Raccolta dati Cryo-EM a singola particella con inclinazione dello stadio utilizzando Leginon

Riepilogo

Il presente protocollo descrive uno schema generalizzato e facile da implementare per la raccolta di dati a singola particella inclinata in esperimenti crio-EM. Tale procedura è particolarmente utile per ottenere una mappa EM di alta qualità per campioni che soffrono di distorsione di orientamento preferenziale a causa dell'aderenza all'interfaccia aria-acqua.

Abstract

L'analisi a singola particella (SPA) mediante crio-microscopia elettronica (cryo-EM) è ora una tecnica mainstream per la biologia strutturale ad alta risoluzione. La determinazione della struttura da parte della SPA si basa sull'ottenimento di più viste distinte di un oggetto macromolecolare vetrificato all'interno di un sottile strato di ghiaccio. Idealmente, una raccolta di orientamenti di proiezione casuali uniformemente distribuiti equivarrebbe a tutte le possibili viste dell'oggetto, dando origine a ricostruzioni caratterizzate da risoluzione direzionale isotropa. Tuttavia, in realtà, molti campioni soffrono di particelle orientate preferenzialmente che aderiscono all'interfaccia aria-acqua. Ciò porta a distribuzioni di orientamento angolare non uniformi nel set di dati e a campionamenti disomogenei nello spazio di Fourier nella ricostruzione, traducendosi in mappe caratterizzate da risoluzione anisotropa. L'inclinazione dello stadio del campione fornisce una soluzione generalizzabile per superare l'anisotropia di risoluzione in virtù del miglioramento dell'uniformità delle distribuzioni di orientamento, e quindi dell'isotropia del campionamento dello spazio di Fourier. Il presente protocollo descrive una strategia di raccolta dati automatizzata a stadio inclinato utilizzando Leginon, un software per l'acquisizione automatica delle immagini. La procedura è semplice da implementare, non richiede alcuna attrezzatura o software aggiuntivo ed è compatibile con la maggior parte dei microscopi elettronici a trasmissione standard (TEM) utilizzati per l'imaging di macromolecole biologiche.

Introduzione

L'avvento dei rivelatori di elettroni diretti nell'ultimo decennio 1,2,3 ha stimolato un aumento esponenziale del numero di strutture ad alta risoluzione di macromolecole e assemblaggi macromolecolari risolti utilizzando crio-EM ^4,5,6 a singola particella. Ci si aspetta che quasi tutte le specie macromolecolari purificate siano suscettibili di determinazione della struttura utilizzando la crio-EM, ad eccezione delle proteine più piccole di dimensioni ~ 10 kDa o inferiori a⁷. La quantità di materiale di partenza necessaria per la preparazione della griglia e la determinazione della struttura è almeno un ordine di grandezza inferiore rispetto ad altre tecniche di determinazione della struttura, come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare e la cristallografia a raggi X ^4,5,6.

Tuttavia, una delle principali sfide per la determinazione della struttura da parte della crio-EM riguarda un'adeguata preparazione della griglia per l'imaging. Uno studio approfondito che ha valutato diversi campioni utilizzando diverse strategie e griglie di vetrificazione ha suggerito che la maggior parte degli approcci per la vetrificazione dei campioni su griglie crio-EM porta ad un'aderenza preferenziale delle macromolecole all'interfaccia aria-acqua⁸. Tale aderenza può potenzialmente causare quattro risultati subottimali: (1) il campione macromolecolare si denatura completamente, nel qual caso non è possibile una raccolta e un'elaborazione dei dati di successo; (2) il campione si denatura parzialmente, nel qual caso può essere possibile ottenere informazioni strutturali da regioni della macromolecola che non sono danneggiate; (3) il campione mantiene la struttura nativa, ma solo una serie di orientamenti delle particelle rispetto alla direzione del fascio di elettroni sono rappresentati nelle immagini; (4) Il campione mantiene la struttura nativa, e alcuni ma non tutti i possibili orientamenti delle particelle rispetto alla direzione del fascio di elettroni sono rappresentati nelle immagini. Per i casi (3) e (4), la raccolta di dati inclinata aiuterà a ridurre al minimo l'anisotropia della risoluzione direzionale che influisce sulla mappa crio-EM ricostruita e fornisce una soluzione generalizzabile per un'ampia varietà di campioni⁹. Tecnicamente, l'inclinazione può anche avvantaggiare il caso (2), poiché la denaturazione si verifica presumibilmente all'interfaccia aria-acqua e limita allo stesso modo il numero di orientamenti distinti rappresentati all'interno dei dati. L'estensione della distorsione dell'orientamento nel set di dati può potenzialmente essere alterata sperimentando additivi per soluzioni, ma la mancanza di un'ampia applicabilità ostacola questi approcci di prova ed errore. L'inclinazione dello stadio del campione con un singolo angolo di inclinazione ottimizzato è sufficiente per migliorare la distribuzione degli orientamenti in virtù dell'alterazione della geometria dell'esperimento di imaging⁹ (Figura 1). A causa della configurazione geometrica del campione orientato preferenzialmente rispetto al fascio di elettroni, per ogni gruppo di orientamenti preferenziali, l'inclinazione della griglia genera un cono di angoli di illuminazione rispetto al centroide del cluster. Quindi, questo diffonde le viste e di conseguenza migliora il campionamento dello spazio di Fourier e l'isotropia della risoluzione direzionale.

Ci sono, in pratica, alcuni svantaggi nell'inclinare il palcoscenico. L'inclinazione dello stadio del campione introduce un gradiente di messa a fuoco attraverso il campo visivo, che può influire sull'accuratezza delle stime della funzione di trasferimento del contrasto (CTF). La raccolta di dati inclinati può anche portare a un aumento del movimento delle particelle indotto dal fascio causato da maggiori effetti di carica durante l'imaging di campioni inclinati. L'inclinazione della griglia porta anche ad un aumento dello spessore apparente del ghiaccio, che a sua volta porta a micrografie più rumorose e può in definitiva influire sulla risoluzione delle ricostruzioni 5,9,10. Potrebbe essere possibile superare questi problemi applicando schemi avanzati di elaborazione dei dati computazionali che sono brevemente descritti nelle sezioni protocollo e discussione. Infine, l'inclinazione può portare a una maggiore sovrapposizione delle particelle, ostacolando la successiva pipeline di elaborazione delle immagini. Sebbene questo possa essere mitigato in una certa misura ottimizzando la concentrazione di particelle sulla griglia, è comunque una considerazione importante. Qui viene descritto un protocollo semplice da implementare per la raccolta di dati inclinati utilizzando la suite software Leginon (un software di acquisizione automatica delle immagini), accessibile ad accesso aperto e compatibile con un'ampia gamma di microscopi^11,12,13,14. Il metodo richiede almeno la versione 3.0 o successiva, con le versioni dalla 3.3 in poi contenenti miglioramenti dedicati per consentire la raccolta dei dati inclinata. Non è necessario alcun software o apparecchiatura aggiuntiva per questo protocollo. Istruzioni dettagliate sull'infrastruttura computazionale e sulle guide all'installazione sono fornite altrove¹⁵.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Utilizzare griglie contenenti lamina d'oro e supporto griglia d'oro 16 (vedi Tabella dei materiali) perché la raccolta dei dati inclinata può accentuare il movimento indotto dal fascio¹⁷.
   NOTA: Per il presente studio, i campioni su griglie sono stati vetrificati utilizzando la tecnica manuale di immersione e tamponamento¹⁸ in una cella frigorifera umidificata (superiore all'80%) (~4 °C).
2. Evitare l'uso di griglie contenenti supporto di rame e foglio di carbonio o uno strato continuo di carbonio amorfo a meno che non sia assolutamente necessario, poiché queste griglie possono portare a un maggiore movimento indotto dal fascio¹⁶ quando lo stadio del campione è inclinato.
   NOTA: Strati di supporto alternativi, come l'ossido di grafene/grafene, sembrano ridurre il movimento indotto dal fascio rispetto al carbonio amorfo^19,20.
3. Pre-vagliare le griglie e identificare le regioni caratterizzate da uno spessore accettabile del ghiaccio e distribuzione delle particelle. Le griglie contenenti particelle troppo strette porteranno alla sovrapposizione delle particelle durante la raccolta dei dati inclinata, che potrebbe influire sulle fasi di elaborazione dei dati a valle.
   NOTA: Questi passaggi sono soggettivi poiché l'identificazione di aree buone di ghiaccio viene eseguita ispezionando visivamente le immagini sfocate per le regioni in cui il contrasto delle particelle è chiaro. Questo potrebbe non essere fattibile per tutti i campioni poiché alcuni campioni non si distribuiranno in modo efficiente nelle aree di ghiaccio sottile, portando a problemi durante la raccolta dei dati (descritti nella sezione Discussione).
4. Vitrificare le griglie contenenti il campione proteico. Qui, a scopo dimostrativo, usiamo la proteina DPS (DNA Protection during Starvation) (vedi Tabella dei materiali) in un intervallo da 0,1-0,5 mg / ml con lamina d'oro e griglie di supporto d'oro.
   NOTA: La proteina è stata purificata come descritto in precedenza, tranne che non è stata eseguita alcuna scissione della proteasi TEV²¹. L'intervallo di concentrazione proteica per un campione di interesse dovrà essere ottimizzato individualmente, poiché è difficile valutare un intervallo ideale che sia universalmente applicabile e quasi certamente varierà tra i diversi campioni.

2. Impostazione della raccolta dati inclinata

1. Allineare il microscopio per garantire un'illuminazione parallela del campione e ridurre al minimo le aberrazioni del coma²².
   NOTA: Il microscopio deve essere ben allineato per la raccolta di dati SPA standard senza inclinazione dello stadio. Non sono necessari allineamenti speciali per la raccolta dei dati inclinati, ma un buon allineamento garantirà che il targeting e l'imaging procedano senza intoppi. Uno schema generale che confronta la raccolta dei dati inclinati e non inclinati è fornito nella Figura 2.
2. Registra un atlante della griglia senza inclinazione dello stadio per identificare i quadrati adatti alla raccolta dei dati o ispeziona manualmente i quadrati all'ingrandimento utilizzato nel nodo di acquisizione quadrato. Cerca quadrati in cui la lamina è intatta, non sembra disidratata e ha uno spessore di ghiaccio ideale.
   NOTA: Square Acquisition Node è il nodo a basso ingrandimento utilizzato per l'imaging multiscala in Leginon.
   1. Per la tipica raccolta automatica dei dati non inclinata, registrare un atlante della griglia, che fornisce una panoramica della qualità complessiva della griglia e un'indicazione iniziale delle aree adatte per la raccolta dei dati.
   2. Successivamente, selezionare i quadrati adatti attraverso l'atlante e inviarli alla coda. Quindi, tramite la selezione manuale dei fori o tramite il cercatore automatico di fori EM, accodare e inviare i target dei fori.
   3. Infine, utilizzare il cercatore automatico di fori EM per inviare obiettivi di esposizione ad alto ingrandimento.
      NOTA: per la raccolta dei dati inclinati, potrebbe essere necessario accodare manualmente i quadrati per ottenere risultati coerenti, soprattutto se l'angolo di inclinazione ottimale non è stato predeterminato ed è probabile che venga regolato durante la raccolta dei dati. L'atlante della griglia potrebbe anche essere registrato utilizzando un'inclinazione dello stadio predefinita se l'angolo di inclinazione utilizzato per la raccolta dei dati fosse stato precedentemente stabilito.
3. Spostare lo stadio campione in un quadrato di interesse.
4. Determinare l'altezza eucentrica per la posizione del palco utilizzando α-wobbler a ± inclinazione del palco di 15°. Regolare l'altezza Z per portare il palco all'altezza eucentrica utilizzando il pannello della tastiera per il microscopio. Assicurati che lo spostamento dell'immagine sia minimo durante la routine di oscillazione α.
   NOTA: Se l'altezza eucentrica non è correttamente identificata, si osserverà un grande spostamento dell'immagine inclinando il palco all'ingrandimento quadrato. Ciò può accadere anche se ci sono deformazioni locali sulla griglia, ad esempio, se la griglia è rotta o gravemente piegata in prossimità dell'area ripresa. Sebbene sia meglio evitare tali regioni per la raccolta dei dati, è imperativo stimare con precisione l'altezza eucentrica se queste rappresentano una delle poche regioni promettenti per la raccolta dei dati. La Figura 3 mostra come il targeting senza identificare correttamente l'altezza eucentrica può causare grandi spostamenti dell'immagine nell'ingrandimento del quadrato.
5. Trova un'altezza Z più precisa, usa il nodo Focheggiatore e premi Simula.
   1. In genere, stimare l'altezza Z nel nodo Focheggiatore all'ingrandimento utilizzato nel nodo di acquisizione quadrato.
      NOTA: La sequenza di messa a fuoco del nodo Focuser può anche includere una stima fine della messa a fuoco Z all'ingrandimento del nodo Hole Acquisition (uno strumento nel software Leginon) durante la raccolta dei dati.
   2. Regolare le impostazioni per il nodo Focheggiatore e abilitare/disabilitare l'opzione di messa a fuoco Z fine durante l'accodamento iniziale dei quadrati.
      NOTA: è importante assicurarsi che l'altezza eucentrica sia identificata con precisione quando inizia la raccolta automatica dei dati, il che potrebbe richiedere la riattivazione della messa a fuoco Z fine (passaggio 2.10).
6. Inclinare lo stadio del campione all'angolo di inclinazione desiderato per la raccolta dei dati alla vera altezza eucentrica e, se necessario, ricentrare lo stadio. Per questo studio sono stati utilizzati angoli di inclinazione di 0°, 30° e 60°. Premere Simula nel nodo Acquisizione quadrata per iniziare ad accodare le destinazioni per le esposizioni del nodo Acquisizione fori .
   NOTA: Come indicato al punto 2.2.1, l'atlante della griglia può essere registrato utilizzando un'inclinazione predefinita dello stadio, che eviterebbe la necessità di inclinare nuovamente lo stadio in questa fase. Questo funziona bene e accelera il processo se l'angolo di inclinazione utilizzato per la raccolta dei dati è predefinito. Il protocollo attuale è scritto pensando a nuovi campioni, in cui l'utente potrebbe voler testare diversi angoli di inclinazione per la raccolta dei dati.
7. Selezionare un target di messa a fuoco Z e regioni con fori adatti per esposizioni ad alto ingrandimento.
8. Premere Invia destinazioni per mettere in coda per l'imaging. Non premere Invia destinazioni in coda fino a quando non hai finito di mettere in coda tutti i quadrati.
9. Riportare lo stadio del campione allo stato non inclinato. Passate al quadrato successivo e ripetete i passaggi 2.3-2.8 fino a quando non è stato messo in coda un numero adeguato di esposizioni dei fori.
10. Vai al nodo Hole Targeting e premi Submit Queued Targets una volta che tutti i quadrati sono in coda.
    NOTA: se la messa a fuoco Z fine è stata disabilitata in precedenza per risparmiare tempo (passaggio 2.5), deve essere riattivata prima di inviare la coda.
11. Ispezionare manualmente i target selezionati dal nodo di acquisizione dell'esposizione ad alto ingrandimento per verificare se il cercatore automatico di fori EM è in grado di identificare con precisione le regioni adatte per l'acquisizione delle immagini quando lo stadio del campione è inclinato.
    1. Durante questa procedura, selezionare "Consenti la verifica utente dei target selezionati" nelle impostazioni del nodo Acquisizione esposizione . Una volta che l'utente è soddisfatto della precisione del targeting, deseleziona questa opzione per la raccolta automatica dei dati.
       NOTA: I target nel nodo di acquisizione dell'esposizione ad alto ingrandimento vengono in genere ripresi utilizzando una strategia di spostamento dell'immagine beam-tilt, che funziona ugualmente bene sia per la raccolta di dati inclinati che non inclinati^23,24,25,26. Per una stima accurata del CTF nelle fasi di elaborazione dei dati a valle, è necessario eseguire la calibrazione dell'aberrazione della chioma dell'obiettivo per la strategia di raccolta dei dati di spostamento dell'immagine beam-tilt.

3. Trattamento dei dati

1. Avvia l'elaborazione dei dati al volo 10,27,28,29 con la correzione del movimento dei filmati registrati, la stima CTF^, la selezione delle particelle e la generazione di ricostruzioni iniziali durante la raccolta dei dati.
   NOTA: Per il presente studio, cryoSPARC Live¹⁰ (vedi Tabella dei materiali) è stato utilizzato per la pre-elaborazione. L'elaborazione dei dati al volo fornisce una ricostruzione crio-EM iniziale e un'approssimazione per la distribuzione angolare, che può informare l'utente sull'estensione dell'anisotropia di risoluzione. Questi possono, a loro volta, essere utilizzati per guidare l'utente sul fatto che l'angolo di inclinazione utilizzato per la raccolta dei dati sia sufficientemente elevato.
2. Visualizza la mappa ricostruita e traccia la distribuzione dell'angolo di Eulero per valutare l'estensione degli orientamenti delle particelle preferiti.
   NOTA: Le distribuzioni degli angoli di Eulero possono essere convertite direttamente in distribuzioni campionarie dello spazio di Fourier per determinare la potenziale estensione dell'anisotropia di risoluzione. È stata sviluppata un'interfaccia utente grafica (GUI) per aiutare l'utente a valutare la qualità di una distribuzione dell'angolo di Eulero e determinare un angolo di inclinazione ottimale^30,31. Lo strumento può essere ottenuto dal repository Github, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui.
3. Se necessario, regolare l'angolo di inclinazione dello stage al quale vengono raccolti i dati per superare gli effetti dell'orientamento preferenziale. L'angolo può essere aumentato se l'orientamento preferenziale rimane un problema, come evidenziato dalla mappa e dalla distribuzione di Eulero in 3.2. In alternativa, l'utente potrebbe voler dividere la raccolta dati in gruppi e registrare utilizzando diversi angoli di inclinazione, ad esempio 20°, 30° e 40°.
   NOTA: Sebbene la maggior parte dei TEM debba avere la capacità di inclinare lo stadio a 70°, le inclinazioni dello stadio dei campioni comuni (che abbiamo usato) vanno da 20° a 40°.

Risultati

DPS a 0,3 mg/ml è stato utilizzato per dimostrare l'imaging a inclinazioni di 0°, 30° e 60°. I dati provenienti da diversi angoli di inclinazione sono stati raccolti sulla stessa griglia in diverse regioni della griglia. La risoluzione CTF si adatta alle inclinazioni angolari più elevate tendono ad essere più scarse, come nel caso del confronto dei tre set di dati in questo studio. La Figura 4 mostra immagini rappresentative comparative e medie di classificazione 2D. Sebbene la concent...

Discussione

L'orientamento preferito delle particelle causato dall'aderenza del campione all'interfaccia aria-acqua è uno degli ultimi principali colli di bottiglia per la determinazione di routine della struttura ad alta risoluzione utilizzando cryo-EM SPA ^4,5,6. Lo schema di raccolta dei dati qui presentato fornisce una strategia facile da implementare per migliorare la distribuzione di orientamento delle particelle all'interno di un set...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01