순환 사망 기증자 심장을 사용한 이종토피 쥐 심장 이식 모델

요약

여기에서는 순환 사멸 기증자 심장을 활용한 쥐 이소성 심장 이식의 준비 및 기술적 세부 사항에 대해 설명합니다.

초록

이 프로토콜의 목적은 순환기 사망(DCD) 기증자 심장 기증 후 기증으로 쥐 이종 심장 이식 모델을 설정하는 것입니다. 이 프로토콜에는 심장 기증자 설정과 수혜자 설정의 두 가지 설정이 있습니다. 심장 기증자 설정에서 Sprague Dawley 쥐는 마취, 기관 내 삽관 및 인공호흡을 합니다. 우측 경동맥은 헤파린과 마비제인 베쿠로늄-브로마이드를 전달하기 위해 캐뉼레이트됩니다. DCD 프로세스는 환기를 종료하여 시작됩니다. 20분 후, 심장이 노출되고 상완두분지 원위부의 대동맥이 고정됩니다. 인공호흡기 종료 후 25분이 지나면 얼음처럼 차가운 위스콘신 대학교(UW) 용액이 경동맥 카테터를 통해 관류되어 심장을 세척합니다. 심장은 대동맥, 폐동맥, 대정맥, 폐정맥을 분열하여 조달하고 UW 용액에 저장하여 이식합니다. 수용자 설정에서 Lewis 쥐는 이소플루란으로 마취됩니다. 서방형 부프레노르핀을 피하로 투여하여 수술 후 원활한 회복을 촉진합니다. 복부 정중선 절개를 통해 신하부 대동맥과 하대정맥을 분리하고 외상성 혈관 클램프로 고정합니다. 기증자 심장 대동맥과 폐동맥은 각각 수혜자 복부 대동맥과 대정맥에 봉합되며, 8-0으로 프롤렌. 심장을 재관류하기 위해 혈관 클램프를 제거합니다. 복벽을 닫고 쥐를 회복시킵니다. 설정된 간격(24시간 - 2주) 후에 수혜자 쥐를 마취하고 이식된 심장을 노출시킨 다음 정점을 통해 좌심실에 풍선 팁 카테터를 삽입하여 데이터 수집 시스템을 사용하여 개발된 압력과 dP/dt를 기록합니다. 심장 조직은 조직학, 면역학 또는 분자 분석을 위해 수집됩니다. 성공적인 DCD 기증자 쥐 심장 이식 모델은 DCD 기증자의 심장 이식 결과를 개선하기 위한 심장 보호 접근법에 대한 추가 연구를 가능하게 할 것입니다.

서문

심장 이식의 소동물 모델(HTx)은 이식된 심장에 영향을 미치는 병태생리학적 상태를 연구하는 연구를 수행하는 데 중요합니다. Oto와 Lindsey가 설명한 바와 같이 쥐 모델에서 이소성 HTx를 통해 연구자들은 허혈 및 재관류 조건에서 관찰된 병태생리학적 변화를 연구할 수 있었습니다¹. 전통적으로 이식을 위한 기증자 심장은 뇌사 후 기증(DBD) 기증자라고도 하는 박동 심장 기증자로부터 조달되었습니다. 그러나 HTx²를 필요로 하는 환자의 수가 불균형적으로 증가하고 있습니다. 보다 최근에는 순환기 사망 후 기증(DCD) 기증자라고도 하는 순환기 사망 기증자의 심장이 실험 환경에서 이식에 사용되었습니다³. DBD와 DCD 기증자 심장의 주요 차이점은 후자의 경우 심장이 다양한 허혈 기간을 겪기 때문에 일상적인 HTx 실습에서 사용할 수 없다는 것입니다.

앞서 설명한 쥐 이종성 HTx에 대한 문헌에서는 심장 박동 기증자의 상태만 활용했습니다 ^4,5,6. 이소성 DCD 심장 이식은 미묘한 변형이 필요하며, 미묘한 변형이 없으면 이식된 심장이 박동할 수 없다⁷. 이 프로토콜은 쥐에서 DCD HTx의 세련된 기술을 독자와 공유하는 것을 목표로 합니다. 전골적 심근허혈은 DCD 장기 기증에 선천적으로 존재합니다. 전신 심근허혈을 모방한 실험적 설정은 생체 외 설정⁵에서만 연구되었습니다. 생체 외 연구의 결과는 생체 내(DCD)와 생체 외 전반적 허혈 모델 간에 유의한 차이가 있기 때문에 DCD HTx 연구에 적용되지 않을 수 있습니다⁵. 체외 모델에서 재관류 심근허혈을 완화하기 위한 중재의 결과 또는 부족은 DCD HTx 모델에서 재현되지 않을 수 있습니다. 따라서 동물 모델에서 인간 DCD HTx를 시뮬레이션하는 것이 필수적이며, 그 결과는 더 높은 번역 가치를 가질 수 있습니다. 여기에 설명된 DCD HTx 모델을 통해 연구자는 임상 DCD HTx를 면밀히 시뮬레이션하고 기증자 심장과 수혜자 모두에 대한 중재를 통해 재관류 손상을 완화할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 수혜자 쥐가 회복되면 이식된 심장의 기능, 조직 병리학 및 면역학을 이식 시점부터 다양한 간격으로 연구할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 기관 지침과 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 발행한 실험 동물의 관리 및 사용 가이드(NIH 간행물 번호 86-23, 2011년 개정)⁸에 따라 수행되었습니다. 다음 절차는 버지니아 커먼웰스 대학교(Virginia Commonwealth University)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 모든 절차는 OSHA(산업안전보건청) 지침과 권장 멸균 기술⁹에 따라 수행되었습니다. Sprague Dawley 쥐는 23 ° C의 온도와 12 시간의 어둡고 밝은 주기에서 습도가 조절 된 상태에서 사육되었습니다.

1. 실습 설정

참고: 작동 현미경으로 멸균 설치류 생존 수술을 수행할 수 있는 전용 공간을 지정합니다. 수술실의 주변 온도를 따뜻하게 유지하십시오. 수술과 회복 과정 모두에 보온 패드를 사용하는 것은 수혜 쥐의 체온을 유지하는 데 필수적입니다.

1. 주사기, 생리식염수 0.9%(NaCl), 마취제(이소플루란, 케타민/자일라진), 헤파린, 베쿠로늄 브로마이드, 보존액, 얼음 양동이, 진통제(부프레노르핀 서방성)를 포함한 필수 용품(재료 목록)을 비축하고 쉽게 구할 수 있도록 보관하십시오.
2. 수술 부위에 미세 수술 기구(그림 1A, B)를 깔끔하게 놓습니다. 오염된 필수 기구를 즉시 세척할 수 있도록 플래시 멸균 키트를 쉽게 사용할 수 있도록 보관하십시오.

2. 생체 내 쥐 DCD 기증자 제제

1. 기관 삽관 및 경동맥 삽관을 위해 쥐를 마취합니다. Sprague Dawley 쥐(8-12주령)를 3% 이소플루란 챔버에서 진정시킨 다음 케타민/자일라진(100/10mg/kg, 근육 주사)으로 마취합니다.
2. 기관과 우측 경동맥을 노출시키기 위해 완전히 마취된 쥐를 누운 자세로 놓고 알코올과 포비돈 용액으로 목과 가슴 앞쪽을 청소합니다. V의 봉우리가 정중선의 쥐의 턱에 가깝고 V의 각 팔다리가 해당 어깨를 가리키도록 V자 절개를 만듭니다. 피하 조직에서 피부를 분리하고 피부를 가슴으로 뒤집어 목의 스트랩 근육을 노출시킵니다(그림 2A).
   1. 기관을 노출시키기 위해 집게로 정중선 스트랩 근육(흉골유방과 흉골)을 분리하여 쥐를 삽관합니다(그림 2B). 기관을 5-0 실크로 둘러싸고 기관 고리 사이의 근육 조직을 부분적으로 나누어 엽니다.
   2. 14G의 혈관을 기관에 삽입하고 5-0 실크로 고정합니다(그림 2C). 혈관을 인공호흡기에 연결합니다(1호흡/분에서 90mL/kg).
   3. 우측 경동맥 캐뉼레이션의 경우, 총경동맥(기관의 오른쪽과 평행하게 바로 오른쪽에 있음)을 확인하고, 조심스럽게 목 전체 길이로 분리한 다음 원위(두개골) 끝을 5-0 실크로 묶습니다.
   4. 경동맥의 캐뉼레이션을 용이하게 하기 위해 견인을 위해 넥타이의 자유 끝에 지혈제를 부착합니다.
   5. 경동맥의 가장 근위부(목 아래쪽 방향)를 동원하고 혈관 지혈을 사용하여 고정합니다. 작동 현미경 아래에서 마이크로 홍채 가위를 사용하여 경동맥을 가장 말단의 앞쪽으로 부분적으로 나누어 경동맥을 엽니다. 22G 혈관류로 경동맥을 캐뉼레이션하고 5-0 실크 넥타이로 고정합니다(그림 2D).
   6. 약물 또는 심정지 용액을 경동맥으로 쉽게 전달할 수 있도록 혈관에 3방향 흐름 스톱콕 어댑터를 부착하고, 압력 센서에 연결하여 DCD 프로세스 중 심박수와 압력을 모니터링합니다(그림 2D). 근위 혈관 클램프가 해제될 때 박동성 혈액의 역류를 알아차려야 합니다.
   7. 고정되면 경동맥 카테터를 압력 센서에 연결하고 헤파린(1,000 U/Kg)과 베쿠로늄 브로마이드(4 mg/kg)를 전달합니다.
   8. DCD 프로세스 시작: 베쿠로늄 브로마이드를 1분 동안 순환시킵니다. 동물이 고통받는 징후가 있는지 관찰하고 필요한 경우 추가 마취를 제공합니다. 인공호흡기(저산소증/허혈)를 중지하여 DCD 프로세스를 시작합니다. 호흡기 활동이 없는지 관찰하십시오.
      참고: DCD 허혈 시간은 인공호흡기 지원이 중단된 시점부터 시작됩니다. 쥐의 경우, 허혈 25분은 심각하지만 되돌릴 수 있는 손상을 초래하는 최대 시간으로 확인되었다⁷. 압력 추적은 ~3.5분에 인공호흡 지원이 중단되는 순간부터 전신 압력이 50mmHg 미만으로 떨어지는 것을 보여주며, 이 압력은 심장을 효과적으로 관류하기에 충분하지 않은 것으로 간주됩니다(그림 3).
3. 기증자 심장 조달: 심장을 조달하고 차가운 심마비를 투여하기 위해 ~4-7분을 할당합니다. 목표 허혈 시간인 25분을 달성하려면 인공호흡 지원이 종료된 후 18-21분 후에 심장 조달을 시작합니다.
   참고: 조달을 수행하는 사람의 경험에 따라 조달 시간을 수정합니다.
   1. xiphoid 수준에서 시작하여 늑골 가장자리를 따라 복벽을 분할한 다음 쇄골까지 양쪽의 흉골과 평행하게 흉곽을 나누어 양측 전방 개흉술을 수행합니다(그림 4A). 이 단계를 용이하게 하기 위해 저배율(5x)에서 작동하는 현미경을 사용하십시오.
   2. 쇄골에 경첩이 달린 갈라진 흉벽을 머리 쪽으로 뒤집고 지혈로 고정합니다(그림 4B).
   3. 하대정맥(IVC)을 5-0 실크로 둘러싼 다음 간 돔에 가까운 마이크로 가위로 부분적으로 나눕니다(그림 4C). 부분적으로 열린 IVC는 심장의 오른쪽을 구부리기 때문에 심정지의 출구를 허용합니다.
   4. 상행 대동맥과 폐동맥(PA) 사이의 평면을 절개한 다음 끝이 뭉툭한 구부러진 집게가 있는 횡동 동을 통해 폐줄기를 분기점으로 분리합니다. 마이크로 가위를 사용하여 분기점에 가까운 폐동맥을 조심스럽게 나눕니다(그림 4C).
   5. 뭉툭한 박리로 대동맥궁을 둘러쌉니다. 이것은 작은 직각 혈관 클램프가 대동맥궁을 가로질러 innominate artery의 원점까지 배치될 수 있도록 하기 위한 것입니다.
   6. 인공호흡기 종료 후 25분 지점에서 대동맥궁을 고정하고 경동맥 카테터를 통해 심정지 상태(4°C에서 2-3분에 걸쳐 위스콘신 대학교 용액 10mL)를 수동으로 전달합니다(그림 4D).
   7. 마이크로 가위를 사용하여 상행 대동맥을 대동맥궁 원위부로 분열합니다(그림 4E).
   8. IVC를 심장 쪽으로 5-0 실크로 묶고 원위부로 나눕니다.
   9. 폐정맥과 상대정맥(SVC)을 5-0 실크로 접합합니다(그림 4F). 이러한 넥타이는 많은 양의 조직을 보유하기 때문에 악기 넥타이보다 핸드 타이가 선호됩니다. 면봉으로 심장을 복부 쪽으로 부드럽게 당겨 심방 부속기를 넥타이에 묶지 않고 폐정맥 결찰을 용이하게 합니다.
   10. 마이크로 홍채 가위로 폐정맥을 나누고 심장을 채취하여 얼음처럼 차가운 생리식염수에 넣습니다(그림 4G).

3. 생체 내 쥐 DCD 이소성 심장 이식

1. 이소플루란 챔버(3% 유도)에서 수혜자를 진정시키고, 복부 위의 머리카락을 자르고, 포비돈과 알코올로 해당 부위를 청소합니다. 수혜자를 항응고시키지 마십시오. 이것은 문합으로 인한 과도한 출혈과 이식 실패로 이어질 것입니다.
2. 쥐를 누운 자세로 가열 패드에 놓습니다. 쥐와 가열 패드 사이에 프로브를 놓아 온도를 모니터링합니다. 쥐의 체온을 38°C로 유지하십시오. 따뜻한 식염수 또는 유리 구슬로 채워진 50mL 사전 멸균 원심분리기 튜브 2개를 쥐의 복부 양쪽에 놓아 쥐를 따뜻하게 유지할 수 있도록 합니다.
3. 위의 단계에도 불구하고 체온이 37.5°C 이하로 떨어지면 실온(RT)을 높이고 노출된 모든 신체 부위를 오토클레이브 알루미늄 호일로 덮어 복부 수술을 할 수 있는 충분한 면적만 남겨둡니다.
4. 콧방울을 통해 3% 이소플루란으로 전신 마취를 유도하고 점차 2%로 낮춥니다.
5. linea-alba를 따라 복부를 열고(그림 5A) 복벽 견인기를 배치하여 작업 공간을 노출시킵니다(그림 5B).
6. 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 확장된 결장 또는 전체 결장을 이동하고 따뜻하고 촉촉한 거즈에 넣어 작업자의 왼쪽에 놓고 주기적으로 따뜻한(38°C) 식염수를 세척합니다(그림 5C). 결장을 옆으로 옮기면 DCD 심장이 매우 뻣뻣하고 복부에 수용할 수 있는 추가 공간이 필요하기 때문에 DCD 심장에 더 많은 공간을 제공할 수 있습니다.
7. 면봉을 사용하여 무딘 해부로 정중선의 후복막을 엽니다. 대동맥과 IVC를 노출시킵니다.
8. 무외상성 소아 다각도 혈관 클램프를 사용하여 문합을 위해 신장 하부 대동맥과 IVC를 3-5mm 분리합니다(그림 5D).
9. 헤파린 100단위와 섞인 생리식염수로 채워진 1cm³ 주사기에 장착된 30G 바늘로 대동맥에 들어갑니다. 용액 0.2-0.3mL로 플러시합니다(그림 5E). 헤파린이 흡수되어 봉합선에서 출혈을 유발할 수 있으므로 멸균 면 팁 어플리케이터로 여분의 용액을 두드려냅니다.
10. 마이크로 가위를 사용하여 긴 축을 따라 대동맥을 열어 공여자의 대동맥 크기에 맞춥니다. 이 시점에서 IVC는 열리지 않으며 IVC와 대동맥 사이에 평면을 만들려고 시도하지 마십시오. 이것은 출혈로 이어질 것입니다.
11. 문합 중 기증자의 심장 방향이 적절하게 잡히는 것은 매우 중요합니다(그림 5F). 문합을 위해 기증자 심장의 방향을 정하여 우심실의 전방면이 천장을 향하고, 정점이 작업자의 오른쪽을 가리키며, 기증자 대동맥이 폐동맥보다 약간 낮도록 합니다. 이 방향은 폐동맥 문합에 대한 긴장을 줄이는 결과를 낳습니다.
    1. 대동맥 문합: 미세 혈관 문합을 위해 뾰족한 팁 바늘 드라이버와 정밀 핀셋을 사용합니다. 8-0으로 문합 수행 니들 드라이버 잠금 장치가 제거된 0.3mm 팁 바늘 홀더에 로드된 테이퍼드 4mm 바늘의 모노필라멘트 봉합사로 잠금 및 잠금 해제 시 우발적인 조직 외상을 방지합니다.
    2. 대동맥 문합부의 6시 위치에 스테이 봉합사를 놓습니다. 이것은 대칭 및 지혈 봉합 라인을 제공하기 위해 수행됩니다. 그런 다음 12시 방향에서 공여자 대동맥의 바깥쪽에서 안쪽으로, 수용자 대동맥의 안쪽에서 바깥쪽으로 문합을 시작합니다(그림 6A, B). 작업 봉합사를 5-7cm만 유지하고 나머지는 자릅니다.
    3. 시계 반대 방향으로 이동하여 6시 위치를 향해 짧은 거리를 이동한 다음 심장을 왼쪽으로 뒤집어 12시 위치까지 시계 반대 방향으로 문합을 완료합니다(그림 6C).
    4. 묶기 전에 느슨한 봉합사 라인이 있는지 확인하십시오.
       참고: 안전한 문합은 대칭이어야 하며 틈 없이 기증자와 수혜자 인피를 근사화해야 합니다.
    5. 폐동맥 문합: 대동맥에서 폐동맥을 분리하고 비틀림 없이 IVC로 문합할 수 있도록 방향을 잡습니다. 기증자의 심장을 채우기 위해 수혜자의 혈액량을 준비하고 3-5mL의 피하(목덜미) 생리식염수를 주사하여 저혈압을 예방합니다.
    6. 쥐의 호흡 패턴을 모니터링하고 폐동맥 문합이 거의 완료됨에 따라 이소플루란을 2.0%에서 1.5%로 줄입니다.
    7. 마이크로 홍채 가위로 대동맥 문합과 관련하여 IVC 두부를 엽니다(그림 6C). 0.2-0.3mL의 식염수를 사용하여 IVC를 세척합니다. 소수의 혈전이 보일 것입니다. 조심스럽게 씻어내십시오.
    8. 대동맥 문합과 달리 스테이 봉합사 없이 폐 문합을 시작하십시오. 노출을 방해합니다. 12시 방향에서 바늘이 기증자 폐동맥의 바깥쪽에서 안쪽으로, 수혜자 IVC의 안쪽에서 바깥쪽으로 바늘이 움직이면서 시작합니다. 봉합사를 묶고 먼저 시계 방향으로 뒷벽 문합을 완료합니다.
    9. 6시 위치에 있으면 12시 위치에 도달할 때까지 시계 방향으로 계속 봉합한 다음 이전 타이에서 봉합사의 짧은 끝에 묶습니다. 문합이 좁아지면 심장에서 정맥 배출이 제한되므로 문합을 조이지 않도록 주의하십시오. 평균적으로 두 문합을 모두 완료하는 데 30분 이하가 소요됩니다.
    10. 바늘 구멍에서 출혈을 억제하기 위해 문합 위에 흡수성 지혈의 작은 조각을 놓습니다.
    11. 혈관을 풀고 필요에 따라 바늘 구멍 위에 더 많은 흡수성 지혈기를 추가합니다(그림 6E). 이식된 심장은 리드미컬한 호흡을 재개하기 전에 가끔 세동과 함께 박동하기 시작합니다. 심장이 뛰고 명백한 출혈이 없는 한 흡수성 지혈제를 5분 동안 그대로 두십시오.
    12. 지혈이 만족스러우면(~3-5분) 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 과도한 흡수성 지혈기를 제거하고 식염수로 세척한 다음 장을 복강으로 되돌립니다(그림 6F). 지혈을 돕기 위해 문합 위에 망막을 놓습니다.
    13. 13mm 절단 바늘에 5-0 모노크릴로 두 층으로 된 복벽을 먼저 리네아 알바를 닫은 다음 피부를 닫습니다(그림 6G, H).

4. 복구 및 모니터링

1. 복부 폐쇄가 완료되면 회복을 위해 쥐를 따뜻한 패드에 엎드려 눕힙니다. 콧방울을 통해 1%로 5분 동안 이소플루란을 계속 투여한 다음 중지합니다.
2. 자발적 호흡이 규칙적으로 이루어지면 쥐를 깨끗한 회복 케이지로 옮기고 따뜻한 패드에 올려 놓고 회복 과정을 계속합니다. 쥐의 갑작스런 움직임은 출혈 위험이나 문합에 뒤틀림을 초래할 수 있습니다. 수술 시작 전에 투여되는 지속성 진통제는 원활한 회복 과정을 크게 촉진합니다.

5. 통제 박동 심장의 조달 및 이식

1. 허혈이 없는 경우 기증자 심장의 품질을 평가하기 위한 대조군으로 대조군 심장 기증자(CBD) 심장을 조달합니다.
   참고: CBD 기증자는 인공호흡 지원 종료를 제외하고 DCD 심장에 대해 설명된 모든 단계를 거칩니다. CBD 심장은 박동하는 동안 조달되고 인공 호흡기로 완전히지지됩니다. 심정지 투여는 심장을 정지시키며, DCD 심장에 대해 설명된 것과 동일한 방식으로 조달 및 이식이 완료됩니다.

6. 이식된 심장 기능 평가:

1. 심장 이식 시점부터 미리 정해진 간격(24시간에서 14일)으로 수혜자 쥐(3% 흡입 이소플루란)를 마취하고 따뜻한 패드에 올려 놓고 복부 절개를 열어 이식된 심장을 노출시킵니다.
2. 좌심실의 정점을 통해 풍선 팁 카테터를 삽입하여 개발된 압력(DP), 최대 +dP/dt 및 최소 -dP/dt를 측정합니다.
   알림: 여기에서 PowerLab 스테이션은 혈압 기록을 위한 데이터 수집 시스템으로 사용되었습니다.

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결과

이종성 심장 이식 후 24시간에서 14일 후에 복부를 다시 열 수 있으며 심장을 노출시켜 좌심실에서 발생하는 압력을 측정할 수 있습니다. DCD(또는 CBD) 심장의 좌심실에 풍선 팁 카테터를 삽입하여 개발된 압력(DP), 최대 +dP/dt 및 최소 -dP/dt를 측정합니다. 그림 7 은 이식 24시간 후 CBD 심장과 비교하여 DCD 심장의 예상 DP, +dP/dt 및 -dP/dt의 예를 보여줍니다. C...

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토론

성공적인 DCD 이종성 쥐 HTx를 위해서는 실험의 세심하고 사려 깊은 설정이 확립되는 것이 중요합니다. 세부 설정은 1) 어린 쥐를 DCD 기증자로 선택, 2) 이소플루란을 마취제로 선택, 3) 기증자의 심장에 심정지를 효과적으로 전달, 4) 기증자의 심장을 얼음처럼 차가운 용액에 보관, 5) 요추 혈관을 손상시키지 않고 복부 박리를 제한하여 대동맥과 대정맥만 노출시키고, 6) 수?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 nylon suture polyamide monofilament	Aros Surgical	SP17A05N-45
5-0 silk suture	Surgical Specialties	SP116
8-0 monofilament suture	Aros Surgical	T06A08N14-13
Autoclave	Steris	Amsco Lab 250
BD Insulin Syringe with Detachable Needle 1 mL Syringes	Fisher Scientific	14-820-28
BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle) 10 mL Syringes	Fisher Scientific	14-823-16E
Belzer University of Wisconsin cold storage solution	Bridge to Life Northbrook IL USA		Adenosine 1.34 g/L, Allopurinol 0.136 g/L, Glutathione 0.922 g/L, Lactobionic Acid (as Lactone) 35.83 g/L, Magnesium Sulfate heptahydrate 1.23 g/L, Pentafraction 50 g/L, Potassium Hydroxide 5.61 g/L, Potassium Phosphate monobasic 3.4 g/L, Raffinose pentahydrate 17.83 g/L
Buprenorfin SR Lab	Zoopharm LLC
Debakey atraumatic pediatric multi-angle vascular clamp	Aesculap	F341T
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters 14 G	Fisher Scientific	14-841-10
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters 22 G	Fisher Scientific	14-841-20
Fogarty catheter size 4F	Edwands Lifesciences	120404F
Forceps with curved tips	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.228
Gaymar Heating pump	Braintree Scientific, Braintree, MA, USA	TP700
Germinator-500	Braintree Scientific
Heparin Sodium Injection, USP 1,000 U/mL	Pfizer	NDC 0069-0137-01
Iris micro-scissors with straight tips	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.5253
Isoflurane USP	Patterson Veterinary	NDC 14043070406
Ketamine HCl 100 mg/mL	Henry Schein	NDC 6745710810
Lidocaine HCl 2%	Aspen Veterinary	07-892-4325
McKesson General Medical 6IN Q-TIPS 2STER WOOD 100/PACK	Fisher Scientific	NC0650323	sterile cotton tip applicators
Micro-scissors, right angle and curved tips	Braintree Scientific	SC-MS 154
Needle holder	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.BSL158	with the lock mechanism removed
Normal Saline	Baxter Infusion supplies
PowerLab station	AD Instruments, Denver, CO		data acquisition system
Sodium Hydroxide/Hydrochloric Acid			adjust the solution to pH 7.4
Sprague Dawley rats			male, 8–16 weeks of age, <400 g in weight
Surgical Microscope	Leika	Model M525 F40
Surgicel	Ethicon		absorbable hemostat
Temperature probe Therma Waterproof Type T High Precision Thermocouple Meter	Thermoworks	THS-232-107
Tweezers with high precision point	Excelta	17-456-109
Vecuronium Bromide	Sigma-Aldrich	PHR1627	diluted in PBS for 100 mg/mL
Ventelite	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA
Xylazine 100 mg/mL	Pivetal Anased	NDC 04606675002