机器人钻孔开颅术对小鼠颅窗手术热损伤的评估

摘要

颅窗已成为一种普遍实施的手术技术，允许在转基因小鼠中进行活体成像。该协议描述了手术机器人的使用，该机器人对颅窗进行半自动骨钻孔，可以帮助减少外科医生之间的变异性并部分减轻热血脑屏障损伤。

摘要

颅窗手术允许使用多光子或其他活体成像技术对活小鼠的脑组织进行成像。然而，当用手进行任何开颅手术时，脑组织通常会受到热损伤，这本质上是手术与手术之间的变化，并且可能取决于个体外科医生的技术。实施手术机器人可以使手术标准化，并减少与手术相关的热损伤。在这项研究中，测试了三种机器人钻孔方法来评估热损伤:水平、逐点和脉冲逐点。水平钻孔使用连续钻孔原理图，而逐点钻孔围绕颅窗的几个孔。脉冲逐点增加了"2 s 开，2 s 关"钻孔方案，以允许在钻孔之间冷却。静脉注射的埃文斯蓝（EB）染料的荧光成像测量脑组织的损伤，而放置在钻孔部位下方的热电偶测量热损伤。热电偶结果表明，与水平（16.66 °C ± 2.08 °C）和逐点（18.69 °C ± 1.75 °C）组相比，脉冲逐点（6.90 °C ± 1.35 °C）组的温度变化显着降低。同样，与水平方法相比，脉冲逐点组在颅窗钻孔后也显示出显着减少的EB存在，表明对大脑血管的损害较小。因此，脉冲逐点钻孔方法似乎是减少热损伤的最佳方案。机器人钻头是一种有用的工具，可帮助最大程度地减少训练、可变性并减少热损伤。随着多光子成像在研究实验室中的使用越来越多，提高结果的严谨性和可重复性非常重要。这里讨论的方法将有助于告知其他人如何更好地使用这些手术机器人来进一步推进该领域。

引言

颅窗已在整个神经科学、神经工程和生物学领域得到普遍应用，以便对^活体动物的皮层进行直接可视化和成像1，²，³，⁴，⁵，⁶，⁷，⁸，^9，10，11.转基因小鼠和多光子成像的强大结合为体内大脑中的电路活动和其他生物学见解提供了极其有价值的见解¹²，¹³，^14，15，¹⁶，^17，18。安装在头骨上的微型显微镜进一步扩展了这些功能，使清醒的，自由移动的动物能够进行记录¹⁹。创建颅窗的过程需要电钻以薄或完全去除颅骨以产生足够大的颅骨切开术，以将一块透明玻璃固定在皮层²⁰上。聚二甲基硅氧烷（PDMS）和其他聚合物也已作为颅窗材料^9，21进行了测试。最终，理想的颅窗是不改变或干扰下方正常内源性活动的颅窗。然而，人们普遍认为，颅窗钻孔会加重下层组织，导致大脑损伤、环境破坏，并影响脑膜直至阻塞多光子成像深度²²。由此产生的神经炎症具有广泛的影响，从血脑屏障（BBB）的通透性到植入部位周围神经胶质细胞的激活和募集²³。因此，表征更安全、更可重复的颅窗钻孔方法对于一致的成像质量和减少混杂因素至关重要。

虽然注意尽量减少对下层组织的创伤，但钻孔骨骼的行为有可能对大脑造成热和机械扰动^24，25。意外钻头插入硬脑膜造成的机械创伤可能进一步诱发不同程度的皮质损伤²⁴。在Shoffstall等人25的一项研究中，骨钻孔产生的热量导致BBB渗透性增加，如脑实质²⁵中存在埃文斯蓝（EB）染料所示。静脉注射的EB染料与血液中循环的白蛋白结合，因此通常不会以可观的浓度穿过健康的BBB。因此，EB染料通常用作BBB渗透性^26，27的敏感标志物。虽然他们的研究没有直接测量BBB通透性对后续生物后遗症的影响，但先前的研究已将BBB通透性与对长期植入微电极的神经炎症反应增加和运动功能的改变相关联²⁸。

根据研究目标，热损伤和机械损伤的程度可能会导致实验误差，从而对研究的严谨性和可重复性产生负面影响。有几十种引用的制作颅窗的方法，每种方法使用不同的钻孔设备，速度，技术和用户¹，²，³，⁴，⁵，⁶，⁷，⁸，⁹，^10，11。Shoffstall等人25报告说，观察到的加热结果变化归因于钻头施加的力，进给速率和应用角度的变化，以及手工钻孔时无法控制的其他方面²⁵。人们认为，自动钻井系统和其他立体定位设备可以提高可重复性和结果一致性，但已发表的方法研究并未严格评估温度或BBB渗透性作为结果之一。因此，需要更可重复和一致应用的方法来产生颅窗，以及严格应用的方法来评估颅窗钻孔对下层神经组织的影响。

本研究的重点是确定和开发一致和安全的颅窗钻孔方法。用于颅窗安装的开颅术的尺寸明显大于用于脑植入微电极的标准开颅术。当使用标准设备时，这种开颅手术不能用单个毛刺孔完成，因此在手动进行时引入了更多的外科医生间技术差异²⁰。外科钻孔机器人已引入现场，但尚未得到^{广泛采用1}、^6、29。钻井自动化提供了对变量的控制，这些变量有助于观察到试验间的变化，这表明使用该设备可以减少外科医生之间和外科医生内的影响。考虑到颅窗放置所需的较大开颅术的额外难度，这一点特别令人感兴趣。虽然人们可以假设自动化钻井所提供的控制有明显的好处，但对这些设备的实施几乎没有评估。虽然尚未观察到可见病变⁵，但需要使用EB进行更高的敏感性测试。

在这里，BBB渗透率是使用带有相应软件的市售外科钻孔机器人测量的，该软件允许对立体定位坐标，开颅规划/映射以及选择钻孔类型（"逐点"与"水平"）进行编程，参考钻头的布线路径。最初，钻八个"种子"点（图1A），勾勒出颅窗。从这里开始，使用"逐点"或"水平"钻孔方法切割种子之间的空间。"逐点"执行垂直导向孔切割（类似于CNC钻床），而"水平"沿轮廓孔的颅窗圆周执行水平切割（类似于CNC路由器）。这两种方法的结果都是一块头骨，可以移除以露出颅窗。为了隔离钻孔造成的损坏，不会物理移除颅窗，以避免任何额外的损坏。EB染料与荧光成像相结合的组合用于测量小鼠进行开颅后的BBB渗透性，插入的热电偶用于在钻孔过程中直接测量脑表面的温度（图1B，C）。先前的观察表明，间隔2秒的脉冲钻孔开/关足以减轻钻孔加热²⁵，因此被纳入手术机器人的实验方法。

所介绍的工作的目的是演示评估开颅钻孔热损伤的方法。虽然这些方法是在自动钻井的背景下提出的，但这些方法也可以应用于手动钻井方案。这些方法可用于在采用作为标准程序之前验证设备和/或钻井方案的使用。

图 1:实验管道原理图。示意图显示了动物在颅窗手术后接受EB定量的过程。（A）带有立体定位框架和手术机器人钻头的鼠标的示意图设置。一个示例颅窗显示在运动皮层上，带有种子点（绿色）和边缘点（蓝色）。（B）灌注装置包括在整个动物体内注射1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）以去除任何血液，然后提取大脑。（C）然后将大脑放入EB荧光成像系统室，对埃文斯蓝染料进行荧光成像。请点击此处查看此图的大图。

研究方案

所有程序和动物护理实践均由路易斯斯托克斯克利夫兰退伍军人事务部医疗中心机构动物护理和使用委员会审查、批准和执行。

1. 手术机器人硬件设置

1. 手术前，请按照手术机器人（见 材料表）手册和指南设置硬件和软件。按照手册中的详细说明执行帧校准。如果钻头或框架移动，建议重新校准钻头以确保精度。

2. 软件准备

1. 导航到手术软件（请参阅 材料表）并通过选择从 干净的项目开始创建新项目。将主题设置为顶部的 鼠标 以指定要使用的钻孔坐标。
2. 选择" 启动新项目"。
3. 从这里，单击左下角的 "规划" 以导航到钻井坐标规划屏幕。为要执行的颅窗技术创建钻孔方案。
   1. 为此，请单击立体定位图谱上的任意位置。使用布雷格玛作为参考，并为运动皮层输入以下坐标:AP = 1.50，ML = 1.25，DV = 0.00。按键盘上的 Enter 键以更新所选坐标。
      注意:背腹（DV）坐标表示钻孔深度，因此此处不需要输入。
   2. 单击 存储目标 以保存这些坐标并输入适当的名称。从这里，单击左下角的" 移动" 按钮导航回主钻孔屏幕。
4. 单击" 项目工具>>另存为 "以在以后的项目中重用此模板项目。这将自动保留钻孔坐标供以后使用。

3. 手术准备

1. 在异氟醚室（1.5L / min O₂中为3.5%）麻醉PrismPlus小鼠^30，31（参见材料表）。涂抹眼睛润滑剂以防止眼睛干燥，使用剪刀剃光头部，并修剪指甲以防止小鼠刮伤缝合线。
   注意:PrismPlus小鼠是一种用于多光子成像的转基因荧光物种。杂合PrismPlus小鼠缺乏荧光基因，因此在这里用于减少其他正在进行的研究中的动物粪便，并且由于本研究中没有多光子成像。预计野生型小鼠将显示出类似的结果。
2. 向麻醉小鼠皮下注射抗生素头孢唑啉（24mg / kg），镇痛药卡洛芬（5mg / kg）和丁丙诺啡（0.05-0.10mg / kg）。在任何切口之前，在切口部位下方（从眼睛后面开始沿颅骨中线1英寸）皮下注射单次马卡因（0.25%，100μL）。
   注意:此处使用的药物遵循先前建立的IACUC协议。但是，建议考虑将EMLA乳膏作为局部麻醉剂，以便在手术和尾静脉注射以及美洛昔康SR代替卡洛芬之前产生多模式效果。EMLA 和美洛昔康 SR 可在异氟烷麻醉前提供。
3. 使用提供的耳杆将动物安装在手术机器人立体定位框架上，并通过鼻锥吸入 0.5 %-2%异氟醚维持麻醉。
4. 确保由训练有素的兽医技术人员或工作人员根据鼠标的反应性、呼吸（~55-65 次呼吸/分钟）、心率（300-450 次/分钟）和颜色（粉红色）密切监测麻醉深度。胡须和定期捏脚趾也可以用作确定麻醉深度的措施。生命体征的值由IACUC机构法规确定。
5. 在循环水垫上保持动物体温，并使用血氧和心率测量系统监测生命体征。
6. 用葡萄糖酸氯己定（CHG）和70%异丙醇擦洗手术区域进行灭菌。为了在手术过程中保持无菌，请在小鼠和立体定位框架上放置无菌保鲜膜。
   注意:虽然这些协议是为生存手术开发的，但所提供的数据反映了非生存动物的使用，因为重点是测试和确定适当的钻孔协议方法。

4. 颅骨准备

1. 使用手术刀刀片，从眼睛后部开始，在颅骨中线进行 1 英寸的切口。
2. 将皮肤向后拉以露出颅骨，并（可选）使用牵开器来维持手术窗口。使用无菌棉头涂抹器去除任何残留的组织和膜。
3. 用3%的过氧化氢和棉头涂抹器擦干并清洁头骨。
   注意:这将使颅骨的缝合线可见。Bregma和Lambda应该很容易看到。如果没有，请涂抹更多的过氧化氢或增加切口的大小。
4. 根据制造商的建议，通过将鳄鱼夹电缆从手术机器人钻孔装置连接到鼠标，允许"自动停止"功能。"自动停止"通过检测阻抗变化来工作，因此一旦钻头接触脑脊液（CSF）而不是骨骼，钻头将停止钻孔，从而防止对大脑造成损害。

5.埃文斯蓝尾静脉注射

注意:EB是一种可能的致癌物质。处理时戴手套。

1. 要准备便于注射的尾巴，请用酒精湿巾擦拭。可选地，可以局部应用冬青油来扩张静脉³⁵。
2. 一只手抓住尾巴，另一只手处理装有EB的注射器。使用拇指和食指弯曲尾巴，使尾部静脉暴露在尾巴弯曲的顶部。将注射器（1或2mL，30G胰岛素注射器）与静脉平行插入，并缓慢注射EB体积。EB（4% w / v）通过尾静脉注射 以 2mL / kg体重的浓度施用。
   注意:如果正确插入针头，可以感觉到从注射器流入尾部的阻力很小甚至没有。如果有阻力或尾巴上出现EB染料，请在尾部向下移动并重试。
3. 注射后，等待5分钟，让EB在整个小鼠中循环，然后再开始钻孔。当小鼠的四肢和手术窗口变为蓝色时，立即验证成功的注射。

6. 手术机器人钻孔程序

1. 一旦颅骨准备好钻孔，请导航回手术软件。打开步骤 2.4 中定义的模板项目，其中指定了钻孔坐标。
   1. 按照"新建项目" >>"工具">"选择模板项目 "，然后选择在步骤 2（软件准备）中指定的模板项目。
   2. 选择"相同协议"元素>"规划（目标点）">"钻探参数"以延续到此新项目。
   3. 单击 "启动新项目"。
2. 接下来，校正钻头和框架，以考虑当前动物的小鼠头骨的倾斜和缩放。单击 "工具 "，然后选择 "倾斜和缩放..."以 打开校正屏幕。在屏幕顶部，通过单击浅红色的钻头按钮，确保 钻 头处于活动状态（而不是注射器）。
   注意:激活后， "钻头 "按钮将变为深红色/亮红色。注射器按钮可以忽略，因为本协议中未使用该按钮。
   1. 首先，通过设置布雷格玛和 Lambda 在当前动物上的位置来校正比例、俯仰和偏航。利用键盘控件或屏幕上的控件移动钻头。钻头位于布雷格玛上方后，将其降低，直到它刚好接触到头骨，然后单击 设置布雷格玛。对 Lambda 重复此操作。
   2. 接下来，针对颅骨的特定滚动进行调整。单击转到 中点 按钮，将钻头自动调整到头骨的中心。向 左单击 2 毫米 ，然后慢慢降低钻头，直到接触头骨。单击设置 左点。
   3. 对大脑右侧重复步骤6.2.2。现在，系统已针对此特定头骨进行了设置。
      注意:此处的校正对于确保正确的钻孔坐标和深度至关重要。鼠标需要尽可能靠近直线安装，以尽可能减少校正的需要。如果需要大修正，可能会导致钻孔精度降低。
3. 执行更正后，通过单击 关闭 在屏幕的底部中间。通过单击 导航到钻孔屏幕 工具 ，然后选择 钻。。。 开始钻孔过程。
   1. 确保从屏幕顶部的"钻头"下拉列表中选择"开颅形状"。然后，单击"选择钻孔中心和形状"，并选择在步骤 2.3.1 中命名的预定义靶区。在此屏幕下，选择圆形作为目标的形状，并输入 2.60 毫米作为圆的直径²。单击显示。
      注意: 颅窗的直径是使用钻头的中心作为种子点的中心创建的。使用小钻头（直径 = 0.6 mm 或供应商提供的推荐钻头尺寸）来最大程度地减少因使用较大钻头而增加的额外直径。专用钻头专门用于手术机器人。八个种子点和边缘点现在将分别在头骨上显示为绿色和蓝色点。
   2. 单击主窗口并使用键盘快捷键 Control + Shift + D 调出屏幕右侧的 钻孔点 菜单。这允许查看特定的钻点深度和状态。
   3. 在钻孔开始之前，如果需要，请通过单击"自动停止"复选框旁边的按钮来自定义 自动停止 功能。此按钮默认为 "中"，对应于自动停止功能的灵敏度。
      注意:可以事先进行测试，以找到适合动物的灵敏度。在该协议中，使用最高灵敏度来确保通过大脑的最小钻孔。
   4. 启用并自定义自动停止功能后，开始钻取种子点。单击 "自动扫描 "，以便从种子 1 自动开始钻探。一旦钻头接触脑脊液，自动停止功能将检测到阻抗的变化，导致钻孔停止并将钻头从颅骨中缩回。
   5. 密切关注钻孔，以防自动停止无法检测到任何变化。可以按 Esc 键手动取消钻孔。也可以单击位于"钻孔"菜单底部和阻抗值右侧的粉红色圆圈以开始或停止钻孔。
      注意: 钻头将自动钻孔到等于估计颅骨厚度的深度（或直到激活自动停止功能）。
   6. 如果在达到估计深度之前未激活自动停止，将弹出一个屏幕，提示用户:1）继续 钻孔并进一步下降#mm，2） 标记当前深度并继续，3） 跳过当前点并继续，或4） 停止该过程（以后可能会继续）。选择其中一个选项，如下所述。
      1. 对于 继续钻孔并进一步下降 # mm，输入钻头前进的距离。默认情况下，使用 0.1 毫米。可以建议较小的距离以防止意外穿透大脑。
      2. 如果认为在此屏幕上已达到硬脑膜，请选择"在当前深度标记并继续"选项，以便系统在该 深度标记 硬脑膜并继续下一个种子。
      3. 使用 跳过当前点并 继续和停止 该过程（稍后可能会继续） 对钻头进行故障排除或清理钻头，并在自动停止再次运行后返回。
   7. 钻完所有种子点后，如果使用自动停止功能未完成任何种子点，请使用硬脑膜拾取手动检查孔的深度。这将确保钻孔深度确实穿透了头骨。
   8. 在开始边点钻孔之前，通过选择"钻孔"菜单上"边切"文本旁边的下拉菜单来确定所需的" 边切 "类型。这两个选项是 逐点 和 水平。
      1. 选择 "逐点 "以单独钻取每个边缘点，并钻取到由相邻种子点深度确定的深度。如果需要，可以通过下面的 "边缘缩放..." 按钮调整缩放比例，尽管默认值"无缩放"通常就足够了。
      2. 选择 "水平" 以从边缘点 1 开始钻孔，并使用连续钻孔运动绕钻孔圆的整个圆周。默认情况下，水平切割将以 100 μm 的间隔切割，一直围绕窗口的圆周进行切割，然后再深入 100 μm。如果需要，请在下面的 "切割选项... "按钮下更改间隔深度和钻孔速度。
      3. 使用自动剪切偏移（在"边切割"框下方）通过从相邻种子点获取预定偏移来调整自动剪切深度。在该协议中，使用了20μm的自动切割偏移。可以进行进一步的测试以确定每只动物的最佳偏移量。
   9. 确定边切设置后，通过单击"钻孔"（Drill） 菜单中间的" 自动切割 "按钮开始刃点钻孔。对于逐点钻孔，钻完最后一个边缘后，钻孔过程就完成了。对于水平钻孔，继续，直到钻出足够的颅骨以释放颅窗。
      注意:虽然在可以释放窗口之前进行钻孔，但此处不会物理释放窗口以防止对下层组织造成任何损坏。隔离仅钻孔造成的损坏以评估不同的钻孔原理图非常重要。
      1. 水平钻孔达到一个种子点的深度后，在"钻取点"菜单中右键单击该种子（或先选择多个点），然后单击" 锁定深度"。这将允许水平切割继续，而不会对该区域进行更深的切割（从而避免穿透大脑）。
         注意:如果种子点的硬脑膜深度不同，这可能会导致水平钻孔过程所需的深度不同。
   10. 如果自动停止功能无法正常工作，请确保钻头完全清除任何碎屑或潜在的血液、盐水等，因为这些可能会影响钻头的基极阻抗。此外，从下面描述的几个手动钻孔选项中选择一种，以防自动停止无法始终如一地工作。
       1. 在"钻孔"菜单中，通过右键单击种子或边并选择" 转到进入"，手动导航到每个种子。还有清除标记的深度、重置孔和其他可以帮助钻孔过程的选项。
       2. 通过从"钻取"菜单顶部附近的 "高级:"文本旁边的下拉列表中选择一个深度，手动控制钻取深度前进。单击正下方的 "前进" 按钮，将钻孔推进到设定的距离。
          注意: 此功能可与"前进"按钮下方的"设置硬脑膜"和"设置表面"按钮结合使用，以手动告知系统颅骨表面和硬脑膜的位置。尽可能使用自动停止功能，但如果需要，这些手动选项也足够了。
       3. 如果手动钻孔，请在每个钻孔深度间隔之间更加小心，以确保钻头不超过硬膜。在深度间隔之间使用硬脑膜镐检查钻孔，以确认是否达到了硬脑膜。完成所有手动种子钻孔后，按上述正常方式继续切边程序。
   11. 脉冲法
       1. 要执行手动脉冲钻孔，请通过取消选中钻孔菜单中自动停止选项旁边的复选框来关闭自动 停止 功能。这必须关闭，以便控制钻头何时关闭脉冲。
          注意:脉冲钻孔遵循 2 秒钻孔的模式，然后 2 秒不钻孔，以使头骨冷却。
       2. 在"钻头"菜单中，选择 100 μm 作为钻孔深度推进，这相当于向下钻孔的 ~2 秒。
       3. 准备就绪后，单击 "前进 "开始钻取。
          注意:一旦钻头前进 100 μm，请准备好快速停止钻头，因为钻头继续在深度旋转，直到 按下逃生 物（产生不必要的热量）。
       4. 钻头前进 100 μm 后，按 Esc 两次以停止钻头。2秒后，对头骨的深度重复这个循环。
          注意:由于软件和机械限制，只能使用脉冲方法执行逐点方法。连续水平钻孔不能以这种方式进行。
       5. 使用上面详述的此方法钻取所有种子和边缘点。确保在达到硬脑膜后使用"钻"菜单中的按钮设置 杜拉 。

7. 灌注和脑提取

1. 种子和边缘点的钻孔完成后，将动物置于异氟醚麻醉下再放置1小时，以使EB染料通过受损的BBB循环和外渗。进行心脏灌注以从血管中取出任何血液或液体，然后取出大脑进行成像和分析，如下所述。
   1. 在颅窗创建后的1小时EB循环期后，腹膜内注射氯胺酮（160mg / kg）和甲苯噻嗪（20mg / kg）的混合物。一旦无反应，进行心脏灌注。
   2. 用剪刀切开小鼠的腹部，通过垂直切过肋骨和水平穿过横膈膜来露出心脏。缩回肋骨以清晰地观察心脏。将蝶针插入心脏的左心室，并开始在全身输注 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。剪断心脏右心房的一小部分以释放压力积聚。
   3. 在 25 mL 的 1x PBS 灌注全身后，停止灌注并将小鼠斩首作为安乐死的次要手段。
      注意:一定要对动物执行机构批准的安乐死和/或终点灌注方法以分离大脑。
   4. 从这里开始，通过用 rongeurs 去除骨骼和组织来从头骨中提取大脑。
   5. 用荧光成像系统对提取的大脑进行成像，以观察位于钻井地点周围大脑中的EB量。
      注意:EB与循环白蛋白结合。如果大脑发生血管损伤，EB会泄漏出来并与脑组织结合，从而产生清晰的损伤视觉指标。

8. 埃文斯蓝成像和分析

1. 硬件初始化
   1. 打开连接到EB荧光成像系统的计算机，并在准备其他项目时启动成像软件（参见 材料表）。按此顺序打开光源、平台和相机。
   2. 导航到成像软件，然后单击采集控制面板下的初始化。初始化完成后，系统和腔室将立即发出从红色到绿色的信号。
      注意:在任何成像前30分钟初始化EB荧光成像系统，以使光源的温度达到最佳水平。
2. 大脑成像
   1. 将植入的大脑放在舞台中央的透明盘中进行成像。
   2. 在 采集控制面板下，调整图像的设置。选择曝光时间:1秒;分箱:中等;挡板: F1;激发波长:535 至 675 nm;排放:Cy 5.5;灯电平:高;视场:5厘米。保持滤光片锁定，并检查摄影和荧光的叠加。这些设置基于以前的实验室经验和其他已发布的EB³⁶成像方法。
3. 将EB荧光成像系统图像加载到开放访问图像处理软件（参见 材料表）中，并生成三个手绘感兴趣区域（ROI），通过测量背景，整个大脑和颅窗上的平均辐射来找到EB的荧光强度。
   1. 根据相应的背景ROI规范化颅窗和全脑测量。
   2. 在不同的激发滤光片（535-675nm）下对每个大脑进行成像，以找到实验组与盐水对照之间信噪比最高的波长（选择605nm）。
      1. 分离适当波长和平均值下的平均辐射度，以获得整个大脑和颅窗ROI的平均平均辐射度或荧光强度。
4. 根据盐水对照，查找并归一化每组颅窗区域的平均平均辐射度。

9. 热电偶评估

1. 使用热电偶（见 材料表）结合三种不同的钻孔方案测量颅骨和大脑的温度变化。热电偶连接到数据采集系统（DAQ），该系统允许将测量值读取到MATLAB中。
2. 将尸体鼠标安装到立体定位框架和机器人钻头设置上。手动钻一个小孔（与种子点大小相同）~2毫米，距离颅窗将进入颅骨²⁵的一侧。该孔将允许热电偶滑入颅窗钻孔的位置（图2D）。
   注意:使用尸体小鼠是因为需要钻开头骨的侧面才能将热电偶滑过颅窗钻孔区域。这只尸体小鼠与以前用于埃文斯蓝分析的动物不同。
3. 按照前面（步骤 6）的方式开始三个方案中每个方案的钻取过程。当钻头穿过颅骨时，温度变化会出现峰值，表明大脑附近发生加热。
4. 在 MATLAB 中记录并绘制结果以计算最大温差。对于种子钻孔和边缘钻孔，应分别进行此操作，以评估水平钻孔与逐点钻孔以及脉冲手动钻孔方法。

10. 统计

1. 使用Kruskal-Wallis秩和检验和Benjamini-Hochberg校正对R中的热电偶和EB荧光成像进行统计分析，然后使用Wilcoxon秩和精确检验²⁵进行成对比较。

结果

热评估
通过使用水平（图2A）、逐点（图2B）和脉冲逐点（图2C）方法测量钻孔引起的温度与基线的变化来评估热损伤的可能性。图2D显示了获取热数据的实验设置。使用N = 4颅窗的样本量进行热评估。水平和逐点使用相同的种子钻孔示意图，但边缘点的切割方式有所不同。脉冲逐点对种子和边...

讨论

EB染料和成像的使用简单，快速且可用于评估大脑中的血管损伤，以获取新的方法和技术。无论是使用手术机器人还是确认目前在实验室中完成的方法，验证手术方法以隔离实验性治疗与手术影响的效果并改善动物福利非常重要。热电偶设置在评估钻孔方法以确保不会发生加热时也很有用。已知由于骨钻孔引起的温度升高会导致组织损伤，即使升高5°C也足以导致大脑中的大血管损伤32，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent	VWR	MRGF-6235	For Evans Blue dilution
Aura Software Type: Tool	Spectral Instruments Imaging		Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems
Buprenorphine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool	Stoelting	58640-1
Carprofen Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Cefazolin Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Evans Blue Dye Type: Reagent	Millipore Sigma	E2129	Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline
Isoflurane Type: Drug	Sourced from Animal Facility
IVIS Lumina II Type: Tool	Perkin Elmer	CLS136334	IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market
Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool	Jenco	765JF	For Thermocouple setup
Ketamine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
LivingImage Type: Tool	Perkin Elmer		Software for IVIS Lumina III
Marcaine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Neurostar Software Type: Tool	Stoelting		Comes with surgical robot purchase
Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool	Kent Scientific	PS-03	Used to monitor vitals
PrismPlus mice Type: Animal	Jackson Labortory	031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old	Animals used for the study
Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool	Stoelting	58640	Main robotic drill with stereotaxic frame
Thermocouple Type: Tool	TC Direct	206-557	For Thermocouple setup
USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool	National Instruments	USB-6008	For Thermocouple setup
Xylazine Type: Drug	Sourced from Animal Facility