使用Leginon进行载物台倾斜的单颗粒冷冻电镜数据收集

摘要

本协议描述了冷冻电镜实验中倾斜单颗粒数据收集的通用且易于实施的方案。对于由于粘附空气-水界面而遭受优先方向偏差的样品，该程序对于获得高质量的EM图特别有用。

摘要

通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）进行的单颗粒分析（SPA）现在是高分辨率结构生物学的主流技术。SPA的结构测定依赖于获得在薄冰层内玻璃化的大分子物体的多个不同视图。理想情况下，均匀分布的随机投影方向的集合将相当于物体的所有可能视图，从而产生以各向同性方向分辨率为特征的重建。然而，在现实中，许多样品都受到粘附在空气-水界面上的优先取向颗粒的影响。这导致数据集中的角度取向分布不均匀，重建中出现不均匀的傅里叶空间采样，从而转化为以各向异性分辨率为特征的地图。倾斜试样载物台提供了一种可推广的解决方案，通过提高取向分布的均匀性，从而改善傅里叶空间采样的各向同性，克服分辨率各向异性。该协议描述了使用Leginon（一种用于自动图像采集的软件）的倾斜阶段自动数据收集策略。该程序易于实施，不需要任何额外的设备或软件，并且与用于生物大分子成像的大多数标准透射电子显微镜（TEM）兼容。

引言

在过去十年中，直接电子探测器¹，²，³的出现刺激了使用单粒子冷冻电镜⁴，^5，6解决的大分子和大分子组件的高分辨率结构的数量呈指数级增长。几乎所有纯化的大分子物质都有望使用冷冻电镜进行结构测定，除了最小的蛋白质~10 kDa大小或小于⁷。网格制备和结构测定所需的起始材料量至少比其他结构测定技术（如核磁共振波谱和X射线^晶体学4，^5，6）少一个数量级。

然而，通过冷冻电镜测定结构的主要挑战涉及合适的成像网格准备。一项使用不同玻璃化策略和网格评估不同样品的广泛研究表明，在冷冻电镜网格上玻璃化样品的大多数方法都会导致大分子优先粘附在空气-水界面上⁸。这种依从性可能导致四个次优结果:（1）大分子样品完全变性，在这种情况下，不可能成功的数据收集和处理;（2）样品部分变性，在这种情况下，有可能从未受损的大分子区域获得结构见解;（3）样品保留了天然结构，但图像中仅表示一组相对于电子束方向的粒子取向;（4）样品保留了天然结构，并且图像中表示了相对于电子束方向的一些但不是全部可能的粒子取向。对于情况（3）和（4），倾斜数据收集将有助于最大限度地减少影响重建冷冻电镜图的方向分辨率各向异性，并为各种样品提供可推广的解决方案⁹。从技术上讲，倾斜也可以使情况（2）受益，因为变性可能发生在空气 - 水界面处，并且同样限制了数据中表示的不同方向的数量。数据集中方向偏差的程度可以通过试验溶液添加剂来改变，但缺乏广泛的适用性阻碍了这些试错法。通过改变^{成像实验9} 的几何形状，以单个优化的倾斜角度倾斜样品台足以改善方向分布（图1）。由于优先取向样品相对于电子束的几何配置，对于每个优先取向的簇，倾斜网格会生成相对于团簇质心的照明角度锥。因此，这分散了视图，从而改善了傅里叶空间采样和方向分辨率的各向同性。

在实践中，倾斜舞台有一些危害。倾斜标本载物台会在视场上引入焦点梯度，这可能会影响对比度传递函数 （CTF） 估计的准确性。倾斜的数据收集还可能导致光束诱导的粒子运动增加，这是由于对倾斜标本进行成像时电荷效应增加引起的。网格倾斜也会导致表观冰厚度增加，这反过来又导致显微照片嘈杂，并可能最终影响重建的分辨率⁵，^9，10。通过应用协议和讨论部分中简要描述的高级计算数据处理方案，可以克服这些问题。最后，倾斜会导致粒子重叠增加，从而阻碍后续的图像处理管道。虽然这可以通过优化网格颗粒浓度在一定程度上缓解，但它仍然是一个重要的考虑因素。这里描述了一种易于实现的协议，用于使用Leginon软件套件（一种自动图像采集软件）进行倾斜数据收集，该套件可开放访问并与各种显微镜¹¹，^12，13，14兼容。该方法至少需要版本 3.0 或更高版本，版本 3.3 及更高版本包含专门的改进，以实现倾斜数据收集。此协议不需要额外的软件或设备。有关计算基础结构和安装指南的大量说明在别处提供¹⁵.

研究方案

1. 样品制备

1. 使用包含金箔和金网格支撑的网格¹⁶ （见 材料表），因为倾斜的数据收集会突出光束引起的运动¹⁷。
   注意:对于本研究，在加湿（大于80%）的冷藏室（~4°C）中使用手动浸入和印迹技术¹⁸ 对网格上的样品进行玻璃化。
2. 除非绝对必要，否则避免使用包含铜支架和碳箔的网格或连续的非晶碳层，因为这些网格可能导致当样品台倾斜时更大的光束诱导运动¹⁶ 。
   注意:与非晶碳¹⁹，²⁰相比^，替代支撑层（例如石墨烯/氧化石墨烯）似乎减少了光束引起的运动。
3. 预先筛选网格并确定以可接受的冰厚度和颗粒分布为特征的区域。包含太紧密堆积颗粒的网格将导致倾斜数据收集过程中颗粒重叠，这可能会影响下游数据处理步骤。
   注意:这些步骤是主观的，因为通过目视检查颗粒对比度清晰的区域的散焦图像来识别良好的冰区域。这可能不适用于所有样品，因为某些样品无法在薄冰区域有效分布，导致数据收集过程中出现挑战（在讨论部分描述）。
4. 玻璃化含有蛋白质样品的网格。在这里，出于演示目的，我们使用饥饿期间的DNA保护（DPS）蛋白（见 材料表），范围为0.1-0.5mg / mL，金箔和金支撑网格。
   注意:如前所述纯化蛋白质，除了没有进行TEV蛋白酶切割²¹。目标样品的蛋白质浓度范围必须单独优化，因为很难衡量普遍适用的理想范围，并且几乎肯定会因不同样品而异。

2. 设置倾斜数据收集

1. 对准显微镜以确保标本的平行照明并最大限度地减少彗差²².
   注意:显微镜必须对准良好，以便进行标准SPA数据收集，不得倾斜载物台。倾斜数据收集不需要特殊的对齐，但良好的对齐将确保定位和成像顺利进行。 图 2 提供了比较倾斜和未倾斜数据收集的一般方案。
2. 记录没有载物台倾斜的网格图集，以识别适合数据收集的正方形，或在方形 采集节点中使用的放大倍率下手动检查正方形。寻找箔片完好无损、看起来不脱水且具有理想冰厚度的正方形。
   注意: 方形采集 节点是用于 Leginon 中多尺度成像的低放大倍率节点。
   1. 对于典型的不倾斜自动数据收集，请记录网格图集，该图集提供了整体网格质量的概述，并初步指示了适合数据收集的区域。
   2. 随后，通过图集选择合适的方块并将它们提交队列。然后，通过手动选择孔或通过自动EM孔查找器，排队并提交孔目标。
   3. 最后，使用自动电磁孔查找器提交高放大倍率曝光目标。
      注意:对于倾斜数据收集，可能需要手动排队以获得一致的结果，特别是如果最佳倾斜角度尚未预先确定，并且可能会在数据收集期间进行调整。如果先前已确定用于数据收集的倾斜角度，也可以使用预定义的载物台倾斜来记录网格图集。
3. 将样品载物台移动到感兴趣的正方形。
4. 使用α摆动器在15°载物台倾斜±确定载物台位置的共心高度。使用显微镜的键盘面板调整Z高度，使载物台达到共心高度。确保在α摆动例程期间图像偏移最小。
   注意:如果未正确识别共心高度，则在以方形放大倍率倾斜载物台时将观察到较大的图像偏移。如果栅格上存在局部变形，例如，如果栅格在成像区域附近断裂或严重弯曲，也会发生这种情况。虽然最好避免使用此类区域进行数据收集，但如果这些区域是少数有希望的数据收集区域之一，则必须准确估计真心高度。 图 3 显示了未正确识别真心高度的定位如何导致方形放大倍率中的大图像偏移。
5. 找到更精确的 Z 高度，使用 对焦器节点，然后按下 模拟。
   1. 通常，在方形采集节点中使用的放大倍率下估计聚焦器节点中的 Z 高度。
      注意: 聚焦器 节点对焦序列还可以包括在数据收集期间孔 采集节点 （Leginon软件中的工具）放大倍率处的精细Z焦点估计。
   2. 调整焦点 器节点 的设置，并在正方形初始排队期间启用/禁用精细 Z 焦点选项。
      注意:确保在自动数据收集开始时准确识别以心为中心的高度非常重要，这可能需要重新启用精细 Z 焦点（步骤 2.10）。
6. 将样品载物台倾斜到所需的倾斜角度，以便在真正的真心高度收集数据，并在必要时将载物台重新居中。本研究使用0°、30°和60°倾斜角。按"方形采集"节点中的"模拟"开始排队孔采集节点曝光的目标。
   注意:如步骤2.2.1所示，网格图集可以使用预定义的载物台倾斜来记录，这样就无需在此步骤中再次倾斜载物台。如果预定义了用于数据收集的倾斜角度，则此方法效果很好，并且可以加快该过程。当前的协议是在考虑新标本的情况下编写的，其中用户可能希望测试不同的倾斜角度以进行数据收集。
7. 选择 Z焦点 目标和具有适合高放大倍率曝光的孔的区域。
8. 按 提交目标以排队 等待映像。在完成所有方块的排队之前，不要按提交排队的目标。
9. 将试样载物台恢复到未倾斜状态。移动到下一个正方形并重复步骤2.3-2.8，直到足够数量的孔暴露排队。
10. 转到 孔瞄准节点 ，并在所有方块排队后按 提交排队目标 。
    注意:如果之前禁用了精细 Z 焦点以节省时间（步骤 2.5），则需要在提交队列之前重新启用它。
11. 手动检查高倍率 曝光采集节点 选择的目标，以测试当标本载物台倾斜时，自动EM孔查找器是否可以准确识别合适的图像采集区域。
    1. 在此过程中，在 曝光采集节点 设置中选择"允许用户验证所选目标"。用户对定位准确性感到满意后，请取消选择此选项以自动收集数据。
       注意:高倍率曝光采集节点中的目标通常使用光束倾斜图像偏移策略进行成像，该策略同样适用于倾斜和未倾斜数据收集²³，²⁴，^25，26。为了在下游数据处理步骤中准确估计CTF，必须对光束倾斜图像偏移数据收集策略进行透镜-彗差校准。

3. 数据处理

1. 通过对录制的电影进行运动校正、CTF 估计、粒子选择以及在数据收集期间生成初始重建，启动动态数据处理¹⁰、²⁷、^28、29。
   注意:在本研究中，cryoSPARC Live¹⁰ （见 材料表）已用于预处理。动态数据处理提供初始冷冻电镜重建和角度分布的近似值，这可以告知用户分辨率各向异性的程度。反过来，这些可以用来指导用户用于数据收集的倾斜角度是否足够高。
2. 可视化重建的地图并绘制欧拉角分布，以测量首选粒子方向的范围。
   注意:欧拉角分布可以直接转换为傅里叶空间采样分布，以确定分辨率各向异性的潜在程度。已经开发了一个图形用户界面（GUI），以帮助用户评估欧拉角分布的质量并确定最佳倾斜角^30，31。该工具可以从 Github 存储库获得，https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui。
3. 如有必要，调整收集数据的载物台倾斜角度，以克服优先方向的影响。如果优先方向仍然是一个问题，则可以增加角度，如 3.2 中的地图和欧拉分布所示。或者，用户可能希望将数据收集分成几组，并使用几种不同的倾斜角度（例如 20°、30° 和 40°）进行记录。
   注意:尽管大多数TEM必须能够将载物台倾斜至70°，但常见的样品载物台倾斜（我们使用的）范围为20°-40°。

结果

使用0.3 mg/mL的DPS来演示0°、30°和60°倾斜时的成像。来自不同倾斜角度的数据收集在同一网格上不同网格区域。适合较高角度倾斜的CTF分辨率往往较差，就像在本研究中比较三个数据集时一样。 图4 显示了比较代表性图像和2D分类平均值。尽管在不同的倾斜角度下蛋白质浓度保持不变，但较高的倾斜角度使成像区域在颗粒浓度方面显得更加拥挤。这对于数据处理来说可能是个...

讨论

由样品粘附在空气-水界面上引起的首选颗粒取向是使用冷冻电镜SPA⁴，^5，6进行常规高分辨率结构测定的最后一个主要瓶颈之一。这里介绍的数据收集方案提供了一种易于实现的策略，用于改善数据集中粒子的方向分布。我们注意到，该协议不需要额外的设备或软件，也不会影响数据收集速度。在倾斜样品的数据采集过程中，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01