Un modèle de transplantation de cœur de rat hétérotopique utilisant des cœurs de donneurs à mort circulatoire

Résumé

Ici, nous décrivons la préparation et les détails techniques de la transplantation cardiaque hétérotopique murine à l’aide d’un cœur de donneur de mort circulatoire.

Résumé

L’objectif de ce protocole est de mettre en place un modèle de transplantation cardiaque hétérotopique chez le rat avec don de cœurs de donneurs après mort circulatoire (DCD). Il existe deux configurations pour ce protocole : la configuration du donneur de cœur et la configuration du receveur. Dans la configuration du donneur de cœur, les rats Sprague Dawley sont anesthésiés, intubés par endotrachée et ventilés. L’artère carotide droite est canulée pour libérer l’héparine et l’agent paralysant vecuronium-bromure. Le processus DCD est initié par la fin de la ventilation. Après 20 min, le cœur est exposé et l’aorte distale à la branche brachiocéphale est clampée. À 25 minutes de l’arrêt du ventilateur, une solution glacée de l’Université du Wisconsin (UW) est perfusée à travers le cathéter carotidien pour rincer le cœur. Le cœur est obtenu en divisant l’aorte, l’artère pulmonaire, les veines caves et les veines pulmonaires et stocké dans une solution UW pour l’implantation. Dans la configuration du receveur, le rat Lewis est anesthésié avec de l’isoflurane. La buprénorphine à libération lente est administrée par voie sous-cutanée pour faciliter une récupération postopératoire en douceur. Par une incision abdominale médiane, l’aorte infrarénale et la veine cave inférieure sont isolées et clampées à l’aide d’une pince vasculaire atraumatique. L’aorte cardiaque et l’artère pulmonaire du donneur sont suturées à l’aorte abdominale et à la veine cave receveuses, respectivement, avec un 8-0 Prolène. La pince vasculaire est retirée pour reperfuser le cœur. La paroi abdominale est fermée et le rat est rétabli. Après un intervalle déterminé (24 h à 2 semaines), le rat receveur est anesthésié, le cœur transplanté est exposé et un cathéter à ballonnet est inséré dans le ventricule gauche via l’apex pour enregistrer la pression développée et le dP/dt à l’aide d’un système d’acquisition de données. Le tissu cardiaque est prélevé à des fins d’histologie, d’immunologie ou d’analyse moléculaire. Un modèle réussi de transplantation cardiaque de rat donneur de DDC permettra d’autres études sur les approches cardioprotectrices pour améliorer les résultats de la transplantation cardiaque chez les donneurs de DDC.

Introduction

Un petit modèle animal de transplantation cardiaque (HTx) est essentiel pour mener des recherches sur les conditions physiopathologiques qui affectent le cœur transplanté. La HTx hétérotopique dans un modèle murin, telle que décrite par Oto et Lindsey, a permis aux chercheurs d’étudier les changements physiopathologiques observés dans les conditions d’ischémie et de reperfusion¹. Traditionnellement, les cœurs de donneurs pour la transplantation ont été obtenus à partir de donneurs à cœur battant, également connus sous le nom de donneurs après la mort cérébrale (DBD) ; cependant, il y a eu une augmentation disproportionnée du nombre de patients ayant besoin de HTx². Plus récemment, des cœurs de donneurs de mort circulatoire, également connus sous le nom de donneurs de mort circulatoire (DCD), ont été utilisés pour la transplantation dans des contextes expérimentaux³. La principale distinction entre les cœurs de donneurs DBD et DCD est que, dans ce dernier, les cœurs sont soumis à des durées variables d’ischémie, ce qui exclut leur utilisation dans la pratique régulière de HTx.

La littérature précédemment décrite sur l’HTx hétérotopique murin n’a utilisé que des conditions de donneur de cœur battant ^4,5,6. La transplantation cardiaque hétérotopique DCD nécessite des modifications subtiles, sans lesquelles le cœur transplanté ne battra pas⁷. Ce protocole vise à partager avec les lecteurs une technique raffinée de DCD HTx chez le rat. L’ischémie myocardique globale est inhérente au don d’organes DCD. Un dispositif expérimental imitant l’ischémie myocardique globale n’a été étudié que dans la configuration ex vivo ⁵. Les résultats des études ex vivo peuvent ne pas s’appliquer aux travaux sur le DCD HTx, car il existe des différences significatives entre les modèles d’ischémie globale in vivo (DCD) et ex vivo ⁵. Les résultats, ou l’absence de résultats, des interventions visant à atténuer l’ischémie myocardique de reperfusion dans des modèles ex vivo peuvent ne pas être reproductibles dans le modèle DCD HTx. Par conséquent, il est essentiel de simuler le DCD HTx humain dans un modèle animal, dont les résultats peuvent avoir une valeur translationnelle plus élevée. Le modèle DCD HTx décrit ici permettra au chercheur de simuler étroitement le DCD HTx clinique et offrira la possibilité d’atténuer les lésions de reperfusion grâce à des interventions à la fois dans le cœur du donneur et chez le receveur. Lors de la récupération du rat receveur, la fonction cardiaque, l’histopathologie et l’immunologie du cœur transplanté peuvent être étudiées à des intervalles variables à partir du moment de la transplantation.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux directives institutionnelles et au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publié par les National Institutes of Health (publication NIH n° 86-23, révisée en 2011)⁸. Les procédures suivantes ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Commonwealth de Virginie. Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives de l’OSHA (Occupational Safety and Health Administration) et aux techniques stériles recommandées⁹. Les rats Sprague Dawley ont été logés dans un environnement humide contrôlé à une température de 23 °C et pendant 12 heures avec des cycles sombre/lumière.

1. Configuration du laboratoire

REMARQUE : Attribuez un espace dédié pour effectuer des chirurgies de survie stériles de rongeurs avec un microscope opératoire. Maintenir la température ambiante de la salle d’opération à un niveau chaud ; L’utilisation de coussins chauffants à la fois pour la chirurgie et le processus de récupération est essentielle pour maintenir la température corporelle du rat receveur.

1. Gardez les fournitures essentielles (table des matières), y compris les seringues, la solution saline normale à 0,9 % (NaCl), les agents anesthésiques (isoflurane, kétamine/xylazine), l’héparine, le bromure de vecuronium, la solution de conservation, un seau à glace et l’agent analgésique (buprénorphine à libération lente) en stock et à portée de main.
2. Posez soigneusement les instruments microchirurgicaux (Figure 1A, B) sur le champ opératoire. Gardez un kit de stérilisation flash à portée de main pour nettoyer immédiatement les instruments essentiels contaminés.

2. Préparation in vivo du donneur de DCD chez le rat

1. Anesthésier le rat pour l’intubation trachéale et la canulation carotidienne. Endormir le rat Sprague Dawley (âgé de 8 à 12 semaines) dans une chambre d’isoflurane à 3 %, puis l’anesthésier avec de la kétamine/xylazine (100/10 mg/kg, intramusculaire).
2. Pour exposer la trachée et l’artère carotide droite, placez un rat entièrement anesthésié en décubitus dorsal et nettoyez l’avant du cou et de la poitrine avec une solution d’alcool et de povidone. Faites une incision en forme de V avec le sommet du V près de la mâchoire du rat sur la ligne médiane et chaque membre du V pointant vers l’épaule correspondante. Séparez la peau du tissu sous-cutané et retournez la peau sur la poitrine pour exposer les muscles de la sangle du cou (figure 2A).
   1. Intubez le rat en séparant les muscles de la sangle médiane (sterno-mastoïdien et sternohyoïde) à l’aide d’une pince pour exposer la trachée (figure 2B). Encerclez la trachée avec une soie 5-0 et ouvrez-la en divisant partiellement le tissu musculaire entre les anneaux trachéaux.
   2. Insérez un angiocath de 14 G dans la trachée et fixez-le avec la soie 5-0 (Figure 2C). Connectez l’angiocath à un ventilateur (1 mL/kg à 90 respirations/min).
   3. Pour la canulation de l’artère carotide droite, identifiez l’artère carotide commune (elle se trouve parallèlement et immédiatement sur le côté droit de la trachée), isolez-la soigneusement sur toute la longueur du cou et attachez l’extrémité distale (crânienne) avec une soie 5-0.
   4. Fixez un hémostat à l’extrémité libre de l’attache pour la traction afin de faciliter la canulation de l’artère carotide.
   5. Mobilisez la face la plus proximale de l’artère carotide (vers la base du cou) et clampez-la à l’aide d’un hémostatique vasculaire. Sous un microscope opératoire, utilisez des ciseaux à micro-iris pour ouvrir l’artère carotide en la divisant partiellement vers l’avant à l’extrémité la plus distale. Canulez l’artère carotide avec un angiocath 22 G et fixez-la avec une cravate en soie 5-0 (Figure 2D).
   6. Fixez un adaptateur de robinet d’arrêt à trois voies à l’angiocath pour faciliter l’administration de médicaments ou de solution de cardioplégie dans l’artère carotide, et connectez-vous à un capteur de pression pour surveiller la fréquence cardiaque et la pression pendant le processus de DCD (Figure 2D). Un reflux pulsatile de sang doit être remarqué lorsque la pince vasculaire proximale est relâchée.
   7. Une fois fixé, connectez le cathéter de l’artère carotide au capteur de pression et administrez de l’héparine (1 000 U/Kg) et du bromure de vecuronium (4 mg/kg).
   8. Initiation du processus DCD : Laisser circuler le bromure de vecuronium pendant 1 min. Surveillez tout signe de détresse animale et administrez une anesthésie supplémentaire si nécessaire. Arrêtez le ventilateur (hypoxie/ischémie) pour initier le processus de DCD. Observez l’absence d’activité respiratoire.
      REMARQUE : Le temps ischémique du DCD commence à partir du moment où le support du ventilateur est retiré. Chez le rat, on a identifié que 25 minutes d’ischémie étaient la durée maximale entraînant des lésions importantes mais réversibles⁷. Les tracés de pression démontreront qu’à partir du moment de l’interruption de l’assistance ventilatoire à ~3,5 min, la pression systémique chute en dessous de 50 mmHg, pression jugée insuffisante pour perfuser efficacement le cœur (Figure 3).
3. Prélèvement de cœur de donneur : Allouez ~4 à 7 minutes pour procurer le cœur et administrer la cardioplégie froide. Pour atteindre le temps d’ischémie cible de 25 min, commencez l’approvisionnement du cœur après 18 à 21 minutes après la fin de l’assistance ventilatoire.
   REMARQUE : Modifiez la durée de l’approvisionnement en fonction de l’expérience de la personne qui effectue l’approvisionnement.
   1. Divisez la paroi abdominale le long de la marge costale en commençant par le niveau de la xiphoïde, puis divisez la cage thoracique parallèlement au sternum de chaque côté jusqu’aux clavicules pour effectuer des thoracomotomies antérieures bilatérales (Figure 4A). Utilisez un microscope opératoire sous faible grossissement (5x) pour faciliter cette étape.
   2. Retournez la paroi thoracique divisée articulée sur les clavicules vers la tête et fixez-la avec un hémostat (Figure 4B).
   3. Encerclez la veine cave inférieure (VCI) avec une soie 5-0, puis divisez-la partiellement avec des micro-ciseaux près du dôme du foie (Figure 4C). La VCI partiellement ouverte permet l’évacuation de la cardioplégie car elle distend le côté droit du cœur.
   4. Disséquez le plan entre l’aorte ascendante et l’artère pulmonaire (AP), puis isolez le tronc pulmonaire via le sinus transverse avec une pince incurvée à bout émoussé jusqu’à sa bifurcation. Divisez soigneusement l’artère pulmonaire près de son point de bifurcation avec des micro-ciseaux (Figure 4C).
   5. Encercler l’arc aortique avec une dissection émoussée. Il s’agit de permettre l’accès à une petite pince vasculaire à angle droit à placer sur l’arc aortique distal à l’origine de l’artère innée.
   6. Au bout de 25 minutes à partir de l’arrêt du ventilateur, clamper l’arc aortique et administrer manuellement la cardioplégie (10 ml de solution de l’Université du Wisconsin à 4 °C, pendant 2 à 3 minutes) par le cathéter carotidien (figure 4D).
   7. À l’aide de micro-ciseaux, divisez l’aorte ascendante distalement avant l’arc aortique (Figure 4E).
   8. Attachez l’IVC vers le cœur avec de la soie 5-0 et divisez-le distalement.
   9. Lister les veines pulmonaires et la veine cave supérieure (SVC) avec de la soie 5-0 (Figure 4F). Étant donné que ces attaches contiennent une grande quantité de tissu, une attache à la main est préférée à une attache à un instrument. Tirez doucement le cœur vers l’abdomen à l’aide d’un coton-tige pour faciliter la ligature des veines pulmonaires sans regrouper les appendices auriculaires dans l’attache.
   10. Divisez les veines pulmonaires à l’aide de ciseaux à micro-iris, prélevez le cœur et placez-le dans une solution saline normale glacée (Figure 4G).

3. Transplantation cardiaque hétérotopique DCD in vivo chez le rat

1. Enfermez le receveur dans une chambre d’isoflurane (induction de 3 %), coupez les poils sur l’abdomen et nettoyez la région avec de la povidone et de l’alcool. Ne pas anticoaguler le receveur ; Cela entraînera des saignements excessifs des anastomoses et une défaillance de la greffe.
2. Placez le rat en décubitus dorsal sur un coussin chauffant. Placez une sonde entre le rat et le coussin chauffant pour surveiller la température. Maintenez la température corporelle du rat à 38 °C. Placez deux tubes à centrifuger pré-stérilisés de 50 ml remplis de solution saline chaude ou de billes de verre de chaque côté de l’abdomen du rat pour faciliter le maintien au chaud.
3. Malgré les étapes mentionnées ci-dessus, si la température corporelle descend en dessous de 37,5 °C, augmentez la température ambiante (RT) et couvrez toutes les zones exposées du corps à l’aide d’une feuille d’aluminium autoclavée pour laisser juste assez de surface pour effectuer une chirurgie abdominale.
4. Induire une anesthésie générale avec de l’isoflurane à 3 % via un cône nasal et diminuer progressivement jusqu’à 2 %.
5. Ouvrez l’abdomen le long de la linea-alba (Figure 5A) et exposez l’espace de travail en plaçant des écarteurs de la paroi abdominale (Figure 5B).
6. À l’aide d’applicateurs à embout de coton stérile, déplacez le côlon dilaté ou entier et placez-le dans une gaze chaude et humide à la gauche de l’opérateur, en irriguant périodiquement avec une solution saline chaude (38 °C) (figure 5C). Le fait de déplacer le côlon de côté offre plus d’espace pour les cœurs DCD, car ils sont très rigides et nécessitent plus d’espace pour s’adapter à l’abdomen.
7. Ouvrez le rétropéritoine sur la ligne médiane avec une dissection émoussée à l’aide d’écouvillons à coton-tige. Exposez l’aorte infrarénale et la VCI.
8. À l’aide d’un clamp vasculaire pédiatrique multi-angle atraumatique, isolez 3 à 5 mm de l’aorte infrarénale et la VCI pour l’anastomose (Figure 5D).
9. Entrez dans l’aorte à l’aide d’une aiguille de 30 G montée sur une seringue de^{1 cm 3} remplie d’une solution saline normale mélangée à 100 unités d’héparine. Rincer avec 0,2 à 0,3 mL de la solution (figure 5E). Tamponnez l’excès de solution avec les applicateurs à embout de coton stérile, car l’héparine peut être absorbée et provoquer des saignements des lignes de suture.
10. À l’aide de micro-ciseaux, ouvrez l’aorte le long de l’axe long pour qu’elle corresponde à la taille de l’aorte du donneur. La VCI n’est pas ouverte à ce stade, et n’essayez pas de créer un plan entre la CVI et l’aorte ; Cela entraînera des saignements.
11. L’orientation correcte du cœur du donneur pendant l’anastomose est essentielle (Graphique 5F). Orientez le cœur du donneur pour l’anastomose de sorte que la surface antérieure du ventricule droit soit face au plafond, que l’apex pointe vers la droite de l’opérateur et que l’aorte du donneur soit légèrement plus basse que l’artère pulmonaire. Cette orientation entraîne une diminution de la tension sur l’anastomose de l’artère pulmonaire.
    1. Anastomose aortique : Utilisez un tourne-aiguille à pointe pointue et une pince à épiler de précision pour l’anastomose microvasculaire. Effectuer des anastomoses avec 8-0 Suture monofilament sur une aiguille conique de 4 mm chargée sur un porte-aiguille à pointe de 0,3 mm avec le verrou de l’aiguille retiré, pour éviter les traumatismes tissulaires accidentels lors du verrouillage et du déverrouillage.
    2. Placez une suture de maintien à la position 6 heures sur l’anastomose aortique. Ceci est fait pour fournir une ligne de suture symétrique et hémostatique. Ensuite, commencez l’anastomose à la position 12 heures avec l’extérieur vers l’intérieur sur l’aorte donneuse et l’intérieur vers l’extérieur sur l’aorte receveuse (Figure 6A, B). Ne gardez que 5 à 7 cm de suture de travail et tronquez le reste.
    3. Déplacez-vous dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, parcourez de courtes distances vers la position 6 heures, puis complétez l’anastomose à la manière d’une aiguille jusqu’à la position 12 heures en retournant le cœur vers la gauche (Figure 6C).
    4. Vérifiez qu’il n’y a pas de ligne de suture lâche avant de l’attacher.
       REMARQUE : Une anastomose sécurisée doit être symétrique et doit se rapprocher de l’intima du donneur et du receveur sans lacunes.
    5. Anastomose de l’artère pulmonaire : Libérez l’artère pulmonaire de l’aorte et orientez-la pour l’anastomose vers la VCI sans torsions. Préparez le volume sanguin du receveur pour remplir le cœur du donneur et évitez l’hypotension en injectant 3 à 5 ml de solution saline sous-cutanée (nuque) normale.
    6. Surveillez le schéma respiratoire du rat et diminuez l’isoflurane de 2,0 % à 1,5 % car l’anastomose de l’artère pulmonaire est presque terminée.
    7. Ouvrez la céphalade IVC par rapport à l’anastomose aortique avec des ciseaux à micro-iris (Figure 6C). Utilisez 0,2 à 0,3 ml de solution saline pour rincer l’IVC. Il y aura un petit nombre de caillots sanguins observés ; Rincez-les soigneusement.
    8. Contrairement à l’anastomose aortique, commencer l’anastomose pulmonaire sans suture de maintien ; Cela entravera l’exposition. Commencez à la position 12 heures avec l’aiguille se déplaçant de l’extérieur vers l’intérieur sur l’artère pulmonaire du donneur et de l’intérieur vers l’extérieur sur la VCI du receveur. Attachez la suture et complétez d’abord l’anastomose de la paroi arrière dans le sens des aiguilles d’une montre.
    9. Une fois à la position 6 heures, continuez à suturer dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que la position 12 heures soit atteinte, puis attachez-la à l’extrémité courte de la suture de la cravate précédente. Attention à ne pas serrer l’anastomose puisque tout rétrécissement limitera le drainage veineux du cœur. En moyenne, il faut 30 minutes ou moins pour compléter les deux anastomoses.
    10. Placez de petits morceaux d’hémostat résorbable sur l’anastomose pour contenir le saignement des trous d’aiguille.
    11. Desserrez les vaisseaux et ajoutez d’autres hémostats résorbables sur les trous de l’aiguille au besoin (figure 6E). Le cœur transplanté commence à battre avec des fibrillations occasionnelles avant de reprendre sa respiration rythmée. Laissez l’hémostat résorbable en place pendant 5 minutes tant que le cœur bat et qu’il n’y a pas de saignement manifeste.
    12. Une fois que vous êtes satisfait de l’hémostase (~3-5 min), utilisez des applicateurs stériles à embout de coton pour éliminer l’excès d’hémostase résorbable, irriguez avec une solution saline et renvoyez l’intestin dans la cavité abdominale (Figure 6F). Placez l’épiploon sur l’anastomose pour aider à l’hémostase.
    13. Fermez la paroi abdominale en deux couches avec du monocryl 5-0 sur une aiguille coupante de 13 mm en fermant d’abord la linea alba puis en fermant la peau (Figure 6G, H).

4. Récupération et surveillance

1. Une fois la fermeture abdominale terminée, retournez le rat sur son ventre sur un coussin chaud pour récupérer. Continuer l’isoflurane via un cône de nez à 1 % pendant 5 min, puis arrêter.
2. Une fois que la respiration spontanée est régulière, déplacez le rat dans une cage de récupération propre et placez-le sur un coussin chaud pour continuer le processus de récupération. Des mouvements brusques du rat entraîneront un risque de saignement ou une torsion de l’anastomose. Un analgésique à action prolongée administré avant le début de la chirurgie facilite grandement le processus de récupération.

5. Prélèvement et transplantation du cœur battant témoin

1. Procurez-vous des cœurs de donneur à cœur battant (CBD) de contrôle pour évaluer la qualité du cœur du donneur en l’absence d’ischémie.
   REMARQUE : Le donneur de CBD subit toutes les étapes décrites pour le cœur DCD, à l’exception de l’arrêt de l’assistance ventilatoire. Les cœurs de CBD sont obtenus pendant les battements et entièrement soutenus par un ventilateur. L’administration de la cardioplégie arrête le cœur, et l’approvisionnement et la transplantation se déroulent de la même manière que pour les cœurs DCD.

6. Évaluation de la fonction cardiaque transplantée :

1. À un intervalle prédéterminé à partir du moment de la transplantation cardiaque (24 h à 14 jours), anesthésiez le rat receveur (3 % d’isoflurane par inhalation), placez-le sur un coussin chaud en décubitus dorsal et ouvrez l’incision abdominale pour exposer le cœur transplanté.
2. Placez un cathéter à ballonnet via l’apex du ventricule gauche pour mesurer la pression développée (DP), le max +dP/dt et le min −dP/dt.
   REMARQUE : Ici, une station PowerLab a été utilisée comme système d’acquisition de données pour l’enregistrement de la pression artérielle.

Résultats

24 h à 14 jours après la transplantation cardiaque hétérotopique, l’abdomen peut être rouvert et le cœur peut être exposé pour mesurer la pression développée par le ventricule gauche. Un cathéter à ballonnet est inséré dans le ventricule gauche du cœur DCD (ou CBD) pour mesurer la pression développée (DP), le max +dP/dt et le min −dP/dt. La figure 7 montre un exemple des DP, +dP/dt et −dP/dt attendus d’un cœur DCD par rapport à un ...

Discussion

Pour qu’un rat hétérotopique DCD HTx réussisse, il est essentiel qu’une configuration méticuleuse et réfléchie de l’expérience soit établie. La configuration détaillée prend en compte plusieurs facteurs, notamment 1) la sélection de jeunes rats comme donneurs de DCD, 2) l’utilisation de l’isoflurane comme agent anesthésique de choix, 3) l’administration efficace de la cardioplégie au cœur du donneur, 4) le stockage du cœur du donneur dans une solution glacée, ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 nylon suture polyamide monofilament	Aros Surgical	SP17A05N-45
5-0 silk suture	Surgical Specialties	SP116
8-0 monofilament suture	Aros Surgical	T06A08N14-13
Autoclave	Steris	Amsco Lab 250
BD Insulin Syringe with Detachable Needle 1 mL Syringes	Fisher Scientific	14-820-28
BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle) 10 mL Syringes	Fisher Scientific	14-823-16E
Belzer University of Wisconsin cold storage solution	Bridge to Life Northbrook IL USA		Adenosine 1.34 g/L, Allopurinol 0.136 g/L, Glutathione 0.922 g/L, Lactobionic Acid (as Lactone) 35.83 g/L, Magnesium Sulfate heptahydrate 1.23 g/L, Pentafraction 50 g/L, Potassium Hydroxide 5.61 g/L, Potassium Phosphate monobasic 3.4 g/L, Raffinose pentahydrate 17.83 g/L
Buprenorfin SR Lab	Zoopharm LLC
Debakey atraumatic pediatric multi-angle vascular clamp	Aesculap	F341T
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters 14 G	Fisher Scientific	14-841-10
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters 22 G	Fisher Scientific	14-841-20
Fogarty catheter size 4F	Edwands Lifesciences	120404F
Forceps with curved tips	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.228
Gaymar Heating pump	Braintree Scientific, Braintree, MA, USA	TP700
Germinator-500	Braintree Scientific
Heparin Sodium Injection, USP 1,000 U/mL	Pfizer	NDC 0069-0137-01
Iris micro-scissors with straight tips	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.5253
Isoflurane USP	Patterson Veterinary	NDC 14043070406
Ketamine HCl 100 mg/mL	Henry Schein	NDC 6745710810
Lidocaine HCl 2%	Aspen Veterinary	07-892-4325
McKesson General Medical 6IN Q-TIPS 2STER WOOD 100/PACK	Fisher Scientific	NC0650323	sterile cotton tip applicators
Micro-scissors, right angle and curved tips	Braintree Scientific	SC-MS 154
Needle holder	Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation	ASSI.BSL158	with the lock mechanism removed
Normal Saline	Baxter Infusion supplies
PowerLab station	AD Instruments, Denver, CO		data acquisition system
Sodium Hydroxide/Hydrochloric Acid			adjust the solution to pH 7.4
Sprague Dawley rats			male, 8–16 weeks of age, <400 g in weight
Surgical Microscope	Leika	Model M525 F40
Surgicel	Ethicon		absorbable hemostat
Temperature probe Therma Waterproof Type T High Precision Thermocouple Meter	Thermoworks	THS-232-107
Tweezers with high precision point	Excelta	17-456-109
Vecuronium Bromide	Sigma-Aldrich	PHR1627	diluted in PBS for 100 mg/mL
Ventelite	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA
Xylazine 100 mg/mL	Pivetal Anased	NDC 04606675002