איסוף נתוני Cryo-EM של חלקיק יחיד עם הטיית במה באמצעות Leginon

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר סכמה כללית וקלה ליישום לאיסוף נתונים מוטים של חלקיק יחיד בניסויי cryo-EM. הליך כזה שימושי במיוחד לקבלת מפת EM באיכות גבוהה עבור דגימות הסובלות מהטיה אוריינטציה מועדפת עקב היצמדות לממשק אוויר-מים.

Abstract

ניתוח חלקיק יחיד (SPA) על ידי מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים (cryo-EM) הוא כיום טכניקה מקובלת לביולוגיה מבנית ברזולוציה גבוהה. קביעת מבנה על ידי SPA מסתמכת על קבלת תצוגות שונות מרובות של עצם מקרומולקולרי המזוגג בתוך שכבה דקה של קרח. באופן אידיאלי, אוסף של כיווני הקרנה אקראיים המפוזרים באופן אחיד יסתכם בכל התצוגות האפשריות של האובייקט, ויולידו שחזורים המאופיינים ברזולוציה כיוונית איזוטרופית. עם זאת, במציאות, דגימות רבות סובלות מחלקיקים בעלי אוריינטציה מועדפת הנצמדים לממשק אוויר-מים. זה מוביל להתפלגויות אוריינטציה זוויתית לא אחידות במערך הנתונים ולדגימת מרחב פורייה לא הומוגנית בשחזור, המתורגמת למפות המאופיינות ברזולוציה אנאיזוטרופית. הטיית שלב הדגימה מספקת פתרון הניתן להכללה להתגברות על אנאיזוטרופיה ברזולוציה מכוח שיפור אחידות התפלגות הכיוון, ובכך האיזוטרופיה של דגימת מרחב פורייה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיית איסוף נתונים אוטומטית בשלב מוטה באמצעות Leginon, תוכנה לרכישת תמונות אוטומטית. ההליך פשוט ליישום, אינו דורש ציוד או תוכנה נוספים, ותואם לרוב מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת סטנדרטי (TEMs) המשמש להדמיית מקרומולקולות ביולוגיות.

Introduction

הופעתם של גלאי אלקטרונים ישירים במהלך העשור האחרון ^1,2,3 דרבנה עלייה אקספוננציאלית במספר מבנים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולות ומכלולים מקרומולקולריים שנפתרו באמצעות קריו-EM 4,5,6 של חלקיק יחיד. כמעט כל המינים המקרומולקולריים המטוהרים צפויים להיות מקובלים לקביעת מבנה באמצעות cryo-EM, למעט החלבונים הקטנים ביותר ~ 10 kDa בגודל או מתחת ל -⁷. כמות חומר המוצא הדרושה להכנת רשת ולקביעת מבנה היא לפחות בסדר גודל קטן יותר מטכניקות אחרות לקביעת מבנה, כגון ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית וקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ^4,5,6.

עם זאת, אתגר עיקרי לקביעת מבנה על ידי cryo-EM כרוך בהכנת רשת מתאימה להדמיה. מחקר מקיף שהעריך דגימות מגוונות באמצעות אסטרטגיות ויטריפיקציה ורשתות שונות הציע כי רוב הגישות לדגימות ויטריפיקציה ברשתות cryo-EM מובילות להיצמדות מועדפת של מקרומולקולות לממשק אוויר-מים⁸. היצמדות כזו עלולה לגרום לארבע תוצאות תת-אופטימליות: (1) הדגימה המקרומולקולרית מתפרקת לחלוטין, ובמקרה כזה לא ניתן לאסוף ולעבד נתונים מוצלחים; (2) הדגימה מנטרלת חלקית, ובמקרה כזה ניתן יהיה לקבל תובנות מבניות מאזורים במקרומולקולה שאינם פגומים; (3) הדגימה שומרת על מבנה מקורי, אך רק קבוצה אחת של כיווני חלקיקים ביחס לכיוון קרן האלקטרונים מיוצגת בתמונות; (4) הדגימה שומרת על מבנה מקורי, וחלק מכיווני החלקיקים האפשריים, אם כי לא כולם, ביחס לכיוון קרן האלקטרונים מיוצגים בתמונות. במקרים (3) ו-(4), איסוף נתונים מוטים יסייע במזעור אנאיזוטרופיה ברזולוציה כיוונית המשפיעה על מפת cryo-EM המשוחזרת ומספק פתרון הניתן להכללה למגוון רחב של דגימות⁹. מבחינה טכנית, הטיה יכולה להועיל גם במקרה (2), מכיוון שהדנטורציה מתרחשת ככל הנראה בממשק אוויר-מים ומגבילה באופן דומה את מספר הכיוונים השונים המיוצגים בתוך הנתונים. ניתן לשנות את מידת הטיית ההתמצאות במערך הנתונים באופן פוטנציאלי על ידי ניסויים בתוספי תמיסה, אך היעדר ישימות רחבה מעכב גישות אלה של ניסוי וטעייה. די בהטיית שלב הדגימה בזווית הטיה אופטימלית אחת כדי לשפר את התפלגות הכיוונים הודות לשינוי הגיאומטריה של ניסוי ההדמיה⁹ (איור 1). בשל התצורה הגיאומטרית של המדגם המכוון המועדף ביחס לקרן האלקטרונים, עבור כל צביר של כיוונים מועדפים, הטיית הרשת יוצרת חרוט של זוויות הארה ביחס לצביר. לפיכך, זה מפזר את התצוגות וכתוצאה מכך משפר את דגימת מרחב פורייה ואת האיזוטרופיה של רזולוציה כיוונית.

יש, בפועל, כמה נזקים להטיית הבמה. הטיית שלב הדגימה מציגה מעבר צבע מיקוד על פני שדה הראייה, שעשוי להשפיע על דיוק הערכות פונקציית העברת הניגודיות (CTF). איסוף נתונים מוטים עשוי גם להוביל לתנועת חלקיקים מוגברת הנגרמת על ידי אלומה הנגרמת על ידי השפעות טעינה מוגברות בעת הדמיה של דגימות מוטות. הטיית הרשת מובילה גם לעלייה בעובי הקרח הנראה לעין, מה שבתורו מוביל למיקרוגרפים רועשים יותר ועשוי בסופו של דבר להשפיע על הרזולוציה של שחזורים 5,9,10. ייתכן שניתן יהיה להתגבר על בעיות אלה על ידי יישום סכמות עיבוד נתונים חישוביות מתקדמות המתוארות בקצרה בסעיפי הפרוטוקול והדיון. לבסוף, הטיה יכולה להוביל לחפיפה מוגברת של חלקיקים, ולעכב את צינור עיבוד התמונה הבא. למרות שניתן למתן זאת במידה מסוימת על ידי אופטימיזציה של ריכוז החלקיקים ברשת, זהו בכל זאת שיקול חשוב. כאן, מתואר פרוטוקול פשוט ליישום לאיסוף נתונים מוטים באמצעות חבילת התוכנה Leginon (תוכנה אוטומטית לרכישת תמונות), זמין בגישה פתוחה ותואם למגוון רחב של מיקרוסקופים^11,12,13,14. השיטה דורשת לפחות גרסה 3.0 ומעלה, כאשר גרסאות 3.3 ואילך מכילות שיפורים ייעודיים כדי לאפשר איסוף נתונים מוטה. אין צורך בתוכנה או ציוד נוספים עבור פרוטוקול זה. הוראות נרחבות בנושא תשתיות חישוביות ומדריכי התקנה ניתנים במקום אחר¹⁵.

Protocol

1. הכנת מדגם

1. השתמש ברשתות המכילות רדיד זהב ותמיכה ברשת זהב¹⁶ (ראה טבלת חומרים) מכיוון שאיסוף נתונים מוטה יכול להדגיש תנועה הנגרמת על ידי קרן¹⁷.
   הערה: עבור המחקר הנוכחי, דגימות על רשתות היו זגוגית באמצעות טכניקת צלילה ידנית ו blotting¹⁸ בחדר קר לח (יותר מ 80%) (~ 4 ° C).
2. הימנע משימוש ברשתות המכילות תמיכת נחושת ורדיד פחמן או שכבה רציפה של פחמן אמורפי אלא אם כן הדבר הכרחי לחלוטין, מכיוון שרשתות אלה עלולות להוביל לתנועה גדולה יותר הנגרמת על ידי קרן¹⁶ כאשר שלב הדגימה מוטה.
   הערה: נראה כי שכבות תמיכה חלופיות, כגון תחמוצת גרפן/גרפן, מפחיתות את התנועה הנגרמת על ידי הקרן בהשוואה לפחמן אמורפי^19,20.
3. סנן מראש רשתות וזהה אזורים המאופיינים בעובי קרח מקובל ובפיזור חלקיקים. רשתות המכילות חלקיקים צפופים מדי יובילו לחפיפת חלקיקים במהלך איסוף נתונים מוטה, דבר שעשוי להשפיע על שלבי עיבוד הנתונים במורד הזרם.
   הערה: צעדים אלה הם סובייקטיביים מאחר שזיהוי אזורים טובים של קרח מתבצע על ידי בדיקה חזותית של תמונות לא ממוקדות עבור אזורים שבהם ניגודיות החלקיקים ברורה. ייתכן שהדבר לא יהיה ריאלי עבור כל הדגימות מכיוון שחלק מהדגימות לא יפוזרו ביעילות באזורים של קרח דק, מה שיוביל לאתגרים במהלך איסוף הנתונים (המתוארים בסעיף הדיון).
4. ויטריפיק את הרשתות המכילות את דגימת החלבון שלך. כאן, למטרות הדגמה, אנו משתמשים בחלבון DNA Protection during Starvation (DPS) (ראו טבלת חומרים) בטווח שבין 0.1-0.5 מ"ג/מ"ל עם רדיד זהב ורשתות תמיכה מזהב.
   הערה: החלבון טוהר כפי שתואר קודם לכן, למעט לא בוצע מחשוף פרוטאז TEV²¹. טווח ריכוז החלבון עבור מדגם מעניין יצטרך להיות מותאם בנפרד, שכן קשה לאמוד טווח אידיאלי שהוא ישים באופן אוניברסלי וכמעט בוודאות ישתנה בין דגימות שונות.

2. הגדרת איסוף נתונים מוטים

1. יישרו את המיקרוסקופ כדי להבטיח הארה מקבילה של הדגימה ולמזער סטיות בתרדמת²².
   הערה: המיקרוסקופ חייב להיות מיושר היטב לאיסוף נתוני SPA סטנדרטיים ללא הטיית במה. אין צורך ביישור מיוחד לאיסוף נתונים מוטים, אך יישור טוב יבטיח שהמיקוד וההדמיה יתקדמו בצורה חלקה. סכמה כללית המשווה איסוף נתונים מוטים ולא מוטים מוצגת באיור 2.
2. הקלט אטלס רשת ללא הטיית שלב כדי לזהות ריבועים המתאימים לאיסוף נתונים או בדוק ריבועים באופן ידני בהגדלה המשמשת בצומת רכישת ריבועים. חפשו ריבועים שבהם נייר הכסף שלם, אינו נראה מיובש ובעל עובי קרח אידיאלי.
   הערה: צומת רכישה ריבועי הוא צומת ההגדלה הנמוכה המשמש להדמיה בקנה מידה רב בלגינון.
   1. לאיסוף נתונים אוטומטי טיפוסי ללא הטיה, רשום אטלס רשת, המספק סקירה כללית של איכות הרשת הכוללת ואינדיקציה ראשונית לאזורים מתאימים לאיסוף נתונים.
   2. לאחר מכן, בחר ריבועים מתאימים דרך האטלס ושלח אותם לתור. לאחר מכן, באמצעות בחירה ידנית של חורים או באמצעות מאתר חורי EM אוטומטי, עמדו בתור והגישו את יעדי החורים.
   3. לבסוף, השתמש במאתר חורי EM אוטומטי להגשת יעדי חשיפה להגדלה גבוהה.
      הערה: עבור איסוף נתונים מוטים, ייתכן שיהיה צורך להציב ריבועים בתור באופן ידני לקבלת תוצאות עקביות, במיוחד אם זווית ההטיה האופטימלית לא נקבעה מראש וסביר להניח שהיא תותאם במהלך איסוף הנתונים. אטלס הרשת יכול היה גם להיות מוקלט באמצעות הטיית במה מוגדרת מראש אם זווית ההטיה המשמשת לאיסוף נתונים נקבעה קודם לכן.
3. הזיזו את שלב הדגימה לריבוע עניין.
4. קבע את הגובה האוצנטרי למיקום הבמה באמצעות α-נדנוד בהטיית הבמה ± 15°. כוונן את גובה Z כדי להביא את הבמה לגובה אאוצנטרי באמצעות לוח המקשים עבור המיקרוסקופ. ודא שהיסט התמונה מינימלי במהלך שגרת α הנדנודים.
   הערה: אם הגובה האוצנטרי אינו מזוהה כראוי, ייראה שינוי תמונה גדול בעת הטיית הבמה בהגדלה הריבועית. זה יכול לקרות גם אם יש עיוותים מקומיים ברשת, לדוגמה, אם הרשת שבורה או כפופה מאוד בקרבת האזור המצולם. למרות שעדיף להימנע מאזורים כאלה לאיסוף נתונים, חובה להעריך במדויק את הגובה האוצנטרי אם אלה מייצגים את אחד האזורים המבטיחים המעטים לאיסוף נתונים. איור 3 מראה כיצד מיקוד ללא זיהוי נכון של גובה אאוצנטרי יכול לגרום לשינויים גדולים בתמונה בהגדלה הריבועית.
5. מצא גובה Z מדויק יותר, השתמש בצומת מיקוד ולחץ על Simulate.
   1. בדרך כלל, הערך את גובה ה- Z בצומת המיקוד בהגדלה המשמשת בצומת רכישה ריבועית.
      הערה: רצף המיקוד של צומת Focuser יכול לכלול גם הערכת מיקוד Z עדינה בצומת Hole Acquisition (כלי בתוכנת Leginon) במהלך איסוף הנתונים.
   2. התאם את ההגדרות עבור צומת המיקוד והפעל/השבת את אפשרות המיקוד Z העדינה במהלך התור הראשוני של ריבועים.
      הערה: חשוב לוודא שהגובה האיוצנטרי מזוהה במדויק כאשר איסוף נתונים אוטומטי מתחיל, דבר שעשוי לדרוש הפעלה מחדש של מיקוד Z עדין (שלב 2.10).
6. הטה את שלב הדגימה לזווית ההטיה הרצויה לאיסוף נתונים בגובה האאוצנטרי האמיתי, ומרכז מחדש את הבמה במידת הצורך. זוויות הטיה של 0°, 30° ו- 60° שימשו במחקר זה. לחץ על Simulate בצומת Square Acquisition כדי להתחיל להציב יעדים בתור עבור חשיפות צומת רכישת חורים.
   הערה: כפי שמצוין בשלב 2.2.1, ניתן להקליט את אטלס הרשת באמצעות הטיית במה מוגדרת מראש, אשר תייתר את הצורך להטות את הבמה שוב בשלב זה. פעולה זו פועלת היטב ומאיצה את התהליך אם זווית ההטיה המשמשת לאיסוף נתונים מוגדרת מראש. הפרוטוקול הנוכחי נכתב תוך התחשבות בדגימות חדשות, שבהן המשתמש עשוי לרצות לבדוק זוויות הטיה שונות לאיסוף נתונים.
7. בחרו יעד מיקוד Z ואזורים עם חורים המתאימים לחשיפות להגדלה גבוהה.
8. לחץ על שלח יעדים כדי לעמוד בתור להדמיה. אל תלחץ על שלח יעדים בתור עד שתסיים לתור את כל הריבועים.
9. החזירו את שלב הדגימה למצבו הבלתי מוטה. עברו לריבוע הבא וחזרו על שלבים 2.3-2.8 עד למספר מספיק של חשיפות לחורים.
10. עבור אל צומת פילוח החור ולחץ על שלח יעדים בתור לאחר שכל הריבועים עומדים בתור.
    הערה: אם מיקוד Z בסדר בוטל בעבר כדי לחסוך זמן (שלב 2.5), יש להפעיל אותו מחדש לפני שליחת התור.
11. בדוק ידנית מטרות שנבחרו על-ידי צומת רכישת החשיפה בהגדלה גבוהה כדי לבדוק אם מאתר החורים האוטומטי של EM יכול לזהות במדויק אזורים מתאימים לרכישת תמונה כאשר שלב הדגימה מוטה.
    1. במהלך הליך זה, בחר 'אפשר אימות משתמש של יעדים נבחרים' בהגדרות צומת רכישת חשיפה . לאחר שהמשתמש מרוצה מדיוק המיקוד, בטל את הבחירה באפשרות זו לאיסוף נתונים אוטומטי.
       הערה: יעדים בהגדלה גבוהה צומת רכישת חשיפה מצולמים בדרך כלל באמצעות אסטרטגיית היסט תמונה בהטיית אלומה, הפועלת באותה מידה הן עבור איסוף נתונים מוטים והן עבור איסוף נתונים ללא הטיה^23,24,25,26. להערכת CTF מדויקת בשלבי עיבוד נתונים במורד הזרם, יש לבצע את כיול סטיית תרדמת העדשה עבור אסטרטגיית איסוף הנתונים של הסטת התמונה בהטיית אלומה.

3. עיבוד נתונים

1. התחל עיבוד נתונים מהיר 10,27,28,29 עם תיקון תנועה של סרטים מוקלטים, הערכת CTF^, בחירת חלקיקים ויצירת שחזורים ראשוניים במהלך איסוף הנתונים.
   הערה: במחקר הנוכחי, cryoSPARC Live¹⁰ (ראה טבלת חומרים) שימש לעיבוד מקדים. עיבוד נתונים מהיר מספק שחזור קריו-EM ראשוני וקירוב להתפלגות הזוויתית, אשר יכול ליידע את המשתמש על מידת האנאיזוטרופיה של הרזולוציה. אלה יכולים, בתורם, לשמש כדי להנחות את המשתמש אם זווית ההטיה המשמשת לאיסוף נתונים גבוהה מספיק.
2. דמיינו את המפה המשוחזרת והתוו את התפלגות זווית אוילר כדי לאמוד את מידת כיווני החלקיקים המועדפים.
   הערה: ניתן להמיר את התפלגות זווית אוילר ישירות להתפלגויות דגימת מרחב פורייה כדי לקבוע את המידה הפוטנציאלית של אנאיזוטרופיה ברזולוציה. ממשק משתמש גרפי (GUI) פותח כדי לסייע למשתמש להעריך את האיכות של התפלגות זווית אוילר ולקבוע זווית הטיה אופטימלית^30,31. ניתן להשיג את הכלי ממאגר Github, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui.
3. במידת הצורך, התאם את זווית הטיית הבמה שבה נאספים הנתונים כדי להתגבר על ההשפעות של כיוון מועדף. ניתן להגדיל את הזווית אם הכיוון המועדף נשאר בעיה, כפי שמעידה המפה והתפלגות אוילר ב-3.2. לחלופין, ייתכן שהמשתמש ירצה לפצל את איסוף הנתונים לקבוצות ולהקליט באמצעות מספר זוויות הטיה שונות, כגון 20°, 30° ו- 40°.
   הערה: למרות שרוב ה-TEMs חייבים להיות בעלי יכולת להטות את הבמה ל-70°, הטיות שלב הדגימה הנפוצות (בהן השתמשנו) נעות בין 20°-40°.

תוצאות

DPS ב-0.3 מ"ג/מ"ל שימש להדגמת הדמיה בהטיות של 0°, 30° ו-60°. נתונים מזוויות הטיה שונות נאספו באותה רשת באזורי רשת שונים. רזולוציית CTF המתאימה להטיות בזווית גבוהה יותר נוטות להיות גרועות יותר, כפי שהיה במקרה של השוואת שלושת מערכי הנתונים במחקר זה. איור 4 מציג תמונות מייצגות השוואתיות...

Discussion

כיוון חלקיקים מועדף הנגרם על ידי היצמדות הדגימה לממשק אוויר-מים הוא אחד מצווארי הבקבוק העיקריים האחרונים לקביעת מבנה שגרתית ברזולוציה גבוהה באמצעות cryo-EM SPA ^4,5,6. סכימת איסוף הנתונים המוצגת כאן מספקת אסטרטגיה קלה ליישום לשיפור התפלגות האו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01