Сбор данных о крио-ЭМ с одной частицей с наклоном ступени с помощью Leginon

Резюме

В настоящем протоколе описана обобщенная и простая в реализации схема наклонного сбора данных об одночастичных частицах в крио-ЭМ-экспериментах. Такая процедура особенно полезна для получения высококачественной ЭМ-карты для образцов, страдающих преимущественным смещением ориентации из-за прилипания к границе раздела воздух-вода.

Аннотация

Анализ отдельных частиц (SPA) с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) в настоящее время является основным методом структурной биологии высокого разрешения. Определение структуры с помощью SPA основано на получении нескольких различных изображений макромолекулярного объекта, остеклованного в тонком слое льда. В идеале совокупность равномерно распределенных ориентаций случайной проекции должна составлять все возможные виды объекта, что приводит к реконструкциям, характеризующимся изотропным направленным разрешением. Однако в действительности многие образцы страдают от предпочтительно ориентированных частиц, прилипших к границе раздела воздух-вода. Это приводит к неравномерным распределениям угловой ориентации в наборе данных и неоднородной выборке в пространстве Фурье при реконструкции, что приводит к отображениям, характеризующимся анизотропным разрешением. Наклон ступени образца обеспечивает обобщаемое решение для преодоления анизотропии разрешения за счет улучшения однородности ориентационных распределений и, следовательно, изотропии дискретизации пространства Фурье. Настоящий протокол описывает стратегию автоматизированного сбора данных с наклонной стадией с использованием Leginon, программного обеспечения для автоматического получения изображений. Процедура проста в реализации, не требует какого-либо дополнительного оборудования или программного обеспечения и совместима с большинством стандартных просвечивающих электронных микроскопов (ПЭМ), используемых для визуализации биологических макромолекул.

Введение

Появление детекторов прямых электронов за последнее десятилетие ^1,2,3 стимулировало экспоненциальный рост числа структур высокого разрешения макромолекул и макромолекулярных сборок, решаемых с помощью одночастичных крио-ЭМ ^4,5,6. Ожидается, что почти все очищенные макромолекулярные частицы будут поддаваться определению структуры с помощью крио-ЭМ, за исключением мельчайших белков размером ~ 10 кДа или менее⁷. Количество исходного материала, необходимого для подготовки сетки и определения структуры, по крайней мере, на порядок меньше, чем у других методов определения структуры, таких как спектроскопия ядерного магнитного резонанса и рентгеновская кристаллография ^4,5,6.

Тем не менее, основная проблема для определения структуры с помощью крио-ЭМ связана с подходящей подготовкой сетки для визуализации. Обширное исследование, оценивающее различные образцы с использованием различных стратегий и сеток витрификации, показало, что большинство подходов к витрификации образцов на крио-электромагнитных сетках приводят к преимущественному присоединению макромолекул к границе раздела^{воздух-вода 8}. Такая приверженность потенциально может привести к четырем неоптимальным результатам: (1) макромолекулярный образец полностью денатурирует, и в этом случае успешный сбор и обработка данных невозможны; (2) образец частично денатурируется, и в этом случае можно получить структурную информацию из областей макромолекулы, которые не повреждены; (3) образец сохраняет нативную структуру, но на изображениях представлен только один набор ориентаций частиц относительно направления электронного пучка; (4) образец сохраняет нативную структуру, и некоторые, но не все возможные ориентации частиц относительно направления электронного пучка представлены на изображениях. Для случаев (3) и (4) наклонный сбор данных поможет свести к минимуму анизотропию направленного разрешения, влияющую на реконструированную крио-ЭМ-карту, и обеспечит обобщаемое решение для широкого спектра образцов⁹. С технической точки зрения, наклон также может принести пользу в случае (2), поскольку денатурация, по-видимому, происходит на границе раздела воздух-вода и аналогичным образом ограничивает количество различных ориентаций, представленных в данных. Степень смещения ориентации в наборе данных потенциально может быть изменена путем экспериментов с добавками раствора, но отсутствие широкой применимости препятствует этим подходам методом проб и ошибок. Наклон столика образца на один оптимизированный угол наклона достаточен для улучшения распределения ориентаций за счет изменения геометрии эксперимента⁹ (рис. 1). Из-за геометрической конфигурации предпочтительно ориентированного образца по отношению к электронному пучку для каждого кластера преимущественных ориентаций наклон сетки создает конус углов освещения по отношению к центроиду кластера. Следовательно, это расширяет представления и, следовательно, улучшает дискретизацию пространства Фурье и изотропию направленного разрешения.

На практике есть некоторые недостатки в наклоне сцены. Наклон предметного столика образца приводит к градиенту фокусировки по всему полю зрения, что может повлиять на точность оценки функции переноса контраста (CTF). Сбор данных под наклоном также может привести к увеличению движения частиц, вызванного пучком, вызванным усилением эффектов зарядки при визуализации наклонных образцов. Наклон сетки также приводит к увеличению кажущейся толщины льда, что, в свою очередь, приводит к более шумным микрофотографиям и может в конечном итоге повлиять на разрешение реконструкций 5,9,10. Эти проблемы можно преодолеть, применяя передовые схемы обработки вычислительных данных, которые кратко описаны в разделах, посвященных протоколу и обсуждению. Наконец, наклон может привести к увеличению перекрытия частиц, что затруднит последующую обработку изображений. Хотя это можно в некоторой степени смягчить, оптимизировав концентрацию частиц на сетке, это, тем не менее, важное соображение. Здесь описан простой в реализации протокол для наклонного сбора данных с использованием программного пакета Leginon (программное обеспечение для автоматического получения изображений), доступного в открытом доступе и совместимого с широким спектром микроскопов^11,12,13,14. Для этого метода требуется как минимум версия 3.0 или выше, а версии 3.3 и более поздние версии содержат специальные улучшения для включения наклонного сбора данных. Для этого протокола не требуется никакого дополнительного программного обеспечения или оборудования. Подробные инструкции по вычислительной инфраструктуре и руководства по установке приведены в других разделах¹⁵.

протокол

1. Пробоподготовка

1. Используйте сетки, содержащие золотую фольгу и золотую опору¹⁶ сетки (см. Таблицу материалов), поскольку сбор данных под наклоном может усилить движение, вызванное лучом¹⁷.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования образцы на решетках были остеклованы с использованием метода ручного погружения и промокания¹⁸ в увлажненной (более 80%) холодильной камере (~ 4 ° C).
2. Избегайте использования решеток, содержащих медную опору и углеродную фольгу, или сплошного слоя аморфного углерода, если в этом нет крайней необходимости, так как эти решетки могут привести к большему движению, вызванному^лучом16 , когда ступень образца наклонена.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные опорные слои, такие как графен/оксид графена, по-видимому, уменьшают движение, вызванное пучком, по сравнению с аморфным углеродом^19,20.
3. Предварительно просеивайте сетки и выявляйте области, характеризующиеся приемлемой толщиной льда и распределением частиц. Сетки, содержащие слишком плотно упакованные частицы, приведут к перекрытию частиц во время наклонного сбора данных, что может повлиять на последующие этапы обработки данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги субъективны, поскольку идентификация хороших участков льда выполняется путем визуального осмотра расфокусированных изображений для областей, где контраст частиц ясен. Это может быть неосуществимо для всех образцов, поскольку некоторые образцы не будут эффективно распределяться в областях тонкого льда, что приведет к проблемам при сборе данных (описано в разделе «Обсуждение»).
4. Витризуйте решетки, содержащие образец белка. Здесь, в демонстрационных целях, мы используем белок ДНК-защиты во время голодания (DPS) (см. Таблицу материалов) в диапазоне от 0,1 до 0,5 мг / мл с золотой фольгой и золотыми опорными сетками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Белок очищали, как описано ранее, за исключением того, что расщепление протеазы TEV не проводилось²¹. Диапазон концентрации белка для интересующего образца должен быть оптимизирован индивидуально, поскольку трудно определить идеальный диапазон, который является универсально применимым и почти наверняка будет варьироваться между различными образцами.

2. Настройка наклонного сбора данных

1. Выровняйте микроскоп, чтобы обеспечить параллельное освещение образца и свести к минимуму аберрации комы²².
   ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскоп должен быть хорошо выровнен для стандартного сбора данных SPA без наклона сцены. Для сбора данных под наклоном не требуется никаких специальных выравниваний, но хорошее выравнивание обеспечит плавное нацеливание и визуализацию. Общая схема, сравнивающая сбор данных под наклоном и без наклона, представлена на рисунке 2.
2. Запишите атлас сетки без наклона сцены, чтобы определить квадраты, подходящие для сбора данных, или вручную проверьте квадраты с увеличением, используемым в Square Acquisition Node. Ищите квадраты, где фольга не повреждена, не выглядит обезвоженной и имеет идеальную толщину льда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Square Acquisition Node — это узел с малым увеличением, используемый для многомасштабной визуализации в Leginon.
   1. Для типичного автоматизированного сбора данных без наклона запишите атлас сетки, который обеспечивает общее качество сетки и первоначальное указание подходящих областей для сбора данных.
   2. Впоследствии выберите подходящие квадраты через атлас и отправьте их в очередь. Затем, либо с помощью ручного выбора отверстий, либо с помощью автоматизированного ЭМ-искателя отверстий, ставьте в очередь и отправляйте цели для отверстий.
   3. Наконец, используйте автоматический искатель электромагнитных отверстий для отправки целей экспозиции с большим увеличением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора данных под наклоном может потребоваться поставить квадраты в очередь вручную для получения согласованных результатов, особенно если оптимальный угол наклона не был заранее определен и, вероятно, будет скорректирован во время сбора данных. Атлас сетки можно было бы также регистрировать с использованием заранее определенного наклона сцены, если угол наклона, используемый для сбора данных, был установлен ранее.
3. Переместите стадию образца в интересующий квадрат.
4. Определите эуцентрическую высоту положения сцены с помощью α-воблера при наклоне сцены ± 15°. Отрегулируйте высоту Z, чтобы довести предметный столик до эуцентрической высоты, используя панель клавиатуры микроскопа. Убедитесь, что сдвиг изображения минимален во время процедуры колебания α.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если эуцентрическая высота не определена должным образом, при наклоне сцены при квадратном увеличении будет наблюдаться большой сдвиг изображения. Это также может произойти, если на сетке есть локальные деформации, например, если сетка сломана или сильно изогнута в непосредственной близости от изображаемой области. Хотя для сбора данных лучше избегать таких регионов, крайне важно точно оценить эуцентрическую высоту, если они представляют собой один из немногих перспективных регионов для сбора данных. На рисунке 3 показано, как нацеливание без правильной идентификации эуцентрической высоты может привести к большим сдвигам изображения в квадратном увеличении.
5. Найдите более точную высоту Z, используйте узел «Фокусер» и нажмите «Имитировать».
   1. Как правило, оценивают высоту Z в узле фокусера по увеличению, используемому в узле Square Acquisition Node.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность фокусировки узла Focuser также может включать в себя точную оценку фокуса Z на узле Hole Acquisition (инструмент в программном обеспечении Leginon) во время сбора данных.
   2. Отрегулируйте настройки узла «Фокусер » и включите/отключите параметр точной фокусировки Z во время первоначальной очереди квадратов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно убедиться, что эуцентрическая высота точно определена при начале автоматического сбора данных, что может потребовать повторного включения точного фокуса Z (шаг 2.10).
6. Наклоните столик образца на желаемый угол наклона для сбора данных на истинной эуцентрической высоте и при необходимости повторно центрируйте столик. Для этого исследования использовались углы наклона 0°, 30° и 60°. Нажмите кнопку Simulate в узле Square Acquisition, чтобы начать постановку в очередь целевых объектов для экспозиции узла Hole Acquisition .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как указано в шаге 2.2.1, атлас сетки может быть записан с использованием заранее определенного наклона ступени, что устранит необходимость повторного наклона ступени на этом этапе. Это хорошо работает и ускоряет процесс, если угол наклона, используемый для сбора данных, заранее определен. Текущий протокол написан с учетом новых образцов, в которых пользователь может пожелать протестировать различные углы наклона для сбора данных.
7. Выберите цель фокусировки по оси Z и области с отверстиями, подходящими для экспозиции с большим увеличением.
8. Нажмите кнопку Отправить целевые объекты в очередь для создания образа. Не нажимайте кнопку «Отправить целевые объекты в очереди», пока не завершите постановку в очередь всех квадратов.
9. Верните стадию образца в ненаклоненное состояние. Перейдите к следующему квадрату и повторяйте шаги 2.3-2.8 до тех пор, пока не будет поставлено в очередь достаточное количество экспозиций отверстий.
10. Перейдите к узлу Hole Targeting и нажмите Submit Queued Targets после того, как все квадраты будут поставлены в очередь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если фокус Z был отключен ранее для экономии времени (шаг 2.5), его необходимо снова включить перед отправкой в очередь.
11. Вручную проверяйте цели, выбранные узлом сбора экспозиции с большим увеличением, чтобы проверить, может ли автоматический искатель электромагнитных отверстий точно идентифицировать подходящие области для получения изображения при наклоне предметного столика образца.
    1. Во время этой процедуры выберите «Разрешить пользователю проверку выбранных целей» в настройках узла «Сбор экспозиции ». Как только пользователь будет удовлетворен точностью таргетинга, отмените выбор этого параметра для автоматического сбора данных.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Цели с большим увеличением узла сбора экспозиции обычно визуализируются с использованием стратегии сдвига изображения с наклоном луча, которая одинаково хорошо работает как для наклонного, так и для ненаклонного сбора данных 23,24,25,26. Для точной оценки CTF на последующих этапах обработки данных необходимо выполнить калибровку аберрации объектива-комы для стратегии сбора данных о сдвиге изображения с наклоном луча.

3. Обработка данных

1. Инициируйте обработку данных «на лету» 10,27,28,29 с коррекцией движения записанных видеороликов^, оценкой CTF, отбором частиц и генерацией начальных реконструкций во время сбора данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании для предварительной обработки использовался cryoSPARC Live¹⁰ (см. Таблицу материалов). Обработка данных «на лету» обеспечивает начальную крио-ЭМ-реконструкцию и аппроксимацию углового распределения, которая может информировать пользователя о степени анизотропии разрешения. Они, в свою очередь, могут использоваться для информирования пользователя о том, является ли угол наклона, используемый для сбора данных, достаточно высоким.
2. Визуализируйте реконструированную карту и постройте распределение углов Эйлера, чтобы оценить степень предпочтительной ориентации частиц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Распределения углов Эйлера могут быть преобразованы непосредственно в распределения выборки в пространстве Фурье для определения потенциальной степени анизотропии разрешения. Графический пользовательский интерфейс (GUI) был разработан, чтобы помочь пользователю оценить качество распределения углов Эйлера и определить оптимальный угол наклона^30,31. Инструмент можно получить из репозитория Github, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui.
3. При необходимости отрегулируйте угол наклона сцены, под которым собираются данные, чтобы преодолеть последствия предпочтительной ориентации. Угол может быть увеличен, если предпочтительная ориентация остается проблемой, о чем свидетельствуют карта и распределение Эйлера в 3.2. В качестве альтернативы пользователь может пожелать разделить сбор данных на группы и записать с использованием нескольких различных углов наклона, таких как 20°, 30° и 40°.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что большинство ПЭМ должны иметь возможность наклона ступени до 70°, обычные наклоны ступени образца (которые мы использовали) варьируются от 20° до 40°.

Результаты

DPS в дозе 0,3 мг/мл использовался для демонстрации визуализации при наклонах 0°, 30° и 60°. Данные с разных углов наклона были собраны на одной и той же сетке в разных областях сетки. Разрешение CTF подходит для более высоких угловых наклонов, как правило, хуже, как это было при сравнении трех на...

Обсуждение

Предпочтительная ориентация частиц, обусловленная прилипанием образца к границе раздела воздух-вода, является одним из последних серьезных узких мест для рутинного определения структуры с высоким разрешением с использованием крио-ЭМ SPA ^4,5,6

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01