Ein heterotopes Rattenherztransplantationsmodell unter Verwendung von Spenderherzen mit Kreislauftod

Zusammenfassung

Im Folgenden beschreiben wir die Vorbereitung und die technischen Details der murinen heterotopen Herztransplantation mit einem zirkulatorischen Spenderherzen.

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein heterotopes Herztransplantationsmodell für Ratten mit Spende von Spenderherzen nach Kreislauftod (DCD) einzurichten. Es gibt zwei Setups für dieses Protokoll: die Einrichtung des Herzspenders und die Einrichtung des Empfängers. Bei der Herzspendereinrichtung werden Sprague Dawley-Ratten anästhesiert, endotracheal intubiert und beatmet. Die rechte Halsschlagader wird kanüliert, um Heparin und das Lähmungsmittel Vecuronium-bromid abzugeben. Der DCD-Prozess wird durch das Beenden der Lüftung eingeleitet. Nach 20 min wird das Herz freigelegt und die Aorta distal zum brachiozephalen Ast geklemmt. 25 Minuten nach Beendigung des Beatmungsgeräts wird eiskalte Lösung der University of Wisconsin (UW) durch den Karotiskatheter perfundiert, um das Herz zu spülen. Das Herz wird durch Teilung der Aorta, der Lungenarterie, der Hohlvenen und der Lungenvenen gewonnen und zur Implantation in UW-Lösung gelagert. Im Empfänger-Setup wird die Lewis-Ratte mit Isofluran betäubt. Buprenorphin mit langsamer Freisetzung wird subkutan verabreicht, um eine reibungslose postoperative Genesung zu ermöglichen. Durch einen Mittellinienschnitt werden die infrarenale Aorta und die untere Hohlvene isoliert und mit einer atraumatischen Gefäßklemme abgeklemmt. Die Herzaorta und die Lungenarterie des Spenders werden mit der Bauchaorta bzw. der Hohlvene des Empfängers vernäht, wobei ein laufendes 8-0 Prolen. Die Gefäßklemme wird entfernt, um das Herz zu reperfundieren. Die Bauchdecke wird geschlossen und die Ratte geborgen. Nach einem festgelegten Intervall (24 h bis 2 Wochen) wird die Empfängerratte anästhesiert, das transplantierte Herz freigelegt und ein Ballonspitzenkatheter über die Spitze in den linken Ventrikel eingeführt, um den entwickelten Druck und dP/dt mit Hilfe eines Datenerfassungssystems aufzuzeichnen. Das Herzgewebe wird für die Histologie, Immunologie oder molekulare Analyse entnommen. Ein erfolgreiches DCD-Spenderherztransplantationsmodell für Ratten wird weitere Studien zu den kardioprotektiven Ansätzen zur Verbesserung der Herztransplantationsergebnisse von DCD-Spendern ermöglichen.

Einleitung

Ein Kleintiermodell für die Herztransplantation (HTx) ist entscheidend für die Durchführung von Forschungen zur Untersuchung der pathophysiologischen Bedingungen, die das transplantierte Herz beeinflussen. Heterotopes HTx in einem Mausmodell, wie es von Oto und Lindsey beschrieben wurde, ermöglichte es den Forschern, die pathophysiologischen Veränderungen zu untersuchen, die bei den Bedingungen von Ischämie und Reperfusion beobachtet wurden¹. Traditionell wurden Spenderherzen für die Transplantation von Spendern mit schlagendem Herzen beschafft, die auch als Spender nach Hirntod (DBD) bezeichnet werden. Die Zah....

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, der von den National Institutes of Health veröffentlicht wurde (NIH-Veröffentlichung Nr. 86-23, überarbeitet 2011)⁸. Die folgenden Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Virginia Commonwealth University genehmigt. Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der OSHA (Occupational Safety and Health Administration) und den empfohlenen sterilen Techniken durchgeführt⁹. Die Sprague Dawley-Ratten wurden unt....

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Ergebnisse

24 h bis 14 Tage nach der heterotopen Herztransplantation kann der Bauch wieder geöffnet und das Herz freigelegt werden, um den vom linken Ventrikel entwickelten Druck zu messen. Ein Ballonkatheter wird in den linken Ventrikel des DCD- (oder CBD-) Herzens eingeführt, um den entwickelten Druck (DP), den maximalen +dP/dt und den minimalen -dP/dt-Wert zu messen. Abbildung 7 zeigt ein Beispiel für die erwartete DP, +dP/dt und -dP/dt eines DCD-Herzens im Vergl.......

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Diskussion

Für eine erfolgreiche DCD-heterotope Ratte HTx ist es entscheidend, dass ein sorgfältiger und durchdachter Aufbau des Experiments etabliert wird. Der detaillierte Aufbau berücksichtigt mehrere Faktoren, darunter 1) die Auswahl junger Ratten als DCD-Spender, 2) die Verwendung von Isofluran als Anästhetikum der Wahl, 3) die effektive Abgabe von Kardioplegie an das Spenderherz, 4) die Lagerung des Spenderherzens in eiskalter Lösung, 5) die Begrenzung der Bauchdissektion ohne Beeinträc.......

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 nylon suture polyamide monofilament	Aros Surgical	SP17A05N-45
5-0 silk suture	Surgical Specialties	SP116
8-0 monofilament suture	Aros Surgical	T06A08N14-13
Autoclave	Steris	Amsco Lab 250
BD Insulin Syringe with Detachable Needle 1 mL Syringes	Fisher Scientific	14-820-28
BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle) 10 mL Syringes	Fisher Scientific	14-823-16E
Belzer University of Wisconsin cold storage solution	Bridge to Life Northbrook IL USA		Adenosine 1.34 g/L, Allopurinol 0.136 g/L, Glutathione 0.922 g/L, Lactobionic Acid (as Lactone) 35.83 g/L, Magnesium Sulfate heptahydrate 1.23 g/L, Pentafraction 50 g/L, Potassium Hydroxide 5.61 g/L, Potassium Phosphate monobasic 3.4 g/L, Raffinose pentahydrate 17.83 g/L
Buprenorfin SR Lab	Zoopharm LLC
Debakey atraumatic pediatric multi-angle vascular clamp	Aesculap	F341T
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters 14 G	Fisher Scientific	14-841-10
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters 22 G	Fisher Scientific	14-841-20
Fogarty catheter size 4F	Edwands Lifesciences	120404F
Forceps with curved tips	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.228
Gaymar Heating pump	Braintree Scientific, Braintree, MA, USA	TP700
Germinator-500	Braintree Scientific
Heparin Sodium Injection, USP 1,000 U/mL	Pfizer	NDC 0069-0137-01
Iris micro-scissors with straight tips	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.5253
Isoflurane USP	Patterson Veterinary	NDC 14043070406
Ketamine HCl 100 mg/mL	Henry Schein	NDC 6745710810
Lidocaine HCl 2%	Aspen Veterinary	07-892-4325
McKesson General Medical 6IN Q-TIPS 2STER WOOD 100/PACK	Fisher Scientific	NC0650323	sterile cotton tip applicators
Micro-scissors, right angle and curved tips	Braintree Scientific	SC-MS 154
Needle holder	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.BSL158	with the lock mechanism removed
Normal Saline	Baxter Infusion supplies
PowerLab station	AD Instruments, Denver, CO		data acquisition system
Sodium Hydroxide/Hydrochloric Acid			adjust the solution to pH 7.4
Sprague Dawley rats			male, 8–16 weeks of age, <400 g in weight
Surgical Microscope	Leika	Model M525 F40
Surgicel	Ethicon		absorbable hemostat
Temperature probe Therma Waterproof Type T High Precision Thermocouple Meter	Thermoworks	THS-232-107
Tweezers with high precision point	Excelta	17-456-109
Vecuronium Bromide	Sigma-Aldrich	PHR1627	diluted in PBS for 100 mg/mL
Ventelite	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA
Xylazine 100 mg/mL	Pivetal Anased	NDC 04606675002