯噻嗪）、肝素、维库溴铵、保存液、冰桶和镇痛剂（丁丙诺啡缓释剂）储备充足并随时可用。
2. 将显微手术器械（图 1A、B）整齐地放在手术区域上。准备好快速灭菌套件，以便立即清洁受污染的重要器械。

2. 体内 大鼠 DCD 供体制备

1. 麻醉大鼠进行气管插管和颈动脉插管。在 3% 异氟醚室中镇静 Sprague Dawley 大鼠（8-12 周龄），然后用氯胺酮/甲苯噻嗪（100/10 mg/kg，肌肉注射）麻醉。
2. 为了暴露气管和右颈动脉，将完全麻醉的大鼠仰卧放置，并用酒精和聚维酮溶液清洁颈部和胸部的前部。做一个 V 形切口，V 形的峰值靠近中线大鼠的下巴，V 形的每个肢体都指向相应的肩膀。将皮肤与皮下组织分开，将皮肤翻转到胸部，露出颈部的带状肌肉（图 2A）。
   1. 通过用镊子分离中线带肌肉（胸骨突肌和胸骨舌骨）以暴露气管来插管大鼠（图 2B）。用 5-0 丝绸环绕气管，并通过部分分割气管环之间的肌肉组织来打开它。
   2. 将 14 G 血管导管插入气管并用 5-0 丝固定（图 2C）。将血管导管连接到呼吸机（1 mL/kg，每分钟 90 次呼吸）。
   3. 对于右颈动脉插管，确定颈总动脉（它平行于气管右侧并紧邻气管右侧），小心地将其隔离到颈部的整个长度，并用 5-0 丝系住远端（颅动脉）。
   4. 将止血钳连接到系带的自由端以进行牵引，以促进颈动脉插管。
   5. 动员颈动脉的最近端（朝向颈部底部）并使用血管止血钳夹住它。在手术显微镜下，使用微型虹膜剪刀在最远端的前部部分分开颈动脉，从而打开颈动脉。用 22 G 血管导管插管颈动脉，并用 5-0 丝带固定（图 2D）。
   6. 将三向旋流旋塞适配器连接到血管导管上，以便于将药物或心脏停搏溶液输送到颈动脉中，并连接到压力传感器以在 DCD 过程中监测心率和压力（图 2D）。当释放近端血管夹时，应注意血液的搏动回流。
   7. 固定后，将颈动脉导管连接到压力传感器，并输送肝素 （1,000 U/Kg） 和维库溴铵 （4 mg/kg）。
   8. DCD 过程的开始：让维库溴铵循环 1 分钟。观察动物痛苦的任何迹象，并在需要时提供额外的麻醉。停止呼吸机（缺氧/缺血）以启动 DCD 过程。观察是否有呼吸活动。
      注意： DCD 缺血时间从撤回呼吸机支持的时间开始。在大鼠中，25 分钟的缺血已被确定为导致显着但可逆损伤的最长时间⁷。压力追踪将表明，从 ~3.5 分钟通气支持中断的那一刻起，体循环压力下降到 50 mmHg 以下，该压力被认为不足以有效灌注心脏（图 3）。
3. 供体心脏采购：分配 ~4-7 分钟来采购心脏并进行冷心脏停搏。为了达到 25 分钟的目标缺血时间，请在终止通气支持后 18-21 分钟后开始采购心脏。
   注意： 根据执行采购的人员的经验修改采购时间的持续时间。
   1. 从剑突水平开始沿肋缘划分腹壁，然后将平行于胸骨的胸腔在两侧向上划分至锁骨，以进行双侧前胸切开术（图4A）。使用低放大倍率 （5x） 下的手术显微镜来促进此步骤。
   2. 将铰接在锁骨上的分裂胸壁朝向头部翻转，并用止血钳固定（图 4B）。
   3. 用 5-0 丝包围下腔静脉 （IVC），然后用靠近肝脏圆顶的微型剪刀将其部分分开（图 4C）。部分打开的 IVC 允许心脏停搏流出，因为它会使心脏右侧扩张。
   4. 解剖升主动脉和肺动脉 （PA） 之间的平面，然后用钝尖弯曲的镊子通过横窦隔离肺干到其分叉处。用微型剪刀小心地将靠近其分叉点的肺动脉分开（图 4C）。
   5. 用钝器夹层环绕主动脉弓。这是为了允许将一个小的直角血管夹放置在无名动脉起点远端的主动脉弓上。
   6. 在呼吸机终止后 25 分钟时，夹住主动脉弓并通过颈动脉导管手动输送心脏停搏（10 mL 威斯康星大学溶液在 4 °C 下，超过 2-3 分钟）（图 4D）。
   7. 使用微型剪刀，在主动脉弓之前远端劈开升主动脉（图 4E）。
   8. 用 5-0 丝将 IVC 系向心脏，然后向远端分开。
   9. 将肺静脉和上腔静脉 （SVC） 与 5-0 丝一起连接（图 4F）。由于这些扎带可容纳大量组织，因此手带比器械扎带更可取。用棉签轻轻地将心脏向下拉向腹部，以促进肺静脉结扎，而不会将心耳束入扎带中。
   10. 用微型虹膜剪刀分开肺静脉，收集心脏，并将其放入冰凉的生理盐水中（图 4G）。

3. 体内 大鼠 DCD 异位心脏移植

1. 在异氟醚室（3% 诱导）中镇静受体，将头发夹在腹部，并用聚维酮和酒精清洁该区域。不要对受体进行抗凝治疗;这将导致吻合口出血过多和移植失败。
2. 将大鼠仰卧在加热垫上。在大鼠和加热垫之间放置一个探针以监测温度。将大鼠的体温保持在 38 °C。 在大鼠腹部的两侧放置两个 50 mL 预灭菌的离心管，这些离心管装满温盐水或玻璃珠，以方便大鼠保持温暖。
3. 尽管采取了上述步骤，但如果体温降至 37.5 °C 以下，请提高室温 （RT），并使用高压灭菌的铝箔覆盖身体的所有暴露区域，以留出足够的区域进行腹部手术。
4. 通过鼻锥用 3% 异氟醚诱导全身麻醉，并逐渐降低至 2%。
5. 沿白线打开腹部（图 5A），并通过放置腹壁牵开器（图 5B）暴露工作空间。
6. 使用无菌棉签涂抹器，移动扩张的结肠或充盈的结肠，并将其放在作者左侧的温暖湿润的纱布中，定期用温热的 （38 °C） 盐水冲洗（图 5C）。将结肠移到一边为 DCD 心脏提供了更多空间，因为它们非常坚硬，需要额外的空间来容纳腹部。
7. 使用棉签用钝性解剖打开中线的腹膜后。暴露肾下主动脉和 IVC。
8. 使用无创儿科多角度血管夹，分离 3-5 毫米的肾下主动脉和 IVC 进行吻合（图 5D）。
9. 用安装在 1 cm³ 注射器上的 30 G 针头进入主动脉，注射器中装有混合了 100 单位肝素的生理盐水。用 0.2-0.3 mL 溶液冲洗（图 5E）。用无菌棉签涂抹器轻拍多余的溶液，因为肝素可能会被吸收并导致缝合线出血。
10. 使用微型剪刀，沿长轴打开主动脉以匹配供体主动脉的大小。此时 IVC 未打开，也不要尝试在 IVC 和主动脉之间创建一个平面;这会导致出血。
11. 在吻合过程中，供体心脏的正确方向至关重要 （图 5F).确定供体心脏的方向进行吻合，使右心室的前表面面向天花板，心尖指向作者的右侧，供体主动脉略低于肺动脉。这种方向导致肺动脉吻合处的张力较小。
    1. 主动脉吻合术：使用尖头针刀和精密镊子进行微血管吻合术。用 8-0 进行吻合将 4 mm 锥形针头固定在 0.3 mm 尖端持针器上，并移除针头驱动锁，以防止在锁定和解锁时发生意外的组织创伤。
    2. 在主动脉吻合口的 6 点钟位置放置一根支撑缝合线。这样做是为了提供对称的止血缝合线。然后，从 12 点钟位置开始吻合，在供体主动脉上从外到内，在受体主动脉上从内到外（图 6A、B）。仅保留 5-7 厘米的工作缝合线并截断其余部分。
    3. 逆时针移动，向 6 点钟位置短距离移动，然后通过将心脏向左翻转，以逆时方式完成吻合，直到 12 点钟位置（图 6C）。
    4. 打结前检查缝合线是否松动。
       注意：安全的吻合应该是对称的，并且必须无间隙地接近供体和受体内膜。
    5. 肺动脉吻合术：将肺动脉从主动脉中释放出来，并将其定向以吻合到 IVC，而不会扭曲。准备受者的血容量以充满供体的心脏，并通过注射 3-5 mL 皮下（颈背）生理盐水来避免低血压。
    6. 监测大鼠的呼吸模式，并在肺动脉吻合接近完成时将异氟醚从 2.0% 降低到 1.5%。
    7. 用微型虹膜剪刀相对于主动脉吻合打开头腔 IVC（图 6C）。使用 0.2-0.3 mL 生理盐水冲洗 IVC。会看到少量血栓;小心冲洗它们。
    8. 与主动脉吻合术不同，无需固定缝合即可开始肺吻合术;它会阻碍曝光。从 12 点钟位置开始，针头在供体肺动脉上从外向内移动，在受体 IVC 上从内向外移动。系好缝合线，首先顺时针完成后壁吻合。
    9. 到达 6 点钟位置后，继续顺时针缝合，直到到达 12 点钟位置，然后将其系在上一条领带的缝合短端。注意不要夹住吻合口，因为任何狭窄都会限制心脏的静脉引流。平均而言，完成两个吻合过程需要 30 分钟或更短的时间。
    10. 将小块可吸收止血剂放在吻合口上，以控制针孔出血。
    11. 松开血管，根据需要在针孔上添加更多可吸收止血剂（图 6E）。移植的心脏开始跳动，偶尔出现颤动，然后恢复有节奏的呼吸。只要心脏跳动且没有明显出血，就将可吸收止血剂留在原位 5 分钟。
    12. 一旦对止血感到满意（~3-5 分钟），使用无菌棉签涂抹器去除多余的可吸收止血剂，用生理盐水冲洗，然后将肠道送回腹腔（图 6F）。将网膜放在吻合口上以帮助止血。
    13. 首先关闭白线，然后闭合皮肤，在 13 毫米切割针上用 5-0 单乔线分两层封闭腹壁（图 6G，H）。

4. 恢复和监控

1. 腹部闭合完成后，将大鼠放在温暖的垫子上趴着进行恢复。通过鼻锥以 1% 的浓度继续异氟醚 5 分钟，然后停止。
2. 一旦自主呼吸正常，将大鼠移入干净的恢复笼中，并将其放在温暖的垫子上以继续恢复过程。大鼠的突然移动会导致出血风险或吻合口扭曲。手术开始前服用长效镇痛药极大地促进了恢复过程的顺利进行。

5. 对照跳动心脏的获取和移植

1. 购买对照跳动心脏供体 （CBD） 心脏作为对照，以评估在没有缺血的情况下供体心脏的质量。
   注意：CBD 供体经历了为 DCD 心脏描述的所有步骤，除了终止通气支持。CBD 心脏是在跳动时获得的，并完全由呼吸机支撑。心脏停搏的给药使心脏停止，并且获取和移植以与 DCD 心脏相同的方式完成。

6. 移植心脏功能评估：

1. 在心脏移植时间的预定间隔（24 小时至 14 天）内，麻醉受体大鼠（3% 吸入异氟醚），将其放在仰卧的暖垫上，并打开腹部切口以暴露移植的心脏。
2. 通过左心室的心尖放置球囊尖端导管，以测量产生的压力 （DP）、最大 +dP/dt 和最小 −dP/dt。
   注意：这里使用 PowerLab 站作为血压记录的数据采集系统。

结果

异位心脏移植后 24 小时至 14 天，可以重新打开腹部，并且可以暴露心脏以测量左心室产生的压力。将球囊尖端导管插入 DCD（或 CBD）心脏的左心室，以测量显影压力 （DP）、最大 +dP/dt 和最小 −dP/dt。 图 7 显示了移植后 24 小时与 CBD 心脏相比 DCD 心脏的预期 DP、+dP/dt 和 -dP/dt 的示例。与 CBD 心脏相比，DCD 心脏的 DP 显着降低，+dP/dt（max） 和 −dP/dt（m...

讨论

对于成功的 DCD 异位大鼠 HTx，建立细致而周到的实验设置至关重要。详细设置考虑了几个因素，包括 1） 选择年轻大鼠作为 DCD 供体，2） 使用异氟醚作为首选麻醉剂，3） 将心脏麻痹有效输送到供体心脏，4） 将供体的心脏储存在冰冷的溶液中，5） 在不影响腰血管的情况下限制腹部夹层，只暴露肾下主动脉和腔静脉， 6） 在手术期间和手术后保持受者的体温，7） 利用允...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 nylon suture polyamide monofilament	Aros Surgical	SP17A05N-45
5-0 silk suture	Surgical Specialties	SP116
8-0 monofilament suture	Aros Surgical	T06A08N14-13
Autoclave	Steris	Amsco Lab 250
BD Insulin Syringe with Detachable Needle 1 mL Syringes	Fisher Scientific	14-820-28
BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle) 10 mL Syringes	Fisher Scientific	14-823-16E
Belzer University of Wisconsin cold storage solution	Bridge to Life Northbrook IL USA		Adenosine 1.34 g/L, Allopurinol 0.136 g/L, Glutathione 0.922 g/L, Lactobionic Acid (as Lactone) 35.83 g/L, Magnesium Sulfate heptahydrate 1.23 g/L, Pentafraction 50 g/L, Potassium Hydroxide 5.61 g/L, Potassium Phosphate monobasic 3.4 g/L, Raffinose pentahydrate 17.83 g/L
Buprenorfin SR Lab	Zoopharm LLC
Debakey atraumatic pediatric multi-angle vascular clamp	Aesculap	F341T
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters 14 G	Fisher Scientific	14-841-10
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters 22 G	Fisher Scientific	14-841-20
Fogarty catheter size 4F	Edwands Lifesciences	120404F
Forceps with curved tips	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.228
Gaymar Heating pump	Braintree Scientific, Braintree, MA, USA	TP700
Germinator-500	Braintree Scientific
Heparin Sodium Injection, USP 1,000 U/mL	Pfizer	NDC 0069-0137-01
Iris micro-scissors with straight tips	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.5253
Isoflurane USP	Patterson Veterinary	NDC 14043070406
Ketamine HCl 100 mg/mL	Henry Schein	NDC 6745710810
Lidocaine HCl 2%	Aspen Veterinary	07-892-4325
McKesson General Medical 6IN Q-TIPS 2STER WOOD 100/PACK	Fisher Scientific	NC0650323	sterile cotton tip applicators
Micro-scissors, right angle and curved tips	Braintree Scientific	SC-MS 154
Needle holder	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.BSL158	with the lock mechanism removed
Normal Saline	Baxter Infusion supplies
PowerLab station	AD Instruments, Denver, CO		data acquisition system
Sodium Hydroxide/Hydrochloric Acid			adjust the solution to pH 7.4
Sprague Dawley rats			male, 8–16 weeks of age, <400 g in weight
Surgical Microscope	Leika	Model M525 F40
Surgicel	Ethicon		absorbable hemostat
Temperature probe Therma Waterproof Type T High Precision Thermocouple Meter	Thermoworks	THS-232-107
Tweezers with high precision point	Excelta	17-456-109
Vecuronium Bromide	Sigma-Aldrich	PHR1627	diluted in PBS for 100 mg/mL
Ventelite	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA
Xylazine 100 mg/mL	Pivetal Anased	NDC 04606675002