Coleta de dados crio-EM de partícula única com inclinação do estágio usando Leginon

Resumo

O presente protocolo descreve um esquema generalizado e de fácil implementação para coleta de dados de partícula única inclinada em experimentos de crio-EM. Tal procedimento é especialmente útil para a obtenção de um mapa EM de alta qualidade para amostras que sofrem de viés de orientação preferencial devido à aderência à interface ar-água.

Resumo

A análise de partículas únicas (SPA) por microscopia crio-eletrônica (cryo-EM) é agora uma técnica convencional para biologia estrutural de alta resolução. A determinação da estrutura por SPA baseia-se na obtenção de múltiplas visões distintas de um objeto macromolecular vitrificado dentro de uma fina camada de gelo. Idealmente, uma coleção de orientações de projeção aleatória uniformemente distribuídas equivaleria a todas as visões possíveis do objeto, dando origem a reconstruções caracterizadas por resolução direcional isotrópica. No entanto, na realidade, muitas amostras sofrem de partículas preferencialmente orientadas aderindo à interface ar-água. Isso leva a distribuições de orientação angular não uniformes no conjunto de dados e amostragem não homogênea no espaço de Fourier na reconstrução, traduzindo-se em mapas caracterizados por resolução anisotrópica. A inclinação do estágio do espécime fornece uma solução generalizável para superar a anisotropia de resolução em virtude de melhorar a uniformidade das distribuições de orientação e, portanto, a isotropia da amostragem espacial de Fourier. O presente protocolo descreve uma estratégia de coleta de dados automatizada em estágio inclinado utilizando o software Leginon, para aquisição automatizada de imagens. O procedimento é simples de implementar, não requer nenhum equipamento ou software adicional e é compatível com a maioria dos microscópios eletrônicos de transmissão (METs) padrão usados para obtenção de imagens de macromoléculas biológicas.

Introdução

O advento dos detectores diretos de elétrons na última década ^1,2,3 estimulou um aumento exponencial no número de estruturas de alta resolução de macromoléculas e montagens macromoleculares resolvidas usando crio-EM de partícula única 4,5,6. Espera-se que quase todas as espécies macromoleculares purificadas sejam passíveis de determinação de estrutura usando crio-EM, exceto para as menores proteínas ~10 kDa em tamanho ou abaixo de⁷. A quantidade de material de partida necessária para a preparação da grade e determinação da estrutura é pelo menos uma ordem de grandeza menor do que outras técnicas de determinação de estrutura, como espectroscopia de ressonância magnética nuclear e cristalografia de raios X ^4,5,6.

No entanto, um dos principais desafios para a determinação de estruturas por crio-EM envolve a preparação adequada da grade para obtenção de imagens. Um extenso estudo avaliando diversas amostras usando diferentes estratégias e grades de vitrificação sugeriu que a maioria das abordagens para vitrificação de amostras em grades crio-EM leva à aderência preferencial de macromoléculas à interface ar-água⁸. Essa adesão pode potencialmente causar quatro desfechos subótimos: (1) a amostra macromolecular desnatura completamente, caso em que nenhuma coleta e processamento de dados bem-sucedidos é possível; (2) a amostra desnatura parcialmente, caso em que pode ser possível obter insights estruturais de regiões da macromolécula que não estão danificadas; (3) a amostra mantém a estrutura nativa, mas apenas um conjunto de orientações de partículas relativas à direção do feixe de elétrons é representado nas imagens; (4) a amostra mantém a estrutura nativa, e algumas, mas não todas as possíveis orientações de partículas relativas à direção do feixe de elétrons são representadas nas imagens. Para os casos (3) e (4), a coleta de dados inclinada ajudará a minimizar a anisotropia de resolução direcional que afeta o mapa crio-EM reconstruído e fornecerá uma solução generalizável para uma ampla variedade de amostras⁹. Tecnicamente, a inclinação também pode beneficiar o caso (2), uma vez que a desnaturação presumivelmente ocorre na interface ar-água e da mesma forma limita o número de orientações distintas representadas nos dados. A extensão do viés de orientação no conjunto de dados pode ser potencialmente alterada pela experimentação de aditivos de solução, mas a falta de ampla aplicabilidade dificulta essas abordagens de tentativa e erro. A inclinação do estágio do espécime em um único ângulo de inclinação otimizado é suficiente para melhorar a distribuição das orientações em virtude da alteração da geometria do experimento de imagem⁹ (Figura 1). Devido à configuração geométrica da amostra preferencialmente orientada em relação ao feixe de elétrons, para cada aglomerado de orientações preferenciais, a inclinação da grade gera um cone de ângulos de iluminação em relação ao centroide do aglomerado. Assim, isso espalha as vistas e, consequentemente, melhora a amostragem do espaço de Fourier e a isotropia da resolução direcional.

Há, na prática, alguns prejuízos para inclinar o palco. A inclinação do estágio da amostra introduz um gradiente de foco em todo o campo de visão, o que pode afetar a precisão das estimativas da função de transferência de contraste (CTF). A coleta de dados inclinada também pode levar ao aumento do movimento de partículas induzido pelo feixe causado pelo aumento dos efeitos de carga ao obter imagens de amostras inclinadas. A inclinação da grade também leva a um aumento na espessura aparente do gelo, o que, por sua vez, leva a micrografias mais ruidosas e pode, em última instância, afetar a resolução das reconstruções 5,9,10. Talvez seja possível superar essas questões aplicando esquemas computacionais avançados de processamento de dados que são brevemente descritos nas seções de protocolo e discussão. Por fim, a inclinação pode levar ao aumento da sobreposição de partículas, dificultando o pipeline de processamento de imagens subsequente. Embora isso possa ser mitigado até certo ponto otimizando a concentração de partículas na rede, não deixa de ser uma consideração importante. Descreve-se aqui um protocolo de simples implementação para coleta de dados inclinados utilizando a suíte de software Leginon (software de aquisição automatizada de imagens), disponível em acesso aberto e compatível com uma ampla gama de microscópios^11,12,13,14. O método requer pelo menos a versão 3.0 ou superior, com as versões 3.3 em diante contendo melhorias dedicadas para permitir a coleta de dados inclinados. Nenhum software ou equipamento adicional é necessário para este protocolo. Instruções extensas sobre infraestrutura computacional e guias de instalação são fornecidas em outro lugar¹⁵.

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Use grades contendo folha de ouro e suporte de grade de ouro¹⁶ (ver Tabela de Materiais) porque a coleta de dados inclinada pode acentuar o movimento induzido pelo feixe¹⁷.
   OBS: Para o presente estudo, as amostras em grades foram vitrificadas pela técnica de imersão manual e blotting¹⁸ em câmara fria umidificada (maior que 80%) (~4 °C).
2. Evitar o uso de grades contendo suporte de cobre e folha de carbono ou uma camada contínua de carbono amorfo, a menos que seja absolutamente necessário, pois essas grades podem levar a um maior movimento induzido pelo feixe¹⁶ quando o estágio do corpo de prova é inclinado.
   NOTA: Camadas de suporte alternativas, como grafeno/óxido de grafeno, parecem reduzir o movimento induzido pelo feixe em comparação com o carbono amorfo^19,20.
3. Pré-selecione grades e identifique regiões caracterizadas por espessura de gelo aceitável e distribuição de partículas. Grades contendo partículas muito bem compactadas levarão à sobreposição de partículas durante a coleta de dados inclinada, o que pode afetar as etapas de processamento de dados a jusante.
   NOTA: Essas etapas são subjetivas, uma vez que a identificação de boas áreas de gelo é realizada por meio da inspeção visual de imagens desfocadas em busca de regiões onde o contraste de partículas é nítido. Isso pode não ser viável para todas as amostras, uma vez que algumas amostras não se distribuem eficientemente em áreas de gelo fino, levando a desafios durante a coleta de dados (descrito na seção Discussão).
4. Vitrifique as grades contendo sua amostra de proteína. Aqui, para fins de demonstração, usamos a proteína DNA Protection during Starvation (DPS) (ver Tabela de Materiais) em uma faixa de 0,1-0,5 mg/mL com folha de ouro e grades de suporte de ouro.
   NOTA: A proteína foi purificada como descrito anteriormente, exceto que nenhuma clivagem de protease TEV^{foi realizada 21}. A faixa de concentração de proteínas para uma amostra de interesse terá que ser otimizada individualmente, uma vez que é difícil avaliar uma faixa ideal que seja universalmente aplicável e quase certamente variará entre diferentes amostras.

2. Configurando a coleta de dados inclinados

1. Alinhar o microscópio para garantir a iluminação paralela do espécime e minimizar as aberrações do coma²².
   NOTA: O microscópio deve estar bem alinhado para a coleta de dados padrão do SPA sem inclinação do estágio. Nenhum alinhamento especial é necessário para a coleta de dados inclinados, mas um bom alinhamento garantirá que a segmentação e a geração de imagens prossigam sem problemas. Um esquema geral comparando a coleta de dados inclinada e não inclinada é fornecido na Figura 2.
2. Registre um atlas de grade sem inclinação de estágio para identificar quadrados adequados para coleta de dados ou inspecione manualmente os quadrados na ampliação usada no Nó de Aquisição de Quadrados. Procure quadrados onde o papel alumínio esteja intacto, não pareça desidratado e tenha espessura de gelo ideal.
   NOTA: O nó de aquisição quadrado é o nó de baixa ampliação usado para imagens em várias escalas no Leginon.
   1. Para a coleta de dados automatizada sem inclinação típica, registre um atlas de grade, que fornece uma visão geral da qualidade geral da grade e uma indicação inicial de áreas adequadas para a coleta de dados.
   2. Posteriormente, selecione os quadrados adequados através do atlas e envie-os para a fila. Em seguida, através da seleção manual de furos ou através do localizador de furos EM automatizado, enfileire e envie os alvos de furos.
   3. Finalmente, use o localizador de furos EM automatizado para enviar alvos de exposição de alta ampliação.
      Observação : para coleta de dados inclinados, os quadrados podem precisar ser enfileirados manualmente para obter resultados consistentes, especialmente se o ângulo de inclinação ideal não tiver sido pré-determinado e provavelmente será ajustado durante a coleta de dados. O atlas da grade também poderia ser registrado usando uma inclinação de estágio pré-definida se o ângulo de inclinação usado para a coleta de dados tivesse sido previamente estabelecido.
3. Mova o estágio do espécime para um quadrado de interesse.
4. Determine a altura eucêntrica para a posição do palco usando α-wobbler em ± inclinação de 15° do estágio. Ajuste a altura Z para levar o palco à altura eucêntrica usando o painel do teclado para o microscópio. Certifique-se de que a mudança de imagem seja mínima durante a rotina de oscilação de α.
   NOTA: Se a altura eucêntrica não for identificada corretamente, um grande deslocamento da imagem será observado ao inclinar o palco na ampliação quadrada. Isso também pode acontecer se houver deformações locais na grade, por exemplo, se a grade estiver quebrada ou severamente dobrada nas proximidades da área fotografada. Embora seja melhor evitar tais regiões para a coleta de dados, é imperativo estimar com precisão a altura eucêntrica se estas representarem uma das poucas regiões promissoras para a coleta de dados. A Figura 3 mostra como a segmentação sem identificar adequadamente a altura eucêntrica pode causar grandes mudanças de imagem na ampliação quadrada.
5. Encontre uma altura Z mais precisa, use o nó Focuser e pressione Simular.
   1. Normalmente, estime a altura Z no nó Focuser na ampliação usada no Nó de aquisição quadrado.
      NOTA: A sequência de foco do nó Focuser também pode incluir uma estimativa fina de foco Z na ampliação do nó Hole Acquisition (uma ferramenta no software Leginon) durante a coleta de dados.
   2. Ajuste as configurações do nó Focuser e ative/desative a opção de foco Z fino durante a fila inicial de quadrados.
      NOTA: É importante garantir que a altura eucêntrica seja identificada com precisão quando a coleta automatizada de dados começar, o que pode exigir a reativação do foco Z fino (etapa 2.10).
6. Incline o estágio do espécime para o ângulo de inclinação desejado para a coleta de dados na altura eucêntrica verdadeira e reccentralize o estágio, se necessário. Os ângulos de inclinação de 0°, 30° e 60° foram utilizados para este estudo. Pressione Simular no nó Square Acquisition para começar a enfileirar destinos para exposições de nó de Aquisição de furo .
   NOTA: Conforme indicado na etapa 2.2.1, o atlas de grade pode ser gravado usando uma inclinação de estágio pré-definida, o que evitaria a necessidade de inclinar o estágio novamente nesta etapa. Isso funciona bem e acelera o processo se o ângulo de inclinação usado para a coleta de dados for predefinido. O protocolo atual é escrito com novos espécimes em mente, onde o usuário pode desejar testar diferentes ângulos de inclinação para a coleta de dados.
7. Selecione um alvo de foco Z e regiões com furos adequados para exposições de alta ampliação.
8. Pressione Enviar destinos para a fila de geração de imagens. Não pressione Enviar destinos em fila até terminar de enfileirar todos os quadrados.
9. Traga o estágio do espécime de volta ao seu estado inclinado. Passe para o próximo quadrado e repita as etapas 2.3-2.8 até que um número adequado de exposições de furos tenha sido enfileirado.
10. Vá para o Hole Targeting Node e pressione Submit Queued Targets quando todos os quadrados estiverem na fila.
    NOTA: Se o foco Z fino foi desativado anteriormente para economizar tempo (etapa 2.5), ele precisará ser reativado antes de enviar a fila.
11. Inspecione manualmente os alvos selecionados pelo nó de aquisição de exposição de alta ampliação para testar se o localizador de furos EM automatizado pode identificar com precisão as regiões adequadas para aquisição de imagens quando o estágio da amostra é inclinado.
    1. Durante este procedimento, selecione 'Permitir a verificação do usuário de alvos selecionados' nas configurações do nó Aquisição de exposição . Quando o usuário estiver satisfeito com a precisão da segmentação, desmarque essa opção para coleta automatizada de dados.
       NOTA: Alvos em alta magnificação do nó de aquisição de exposição são tipicamente imageados usando uma estratégia de deslocamento de imagem de inclinação do feixe, que funciona igualmente bem para coleta de dados inclinados e não inclinados^23,24,25,26. Para uma estimativa precisa do CTF nas etapas de processamento de dados a jusante, a calibração da aberração do coma da lente deve ser realizada para a estratégia de coleta de dados de deslocamento de imagem de inclinação do feixe.

3. Processamento de Dados

1. Iniciar o processamento de dados em tempo real 10,27,28,29 com correção de movimento de filmes gravados^, estimativa de CTF, seleção de partículas e geração de reconstruções iniciais durante a coleta de dados.
   NOTA: Para o presente estudo, o cryoSPARC Live¹⁰ (ver Tabela de Materiais) foi utilizado para pré-processamento. O processamento de dados em tempo real fornece uma reconstrução crio-EM inicial e uma aproximação para a distribuição angular, que pode informar o usuário sobre a extensão da anisotropia de resolução. Estes, por sua vez, podem ser usados para orientar o usuário sobre se o ângulo de inclinação usado para a coleta de dados é ou não suficientemente alto.
2. Visualize o mapa reconstruído e plote a distribuição do ângulo de Euler para medir a extensão das orientações de partículas preferidas.
   NOTA: As distribuições do ângulo de Euler podem ser convertidas diretamente em distribuições de amostragem no espaço de Fourier para determinar a extensão potencial da anisotropia de resolução. Uma interface gráfica com o usuário (GUI) foi desenvolvida para auxiliar o usuário na avaliação da qualidade de uma distribuição do ângulo de Euler e na determinação de um ângulo de inclinação ótimo^30,31. A ferramenta pode ser obtida no repositório do Github, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui.
3. Se necessário, ajuste o ângulo de inclinação do estágio no qual os dados são coletados para superar os efeitos da orientação preferencial. O ângulo pode ser aumentado se a orientação preferencial permanecer um problema, como evidenciado pelo mapa e distribuição de Euler em 3.2. Alternativamente, o usuário pode querer dividir a coleta de dados em grupos e gravar usando vários ângulos de inclinação diferentes, como 20°, 30° e 40°.
   NOTA: Embora a maioria dos TEMs deva ter a capacidade de inclinar o estágio para 70°, as inclinações comuns do estágio do espécime (que usamos) variam de 20°-40°.

Resultados

A estimulação diafragmática por pressão diafragmática de 0,3 mg/mL foi usada para demonstrar imagens com inclinações de 0°, 30° e 60°. Dados de diferentes ângulos de inclinação foram coletados na mesma malha em diferentes regiões da grade. A resolução do CTF para inclinações angulares mais altas tende a ser pior, como foi o caso ao comparar os três conjuntos de dados neste estudo. A Figura 4 demonstra as imagens representativas comparativas e as médias de classificação ...

Discussão

A orientação preferencial das partículas causada pela aderência do espécime à interface ar-água é um dos últimos grandes gargalos para a determinação rotineira de estruturas de alta resolução usando o SPA crio-EM ^4,5,6. O esquema de coleta de dados apresentado aqui fornece uma estratégia fácil de implementar para melhorar a distribuição de orientação das partículas dentro de um conjunto de dados. Ressaltamos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01