Collecte de données cryo-EM à particule unique avec inclinaison de scène à l’aide de Leginon

Résumé

Le présent protocole décrit un schéma généralisé et facile à mettre en œuvre pour la collecte de données à une seule particule inclinée dans les expériences cryo-EM. Une telle procédure est particulièrement utile pour obtenir une carte EM de haute qualité pour les échantillons souffrant d’un biais d’orientation préférentielle dû au respect de l’interface air-eau.

Résumé

L’analyse monoparticulaire (SPA) par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) est maintenant une technique courante pour la biologie structurale à haute résolution. La détermination de la structure par SPA repose sur l’obtention de plusieurs vues distinctes d’un objet macromoléculaire vitrifié dans une fine couche de glace. Idéalement, une collection d’orientations de projection aléatoires uniformément réparties équivaudrait à toutes les vues possibles de l’objet, donnant lieu à des reconstructions caractérisées par une résolution directionnelle isotrope. Cependant, en réalité, de nombreux échantillons souffrent de particules orientées préférentiellement adhérant à l’interface air-eau. Cela conduit à des distributions d’orientation angulaire non uniformes dans l’ensemble de données et à un échantillonnage inhomogène de l’espace de Fourier dans la reconstruction, se traduisant par des cartes caractérisées par une résolution anisotrope. L’inclinaison de l’étage de l’échantillon fournit une solution généralisable pour surmonter l’anisotropie de résolution en améliorant l’uniformité des distributions d’orientation, et donc l’isotropie de l’échantillonnage de l’espace de Fourier. Le présent protocole décrit une stratégie de collecte automatisée de données à étapes inclinées à l’aide de Leginon, un logiciel d’acquisition automatisée d’images. La procédure est simple à mettre en œuvre, ne nécessite aucun équipement ou logiciel supplémentaire et est compatible avec la plupart des microscopes électroniques à transmission (MET) standard utilisés pour l’imagerie des macromolécules biologiques.

Introduction

L’avènement des détecteurs d’électrons directs au cours de la dernière décennie ^1,2,3 a entraîné une augmentation exponentielle du nombre de structures à haute résolution de macromolécules et d’assemblages macromoléculaires résolus à l’aide de cryo-EM 4,5,6 à particule unique. Presque toutes les espèces macromoléculaires purifiées devraient pouvoir être déterminées par cryo-EM, à l’exception des plus petites protéines ~10 kDa de taille ou inférieure à⁷. La quantité de matière de départ nécessaire pour la préparation de la grille et la détermination de la structure est inférieure d’au moins un ordre de grandeur à celle d’autres techniques de détermination de structure, telles que la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire et la cristallographie aux rayons X ^4,5,6.

Cependant, l’un des principaux défis pour la détermination de la structure par cryo-EM implique une préparation de grille appropriée pour l’imagerie. Une étude approfondie évaluant divers échantillons à l’aide de différentes stratégies et grilles de vitrification a suggéré que la plupart des approches de vitrification d’échantillons sur des grilles cryo-EM conduisent à une adhésion préférentielle des macromolécules à l’interface air-eau⁸. Une telle observance peut potentiellement entraîner quatre résultats sous-optimaux : (1) l’échantillon macromoléculaire se dénature complètement, auquel cas aucune collecte et traitement de données réussis n’est possible ; (2) l’échantillon se dénature partiellement, auquel cas il peut être possible d’obtenir des informations structurelles à partir de régions de la macromolécule qui ne sont pas endommagées; (3) l’échantillon conserve sa structure native, mais un seul ensemble d’orientations de particules par rapport à la direction du faisceau d’électrons est représenté dans les images; (4) L’échantillon conserve sa structure native, et certaines orientations possibles des particules par rapport à la direction du faisceau d’électrons sont représentées dans les images. Pour les cas (3) et (4), la collecte de données inclinée aidera à minimiser l’anisotropie de résolution directionnelle affectant la carte cryo-EM reconstruite et fournira une solution généralisable pour une grande variété d’échantillons⁹. Techniquement, l’inclinaison peut également bénéficier au cas (2), puisque la dénaturation se produit vraisemblablement à l’interface air-eau et limite de la même manière le nombre d’orientations distinctes représentées dans les données. L’étendue du biais d’orientation dans l’ensemble de données peut potentiellement être modifiée en expérimentant avec des additifs de solution, mais un manque d’applicabilité générale entrave ces approches par essais et erreurs. L’inclinaison de l’étage de l’échantillon à un seul angle d’inclinaison optimisé est suffisant pour améliorer la distribution des orientations en modifiant la géométrie de l’expérience d’imagerie⁹ (Figure 1). En raison de la configuration géométrique de l’échantillon préférentiellement orienté par rapport au faisceau d’électrons, pour chaque groupe d’orientations préférentielles, l’inclinaison de la grille génère un cône d’angles d’éclairage par rapport au centroïde de l’amas. Par conséquent, cela répartit les vues et améliore par conséquent l’échantillonnage de l’espace de Fourier et l’isotropie de la résolution directionnelle.

Il y a, dans la pratique, certains inconvénients à incliner la scène. L’inclinaison de l’étage de l’échantillon introduit un dégradé de mise au point dans le champ de vision, ce qui peut affecter la précision des estimations de la fonction de transfert de contraste (CTF). La collecte de données inclinée peut également entraîner une augmentation du mouvement des particules induit par le faisceau causée par des effets de charge accrus lors de l’imagerie d’échantillons inclinés. L’inclinaison de la grille entraîne également une augmentation de l’épaisseur apparente de la glace, ce qui entraîne des micrographies plus bruyantes et peut finalement avoir un impact sur la résolution des reconstructions 5,9,10. Il peut être possible de surmonter ces problèmes en appliquant des schémas de traitement informatique avancés qui sont brièvement décrits dans les sections protocole et discussion. Enfin, l’inclinaison peut entraîner une augmentation du chevauchement des particules, ce qui entrave le pipeline de traitement d’image ultérieur. Bien que cela puisse être atténué dans une certaine mesure en optimisant la concentration de particules sur le réseau, il s’agit néanmoins d’une considération importante. Ici, un protocole simple à mettre en œuvre est décrit pour la collecte de données inclinées à l’aide de la suite logicielle Leginon (un logiciel d’acquisition d’images automatisé), disponible en libre accès et compatible avec une large gamme de microscopes^11,12,13,14. La méthode nécessite au moins la version 3.0 ou supérieure, avec les versions 3.3 et ultérieures contenant des améliorations dédiées pour permettre la collecte de données inclinée. Aucun logiciel ou équipement supplémentaire n’est nécessaire pour ce protocole. Des instructions détaillées sur l’infrastructure informatique et des guides d’installation sont fournis ailleurs¹⁵.

Protocole

1. Préparation de l’échantillon

1. Utilisez des grilles contenant une feuille d’or et un support de grille d’or¹⁶ (voir le tableau des matériaux), car la collecte de données inclinée peut accentuer le mouvement induit par le faisceau¹⁷.
   NOTE: Pour la présente étude, des échantillons sur grilles ont été vitrifiés à l’aide de la technique manuelle de plongeon et de buvardage¹⁸ dans une chambre froide humidifiée (plus de 80%) (~4 °C).
2. Éviter d’utiliser des grilles contenant un support en cuivre et une feuille de carbone ou une couche continue de carbone amorphe, sauf en cas d’absolue nécessité, car ces grilles peuvent entraîner un mouvement plus important induit par le faisceau¹⁶ lorsque l’étage de l’échantillon est incliné.
   NOTE: D’autres couches de support, telles que le graphène/oxyde de graphène, semblent réduire le mouvement induit par le faisceau par rapport au carbone amorphe^19,20.
3. Précribler les grilles et identifier les régions caractérisées par une épaisseur de glace et une distribution des particules acceptables. Les grilles contenant des particules trop serrées entraîneront un chevauchement des particules lors de la collecte de données inclinées, ce qui peut affecter les étapes de traitement des données en aval.
   REMARQUE: Ces étapes sont subjectives puisque l’identification des bonnes zones de glace est effectuée en inspectant visuellement les images défocalisées pour les régions où le contraste des particules est clair. Cela peut ne pas être possible pour tous les échantillons, car certains échantillons ne se répartissent pas efficacement dans les zones de glace mince, ce qui entraîne des difficultés lors de la collecte des données (décrites dans la section Discussion).
4. Vitrifiez les grilles contenant votre échantillon de protéines. Ici, à des fins de démonstration, nous utilisons la protéine de protection de l’ADN pendant la famine (DPS) (voir le tableau des matériaux) à une plage de 0,1 à 0,5 mg / mL avec une feuille d’or et des grilles de support en or.
   NOTE: La protéine a été purifiée comme décrit précédemment, sauf qu’aucun clivage de la protéase TEV n’a été effectué²¹. La plage de concentration en protéines pour un échantillon d’intérêt devra être optimisée individuellement, car il est difficile d’évaluer une plage idéale qui soit universellement applicable et qui variera presque certainement entre les différents échantillons.

2. Mise en place d’une collecte de données inclinée

1. Aligner le microscope pour assurer un éclairage parallèle de l’échantillon et minimiser les aberrations de coma²².
   REMARQUE: Le microscope doit être bien aligné pour la collecte de données SPA standard sans inclinaison de la scène. Aucun alignement spécial n’est nécessaire pour la collecte de données inclinées, mais un bon alignement garantira le bon déroulement du ciblage et de l’imagerie. Un schéma général comparant la collecte de données inclinées et non inclinées est présenté à la figure 2.
2. Enregistrez un atlas de grille sans inclinaison de la scène pour identifier les carrés adaptés à la collecte de données ou inspectez manuellement les carrés au grossissement utilisé dans le nœud d’acquisition de carrés. Recherchez des carrés où la feuille est intacte, n’a pas l’air déshydratée et a une épaisseur de glace idéale.
   REMARQUE: Square Acquisition Node est le nœud à faible grossissement utilisé pour l’imagerie multi-échelle dans Leginon.
   1. Pour la collecte automatisée de données non inclinée typique, enregistrez un atlas de grille, qui fournit un aperçu de la qualité globale de la grille et une indication initiale des zones appropriées pour la collecte de données.
   2. Ensuite, sélectionnez les carrés appropriés dans l’atlas et soumettez-les à la file d’attente. Ensuite, soit par la sélection manuelle des trous, soit par le biais du détecteur automatisé de trous EM, mettez en file d’attente et soumettez les cibles de trous.
   3. Enfin, utilisez le détecteur de trous EM automatisé pour soumettre des cibles d’exposition à fort grossissement.
      REMARQUE: Pour la collecte de données inclinées, les carrés peuvent avoir besoin d’être mis en file d’attente manuellement pour des résultats cohérents, en particulier si l’angle d’inclinaison optimal n’a pas été prédéterminé et est susceptible d’être ajusté pendant la collecte de données. L’atlas de grille pourrait également être enregistré à l’aide d’une inclinaison de scène prédéfinie si l’angle d’inclinaison utilisé pour la collecte de données avait été préalablement établi.
3. Déplacez le stade du spécimen vers un carré d’intérêt.
4. Déterminez la hauteur eucentrique de la position de la scène à l’aide d’α-wobbler à ±inclinaison de la scène de 15°. Ajustez la hauteur Z pour amener la scène à la hauteur eucentrique à l’aide du clavier du microscope. Assurez-vous que le décalage d’image est minimal pendant la routine de α-oscillation.
   REMARQUE: Si la hauteur eucentrique n’est pas correctement identifiée, un grand décalage de l’image sera observé lors de l’inclinaison de la scène au grossissement carré. Cela peut également se produire s’il y a des déformations locales sur la grille, par exemple, si la grille est cassée ou fortement pliée à proximité de la zone imagée. Bien qu’il soit préférable d’éviter de telles régions pour la collecte de données, il est impératif d’estimer avec précision la hauteur eucentrique si elles représentent l’une des rares régions prometteuses pour la collecte de données. La figure 3 montre comment le ciblage sans identifier correctement la hauteur eucentrique peut provoquer de grands décalages d’image dans le grossissement carré.
5. Trouvez une hauteur Z plus précise, utilisez le nœud Focuser et appuyez sur Simuler.
   1. En règle générale, estimez la hauteur Z dans le nœud Focuser au grossissement utilisé dans le nœud d’acquisition carré.
      REMARQUE : La séquence de mise au point du nœud Focuser peut également inclure une estimation fine de la mise au point Z au niveau du nœud Acquisition de trous (un outil du logiciel Leginon ) lors de la collecte de données.
   2. Ajustez les paramètres du nœud Focuser et activez/désactivez l’option de mise au point Z fine lors de la mise en file d’attente initiale des carrés.
      REMARQUE : Il est important de s’assurer que la hauteur eucentrique est identifiée avec précision lorsque la collecte automatisée de données commence, ce qui peut nécessiter de réactiver la mise au point Z fine (étape 2.10).
6. Inclinez l’étage de l’échantillon à l’angle d’inclinaison souhaité pour la collecte de données à la hauteur eucentrique réelle et recentrez l’étage si nécessaire. Des angles d’inclinaison de 0°, 30° et 60° ont été utilisés pour cette étude. Appuyez sur Simuler dans le nœud Acquisition Square pour commencer à mettre en file d’attente les cibles pour les expositions de nœuds d’acquisition de trous .
   NOTE: Comme indiqué à l’étape 2.2.1, l’atlas de la grille peut être enregistré à l’aide d’une inclinaison de scène prédéfinie, ce qui éviterait d’avoir à incliner à nouveau la scène à cette étape. Cela fonctionne bien et accélère le processus si l’angle d’inclinaison utilisé pour la collecte de données est prédéfini. Le protocole actuel est écrit avec de nouveaux spécimens à l’esprit, dans lesquels l’utilisateur peut souhaiter tester différents angles d’inclinaison pour la collecte de données.
7. Sélectionnez une cible de mise au point Z et des régions avec des trous adaptés aux expositions à fort grossissement.
8. Appuyez sur Soumettre les cibles à mettre en file d’attente pour la création d’images. N’appuyez pas sur Soumettre les cibles en file d’attente tant que vous n’avez pas terminé de mettre en file d’attente tous les carrés.
9. Ramenez le stade de l’échantillon à son état non incliné. Passez à la case suivante et répétez les étapes 2.3-2.8 jusqu’à ce qu’un nombre suffisant d’expositions de trous ait été mis en file d’attente.
10. Accédez au nœud de ciblage de trous et appuyez sur Soumettre les cibles en file d’attente une fois que tous les carrés sont mis en file d’attente .
    REMARQUE : Si le focus Z fin a été désactivé précédemment pour gagner du temps (étape 2.5), il doit être réactivé avant de soumettre la file d’attente.
11. Inspectez manuellement les cibles sélectionnées par le nœud d’acquisition d’exposition à fort grossissement pour vérifier si le détecteur automatisé de trous EM peut identifier avec précision les régions appropriées pour l’acquisition d’images lorsque l’étage de l’échantillon est incliné.
    1. Au cours de cette procédure, sélectionnez « Autoriser la vérification par l’utilisateur des cibles sélectionnées » dans les paramètres du nœud d’acquisition d’exposition . Une fois que l’utilisateur est satisfait de la précision du ciblage, désélectionnez cette option pour la collecte automatisée des données.
       REMARQUE: Les cibles dans un nœud d’acquisition d’exposition à fort grossissement sont généralement imagées à l’aide d’une stratégie de décalage d’image inclinée et inclinée, qui fonctionne aussi bien pour la collecte de données inclinée que non inclinée^23,24,25,26. Pour une estimation précise du CTF dans les étapes de traitement des données en aval, l’étalonnage de l’aberration lentille-coma doit être effectué pour la stratégie de collecte des données de décalage d’image faisceau-inclinaison.

3. Traitement des données

1. Initiez le traitement des données à la volée 10,27,28,29 avec correction de mouvement des films enregistrés, estimation CTF^, sélection des particules et génération de reconstructions initiales pendant la collecte des données.
   NOTE: Pour la présente étude, cryoSPARC Live¹⁰ (voir le tableau des matériaux) a été utilisé pour le prétraitement. Le traitement des données à la volée fournit une reconstruction cryo-EM initiale et une approximation de la distribution angulaire, ce qui peut informer l’utilisateur sur l’étendue de l’anisotropie de résolution. Ceux-ci peuvent, à leur tour, être utilisés pour guider l’utilisateur quant à savoir si l’angle d’inclinaison utilisé pour la collecte de données est suffisamment élevé ou non.
2. Visualisez la carte reconstruite et tracez la distribution des angles d’Euler pour évaluer l’étendue des orientations préférées des particules.
   NOTE: Les distributions d’angle d’Euler peuvent être converties directement en distributions d’échantillonnage de l’espace de Fourier pour déterminer l’étendue potentielle de l’anisotropie de résolution. Une interface utilisateur graphique (GUI) a été développée pour aider l’utilisateur à évaluer la qualité d’une distribution d’angle d’Euler et à déterminer un angle d’inclinaison optimal^30,31. L’outil peut être obtenu à partir du référentiel Github, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui.
3. Si nécessaire, ajustez l’angle d’inclinaison de la scène auquel les données sont collectées pour surmonter les effets de l’orientation préférentielle. L’angle peut être augmenté si l’orientation préférentielle reste un problème, comme en témoignent la carte et la distribution d’Euler en 3.2. L’utilisateur peut également souhaiter diviser la collecte de données en groupes et enregistrer en utilisant plusieurs angles d’inclinaison différents, tels que 20°, 30° et 40°.
   NOTE: Bien que la plupart des TEM doivent avoir la capacité d’incliner la scène à 70°, les inclinaisons de scène courantes (que nous avons utilisées) vont de 20° à 40°.

Résultats

Le DPS à 0,3 mg/mL a été utilisé pour démontrer l’imagerie à des inclinaisons de 0°, 30° et 60°. Des données provenant de différents angles d’inclinaison ont été recueillies sur la même grille dans différentes régions du réseau. La résolution CTF adaptée aux inclinaisons d’angle plus élevées a tendance à être plus faible, comme ce fut le cas lors de la comparaison des trois ensembles de données de cette étude. La figure 4 montre des images représentatives comp...

Discussion

L’orientation préférée des particules causée par l’adhérence de l’échantillon à l’interface air-eau est l’un des derniers goulots d’étranglement majeurs à la détermination de routine de la structure à haute résolution à l’aide de cryo-EM SPA ^4,5,6. Le schéma de collecte de données présenté ici fournit une stratégie facile à mettre en œuvre pour améliorer la distribution d’orientation des part...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01