巴西寄生体加纳 斯菌的饲养方法，这是一种有前途的生物控制剂，用于侵入性 铃木果蝇

摘要

巴西果蝇是铃木果蝇（一种全球入侵性水果作物害虫）的幼虫寄生虫，已被批准或考虑引入欧洲和美国，用于生物控制该害虫。本文提供了这种寄生虫的小规模和大规模饲养方案。

摘要

斑点翅果蝇原产于东亚，松村 果蝇 （Matsumura）（双翅目:果蝇科）在过去十年中在美洲，欧洲和非洲部分地区广泛建立，成为入侵地区各种软皮水果的毁灭性害虫。生物控制，特别是通过自我延续和特化的寄生虫进行控制，预计将成为对这种高度移动性和多食性害虫进行可持续全区域管理的可行选择。 巴西甘纳斯皮斯 Ihering（膜翅目:Figitidae）是一种广泛分布在东亚的幼虫寄生虫，已被发现是 铃木杜鹃最有效的寄生虫之一。

在对其功效和潜在的非靶向风险进行严格的引入前评估之后，该物种的一个更具有宿主特异性的遗传群体（G1 G. Brasiliensis）最近已被批准在美国和意大利引入和田间释放。另一个遗传群体（G3 G. Brasiliensis）在东亚也很常见，也经常被发现攻击 铃木猪笼草 ，可能会考虑在不久的将来引入。目前，人们对饲养 巴西猪笼草 进行研究或大规模生产以针对 铃木猪笼草的田间释放有着浓厚的兴趣。该协议和相关视频文章描述了这种寄生虫的有效饲养方法，既可以小规模地用于研究，也可以大规模地用于大规模生产和现场释放。这些方法可能有利于进一步的长期研究和使用这种亚洲本地寄生虫作为这种全球入侵害虫的有前途的生物控制剂。

引言

原产于东亚的斑点翅果蝇，铃木果蝇（松村果蝇）（双翅目:果蝇科），已在美洲，欧洲和非洲部分地区广泛建立^1，2。苍蝇是极其多食性的，能够利用其原生和入侵地区^1，2，³中各种具有柔软和薄皮的栽培和野生水果。目前对这种害虫的管理策略严重依赖于在易感水果成熟时频繁使用针对农田中成年苍蝇的杀虫剂。经常使用重复喷洒，可能是由于水库苍蝇种群从非作物栖息地不断溢出，以及缺乏居住在被入侵地区的有效天敌^1，4。生物控制，特别是通过自我延续的特化寄生虫，可能有助于在景观水平上抑制苍蝇种群，并在可持续地管理这种高度移动性和多食性害虫的全区域范围内发挥关键作用^4，5，6。

在过去的十年中，研究人员一直致力于在东亚⁷，^8，9的苍蝇原生范围内发现铃木果蝇的共同进化寄生虫，以及在^{美洲和欧洲4，5}，⁶的苍蝇入侵地区有效但新关联的寄生虫。在苍蝇新入侵的地区，常见的幼虫果蝇寄生虫，如阿索巴拉c.f.塔比达（Nees）（膜翅目:布拉科），胭脂虫（巴博廷等人）和异体乳杆菌（汤普森）（膜翅目:Figitidae），由于苍蝇的强烈免疫抵抗力^，无法从铃木上的寄生虫发育或具有低寄生虫水平。只有一些世界性和通才的蛹类寄生虫，如长春花（Rondani）（膜翅目:翼手目）和果蝇（Perkins）（膜翅目:Diapriidae），以及南美洲的利马毛滴虫可以很容易地从这种苍蝇中发展^{出来 4}.相比之下，在东亚的探索已经从铃木^4，5，⁶中发现了许多幼虫寄生虫。其中，阿索巴拉粳稻贝洛科贝利斯基，巴西加那斯皮斯和日本粳稻诺夫科维奇和木村幼虫是主要的幼虫寄生虫^{7，8，9，11}。特别是，两种无花果体（粳稻和巴西猪笼草）是主要在天然植被中由铃木猪笼草和/或其他密切相关的果蝇感染的新鲜水果中发现的主要寄生虫^7，8，9。这三种亚洲幼虫寄生虫被输入到美国和欧洲的检疫设施，并评估了其相对效率^{12，13，14，15，16，17}，气候适应性¹⁸，潜在的种间竞争相互作用¹⁹，最重要的是宿主特异性^{8，20，21，22}.

检疫评估显示，与其他测试的亚洲幼虫寄生虫相比，巴西果蝇对铃木果蝇的宿主特异性更高，尽管它可能由不同的生物型或具有不同宿主特异性的神秘物种组成^{8，21，22，23，24}。Nomano等人^根据对线粒体细胞色素氧化酶I基因片段的分子分析，将来自不同地理区域的Ganaspis个体分为五个遗传组（命名为G1-G5）。据报道，G2 和 G4 组仅来自少数南亚热带地区，而 G5 组的报告来自亚洲和其他地区（例如阿根廷、巴西、夏威夷和墨西哥），其宿主不明（Buffington，个人观察）。在韩国7，中国^8和日本9，²³，²⁵中，铃木猪笼草侵扰的野生水果的野外收集物单独发现或代表G1和G3组的标本混合物。这两个群体似乎是对称的，并且共存于铃木猪和其他密切相关的寄主蝇居住的同一寄主植物上。尽管如此，两组之间已经观察到一些差异，G1似乎比G3对铃木D.具有更高程度的宿主或宿主栖息地特异性，尽管它们在检疫测试^21，22中都攻击了许多密切相关的^物种。进一步详细的分子分析可能有助于确定物种状态，特别是对于G1和G3组。这项研究将它们称为G1 G.巴西菌和G3 G. 巴西菌。一些早期的研究也将G1 G. 巴西莲命名为G。 参见巴西14^，21，22。G1 G. 巴西蜥蜴最近被批准在美国和意大利（其他几个欧洲国家目前正在考虑引入）对铃木乌贼进行田间释放，而G3巴西鳞毛蕨可能考虑在不久的将来进行田间释放。最近的调查还发现，在加拿大不列颠哥伦比亚省²⁶和美国华盛顿州，粳稻和G1 G. Brasiliensis的偶然种群（Beers等人，未发表的数据），以及意大利特伦托省的粳稻柳叶杆菌^种群27。

鉴于对制定 铃木果蝇 管理的生物控制方案的极大兴趣，以及偶然和故意引入 巴西果蝇的巨大生物控制潜力，有必要为这种幼虫寄生虫开发有效的饲养方法，以便今后进行长期研究和/或田间释放。该协议和相关视频文章描述了这种寄生虫的两套饲养方法:（1）使用宿主果实（蓝莓）和人造饲料的混合物在烧瓶中进行小规模实验室饲养，以培养 铃木杜鹃。这些方法是使用最初从中国^昆明收集的G3材料开发的。（2）使用寄主果实（蓝莓）进行大规模养殖，以便在大型网箱中放牧 ，用于铃木杜鹃的养殖。用于大规模养殖的遗传组是原产于日本东京的G1种群^9，22。还简要讨论了其他规模的饲养方法，例如为两组使用小瓶或小容器。

研究方案

1. 巴西G3甘草小规模实验室饲养方法

1. 准备主人的饮食。
   1. 将600 mL蒸馏水加入1，500 mL玻璃容器中，并在热板上加热水。
   2. 加入88.6克市售干粮（由琼脂，啤酒酵母，玉米粉，对羟基苯甲酸甲酯和蔗糖制成）或使用道尔顿等人发表的配方准备饮食²⁸ （见步骤2.1.2）。
   3. 在干粮中加入300毫升蒸馏水，并彻底搅拌饮食混合物。
   4. 将混合物加入沸水中。
   5. 让热板上的液体饮食煮沸10分钟，同时定期搅拌混合物以防止其燃烧。
   6. 让饮食在室温下冷却30分钟，同时偶尔搅拌以均匀地分配热量的释放，并防止饮食在表面上凝固。
   7. 在一个容器中测量 6.7 mL 95% EtOH，在另一个容器中测量 3.5 mL 1 M 丙酸溶液。
   8. 一旦饮食冷却，加入EtOH，然后加入丙酸溶液，每次加入后彻底搅拌。
   9. 准备蓝莓（从当地市场购买），将它们用冷水冲洗，然后在次氯酸钠漂白剂溶液（稀释至5%）中，然后再次冷水。
   10. 用纸巾将水果晒干并手动捣碎，直到每个水果的皮肤破裂，水果的汁液和果肉暴露出来。
   11. 将 25-30 克捣碎的蓝莓加入到每个 250 mL 烧瓶中。轻敲烧瓶的侧面，确保烧瓶的内部底部覆盖着一层均匀的蓝莓泥。
   12. 将准备好的饮食倒入每个烧瓶中，使其刚好覆盖在捣碎的蓝莓的顶部。
   13. 在烧瓶的颈部加入泡沫塞，让饮食在室温下固化（图1）。
   14. 一旦饮食凝固，立即使用或在5°C下储存长达3周。
2. 后主人 铃木果蝇。
   1. 从冰箱中取出储存的饮食，使其平衡到环境室温，或使用新鲜制作的饮食。
   2. 切一块吸水性纸巾（例如，5 厘米 x 20 厘米），然后将其拧在中心。将纸巾的扭曲中间部分放入烧瓶中（图1）。
   3. 用蒸馏水润湿纸巾和饮食表面以保持水分。
   4. 通过小心地取下旧烧瓶上的塞子并快速倒置烧瓶并将旧烧瓶的开口与新烧瓶对齐，将性成熟的成年苍蝇从当前的菌落苍蝇烧瓶转移到新的饮食瓶中。
   5. 轻轻敲击旧烧瓶的侧面，使苍蝇落入新烧瓶中。确保新烧瓶中有约25-30对交配的 铃木杜鹃 。一旦新烧瓶中有足够的苍蝇，请迅速将旧烧瓶翻转直立并更换两个烧瓶上的塞子。
   6. 重复苍蝇的转移，直到没有苍蝇留在旧烧瓶中。如有必要，将来自多个旧烧瓶的苍蝇组合或收集到新烧瓶中，以确保每个烧瓶有足够的苍蝇（20-30对）。
   7. 在合适的条件下（21°C，16 L:8 D光周期，60%-80%相对湿度[RH%]）暴露于成虫一周后，将新烧瓶在环境室中放置3周，以便苍蝇出现。
3. 将宿主幼虫暴露于寄生虫。
   1. 从烧瓶中取出任何成蝇和扭曲的纸巾后，取一个装有苍蝇卵和幼虫的烧瓶（见步骤1.2.7）。
   2. 将一块吸水性纸巾对折，放入烧瓶中作为寄生幼虫的化蛹基质。
   3. 将六对雌性和雄性G3 G. 巴西菌 吸入每个烧瓶中（图1）。在泡沫塞的底部划上一层薄薄的蜂蜜。
   4. 将寄生虫留在烧瓶中5天。
   5. 暴露5天后，取出寄生虫，并在上述条件下将烧瓶在环境室中保持35天，直到预期的黄蜂出现。
4. 收集和储存成人寄生虫。
   1. 在孵化的第二和第三周，每周检查烧瓶中是否有早期宿主出现并去除成蝇。
   2. 一旦成年寄生虫开始出现，每周抽吸三次，并将它们保持在果蝇小瓶中（例如，2.5 cm x 9.5 cm）（图1）。
   3. 将一小块纸巾放在小瓶底部，用蒸馏水润湿，但不饱和。
   4. 向每个小瓶中添加约60种寄生虫，并在小瓶上标记出苗日期。在泡沫塞的底部划上一层薄薄的蜂蜜，每周两次。如果不早点使用，在上述条件下将装有成人寄生虫的小瓶储存在环境室中长达一个月。
   5. 每4-7天将小瓶中的纸张重新润湿一次，如果有霉菌的迹象，请更换纸巾。

2. 巴西G1加纳斯皮斯的大规模养殖方法

1. 实施寄主铃木果蝇的大规模饲养。
   1. 后 铃木 在大型针织网眼覆盖的笼子（例如，50厘米x 50厘米x 100厘米）内，每个笼子包含1，500-2，000只性成熟的成年苍蝇（性别比例为50:50）（图2）。
   2. 将所有成分（6克细菌琼脂，75克玉米粉，17克营养酵母，15克糖糖，10克大豆粉，10毫升丙酸）在1L蒸馏水中煮沸10分钟，同时定期搅拌混合物以防止其燃烧²⁸，来制备标准果蝇培养基（SDM）。
   3. 让混合物冷却5分钟，加入5g抗坏血酸。
   4. 将新鲜煮熟的SDM倒入9厘米培养皿中，让培养基在室温下固化，然后关闭板。
   5. 堆叠SDM培养皿，用铝箔包裹堆叠，并将培养皿在4°C下储存长达2周。
   6. 在每个饲养笼中，放置一个装有水浸棉的盘子和四到六个带有SDM的培养皿（图2）。
   7. 每周两次，用新鲜的SDM培养皿替换受感染的SDM培养皿。
   8. 将感染的SDM培养皿（无盖）单独放入塑料杯（直径13.3厘米或800毫升）中，用细网（<0.5毫米）覆盖每个杯，并在23°C和75%RH下孵育12-15天（图2）。
   9. 将新孵化的 铃木猪笼 成虫从塑料杯转移到养殖笼中。
2. 准备宿主幼虫。
   1. 在冷水中冲洗蓝莓1分钟，并将水果浸泡在装有漂白剂溶液（稀释至5%）的盆中3分钟。
   2. 沥干漂白剂溶液，用冷水填充盆以冲洗蓝莓。用手轻轻搅拌至少 30 秒。
   3. 用淡水重复步骤2.2.2至少三次，以除去果实上可能存在的漂白剂残留物和其他节肢动物（例如螨虫，蓟马）。
   4. 将水果放在装有几层吸水性纸巾的托盘上，小心地来回倾斜托盘，将浆果滚动以干燥它们。
   5. 准备几个9厘米的培养皿（上半部分或下半部分，朝上），并用洗净的蓝莓填充每个培养皿（每盘15-25个水果，具体取决于水果大小）。
   6. 在傍晚时分，将培养皿暴露在宿主饲养笼内的性成熟的成年苍蝇（见步骤2.1）中，并将它们放置过夜。
   7. 第二天早上，通过轻轻吹食或敲击将培养皿从宿主饲养笼中取出，以将果实上的苍蝇移开，并使用受感染的果实饲养寄生虫（见步骤2.4）。
3. 实施大规模寄生虫饲养。
   1. 使用两种类型的笼子来饲养寄生虫:一种用于寄生，另一种用于黄蜂的出现。
   2. 确保寄生笼是立方的（例如，每侧45厘米），前面有一个透明的塑料面板，用于观察昆虫活动，前面板上有两个18厘米的袖子开口，用于添加或移除昆虫和更换食物材料，顶部和侧面有精细的聚酯网（例如，96 x 26目）用于通风。
   3. 使出笼变小（例如，每侧30厘米），在两个相对的侧面有一个套筒开口，在前面有一个透明的塑料面板，以便于查看（图2）。
   4. 确保两种笼子类型都有一根细绳，悬挂在天花板下方，从中悬挂一个到几个进纸器（图2）。
      注意:喂料器由一个大的圆柱形泡沫塞（直径9厘米）组成，上面覆盖着散落的蜂蜜液滴，可以放置在笼子地板上或挂在笼子天花板上（图2）。
   5. 在每个笼子内，根据相对湿度，每隔5-7天在用醋酸纤维素塞（直径2.5厘米）密封的直壁果蝇小瓶（2.5厘米 x 9.5厘米）中提供水。将小瓶倒挂在笼子天花板上（图2）。
4. 将宿主幼虫暴露于寄生虫。
   1. 在铃木猪笼虫过夜感染后立即将培养皿中宿主感染的水果暴露于G1 G. 巴西林中（见步骤2.2.7）。
   2. 将10-15个受感染水果的培养皿放在含有1，500-2，000只黄蜂的寄生笼中2-3天。
   3. 使用底部带有吸收纸层的塑料杯（直径13.3厘米或800毫升）来收集含有寄生宿主的水果（图2）。
   4. 将打开的杯子放在外胚层笼中，并在21°C和65%RH下孵育至少28天（图2）。
   5. 在孵化的第二周和第三周，每周检查笼子是否有早期宿主外表，并去除成蝇，以促进寄生虫的连续收集。
   6. 在孵化的第四周结束时，在笼子里加入喂食器和水源。
5. 收集并储存成虫寄生虫。
   1. 一旦寄生虫出现开始，收集一部分（10%-15%）的成虫，并将它们转移回寄生笼，以取代旧的非生产性个体。
   2. 收集剩余的寄生虫并将其储存在塑料杯（直径13.3厘米或800毫升）中（图3A）。
   3. 将装满水的管子（2 mL）放入杯子底部，并用牙科棉卷（1 cm x 3.8 cm）密封（图3A）。
   4. 用装有可拆卸泡沫塞（直径3.5厘米）的改良盖子关闭杯子，作为进料器基板和用于通风的网状孔（图3B）。
   5. 每个杯子最多添加700个成年人（性别比为50:50），用出苗日期标记杯子，并将其储存在环境室（17°C; 65%RH）中直到使用，或长达1个月（图3B）。
6. 运送成人寄生虫。
   1. 使用锥形管 （50 mL） 运送成人寄生虫。
   2. 刺穿盖子上的通风孔（直径8毫米），并用细网覆盖（图3C）。
   3. 在盖子内侧加入醋酸纤维素进料环（图3C）。
   4. 使用蒸馏水制备饱和蔗糖溶液，在喂食环上滴几滴，让它吸收液体。
   5. 将一块扇形的吸水纸巾放在管内（图3D）。
   6. 向每个管子中添加约200个成虫寄生虫，并将管子与冰袋一起放入绝缘的运输容器中。

结果

图4 显示了在美国农业部-阿根廷 红新月会益虫 引进处（特拉华州纽瓦克）检疫设施中使用两种不同的寄生虫密度（6对或10对）和两种不同的暴露时间（5或10天）对巴西G3 Ganaspis进行小规模实验室饲养的代表性结果。寄生虫密度和暴露时间的每种组合有14次重复。总共有64个烧瓶生产了4，018只黄蜂（每瓶71.7±4.9个后代），其中49.5%±1.9%的雌性后代。在21°C时，成虫寄生虫...

讨论

生物控制剂的长期研究和随后的田间释放取决于有效和经济的饲养技术的可用性。本研究中描述的方法已被证明是小规模和大规模饲养 巴西加纳斯皮斯的有效方案。小规模饲养方案已经开发了几年，以优化劳动力并减少同时维持寄生虫和宿主菌落所需的专用设备。它适用于维持实验室研究或生物测定的菌落。作者已经使用类似的方法来饲养这种寄生虫，用于隔离评估这种寄生虫。大规模饲...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Active dry yeast	Fleischmanns Yeast, Cincinatti, OH, USA	None	Used to cover fruit to reduce mold growth and enhance the frui attraction to the flies
Bacteriological agar	Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy	A1296 - 5KG	Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Bleach solution	Clorox Company, Oakland, CA, USA	None	Used to disinfect flesh fruit
Blue stopper	Azer Scientific, Morgantown, PA, USA	ES3837	Used for sealing the tube while allowing ventilation for insects
Blueberries	Grocery Store, Newark, DE, USA	None	Provided as host fruit for the flies (various other fruit can also be used)
BugDorm insect rearing cage (W24.5 x D24.5 x H63.0 cm)	Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan	4E3030	Used for rearing parasitoids (parasitism cage)
BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm)	Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan	4E4590	Used for rearing flies
BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm)	Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan	4E4545	Used for rearing parasitoids (eclosion cage)
Chicken wire (0.64 cm, 19 gauge)	Everbilt, OH, USA	308231EB	Used to lift up the fruit to allow maximum parasitoid oviposition
Cornmeal	Grocery Store, Trento, TN, Italy	None	Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Dental cotton roll (1 x 3.8 cm)	Gima S.p.A., Gessate, MI, Italy	35000	Used for providing water to the parasitoids within the storage container
Drosophila diet	Frontier Scientific, Newark, DE, USA	TF1003	Custom diet used to rear flies
Drosophila vial narrow, Polystirene (2.5 x 9.5 cm)	VWR International, LLC., Radnor, PA, US	75813-160	Used for providing water to the parasitoids within the cage
Drosophila vial plugs, Cellulose acetate (2.5 cm)	VWR International, LLC., Radnor, PA, US	89168-886	Used for providing water to the parasitoids within the cage
Erlenmeyer flask (250 mL)	Carolina Biological, Burlington, NC, USA	731029	Used for rearing flies and parasitoids
Falcon-style centrifuge tube (50 mL)	VWR International, LLC., Radnor, PA, US	VWRI525-0611	Modified to ship adult parasitoids
Foam stopper	Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA	L800-C	Used for sealing the flasks while allowing ventilation for insects
Honey	Grocery Store, Newark, DE, USA	None	Provided as food for parasitoids
Identi-Plug plastic foam stopper	Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US	14-127-40E	Used as feeder for parasitoids and to seal the storage container
Industrial paper towel	Grocery Store, Newark, DE, USA	None	Provided as a pupation substrate for pupae and mitigated moisture
Micron mesh fabric (250 mL)	Industrial Netting, Maple Grove, MN, USA	WN0250-72	Used to make ventilation lid for insects
Nutritional yeast (flakes)	Grocery Store, Trento, TN, Italy	None	Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Paper coaster (10.2 cm)	Hoffmaster, WI, USA	35NG26	Porvided as pupation substrate for flies and parsitized pupae
Plastic cup (Ø 13.3 cm, 800 mL)	Berry Superfos, Taastrup, Denmark	Unipak 5134	Modified to store adult parasitoids
Plastic lid (Ø 13.3 cm)	Berry Superfos, Taastrup, Denmark	PP 2830	Modified to store adult parasitoids
Propionic acid	Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy	P1386 - 1L	Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Saccharose	Grocery Store, Trento, TN, Italy	None	Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Soup cup with lid (475 mL)	StackMan, Vietnam	DC1648	Used for parasitized larvae to pupate
Soybean flour	Grocery Store, Trento, TN, Italy	None	Used to prepare the Standard Drosophila Medium
White felt washer (0.64 cm thick, 5 mm ID x 20 mm OD)	Quiklok, Lincoln, NH, US	WFW/.25 x 5 x 20 mm	Used as feeding ring for parasitoids