用于使用受激拉曼散射显微镜进行延时活细胞成像的柔性腔室

摘要

我们报告了一种台顶柔性环境室，用于使用具有透射信号检测的正置受激拉曼散射显微镜对活细胞进行延时成像。脂质液滴在用油酸处理的SKOV3细胞中成像长达24小时，时间间隔为3分钟。

摘要

受激拉曼散射（SRS）显微镜是一种无标记化学成像技术。SRS活细胞成像已被证明可用于许多生物和生物医学应用。然而，活细胞的长期延时SRS成像尚未被广泛采用。SRS显微镜通常使用高数值孔径（NA）水浸物镜和高数值孔径油浸式冷凝器来实现高分辨率成像。在这种情况下，物镜和聚光镜之间的间隙只有几毫米。因此，大多数商用载物台环境箱不能用于SRS成像，因为它们的厚度很大，带有刚性玻璃盖。本文描述了一种柔性腔室的设计和制造，该腔室可用于延时活细胞成像，并在正置显微镜架上进行透射SRS信号检测。腔室的柔韧性是通过使用柔软的材料 - 薄的天然橡胶膜来实现的。新的外壳和腔室设计可以轻松添加到现有的SRS成像设置中。测试和初步结果表明，灵活的腔室系统能够对活细胞进行稳定、长期、延时SRS成像，可用于未来的各种生物成像应用。

引言

光学显微镜用于观察样品的微观结构。与其他技术相比，光学成像速度快、侵入性更小、破坏性更小¹。使用光学显微镜进行活细胞成像是为了长时间捕获培养活细胞的动态²。不同类型的光学对比度提供有关生物样品的不同信息。例如，光学相位显微镜显示了样品³中折射率的细微差异。荧光显微镜广泛用于对特定的生物分子或细胞器进行成像。然而，当进行多色成像时，荧光的宽带激发和发射光谱通常会导致光谱重叠⁴。荧光分子对光敏感，可以在长期、周期性的光照后漂白。此外，荧光标记可以改变细胞^中分子的生物分布5。SRS显微镜是一种无标记的化学成像技术⁶。SRS的对比度依赖于特定化学键的振动跃迁。化学键的振动频率通常表现出较窄的光谱带宽，因此可以对同一样品中的多个拉曼波段进行成像⁷。SRS显微镜是一种独特的活细胞成像工具，以无标记的方式提供多种化学对比⁸。

虽然未染色细胞的SRS成像已被用于许多研究，但活细胞的长期延时SRS成像尚未被广泛采用。一个原因是商业开放室不能直接用于SRS成像，因为它们的厚度为⁹，¹⁰，^11，12。这些带玻璃盖的腔室大多设计用于明场或荧光成像，使用具有反向检测方案的单个高数值孔径物镜。然而，SRS成像更喜欢同时使用高数值孔径物镜和高数值孔径聚光镜的透射检测，这在物镜和聚光镜之间只留下非常短的间隙（通常为几毫米）。为了克服这个问题，我们设计了一个使用软材料的柔性腔室，以便使用正置显微镜框架对活细胞进行延时SRS成像。在这种设计中，水浸物镜被封闭在软室中，可以在三维空间中自由移动，以进行聚焦和成像。

培养大多数哺乳动物细胞的最佳温度为37°C，而室温始终比这低10°。高于或低于37°C的温度对细胞生长速率有显着影响¹³。因此，活细胞成像系统需要对细胞培养环境进行温度控制。众所周知，温度不稳定会导致长期成像过程中的散焦问题¹⁴。为了实现稳定的37°C环境，我们建造了一个大型封闭室来覆盖整个显微镜框架，包括显微镜下方的隔热层（图1）。在相当大的温度控制室中，小型柔性室有助于通过补充 5% CO 2 的调节气流准确保持生理湿度和 pH 值（图 2）。测量腔室的温度和湿度，以确认双腔室设计为长期周期性SRS成像下的细胞生长提供了最佳的细胞培养条件（图3）。然后，我们展示了该系统在延时成像和跟踪SKOV3癌细胞中的脂滴（LD）中的应用（图4，图5和图6）。

研究方案

1.构建显微镜环境外壳

注意:这个大型显微镜环境外壳用于控制显微镜主体的温度和要稳定在37°C的成像环境（图1A）。

1. 使用光学台上的记号笔标记SRS显微镜架和电动载物台的支脚位置。在显微镜的振镜扫描仪前面安装两个虹膜，并进行调整以使泵浦和斯托克斯激光束穿过虹膜光阑的中心。
2. 从光学台上取下显微镜架和载物台。
3. 将硅橡胶片（尺寸:31 x 29英寸，厚度:1/8英寸）放在光学工作台上（图1B）。
4. 用刀沿着标记切割硅橡胶，取出小橡胶片，然后将方形MICA陶瓷片（尺寸:6 x 6英寸，厚度:1/4英寸）放入相同位置。
   注意:MICA陶瓷是一种易于加工的材料¹⁵。它和铝一样坚硬，但是一种极好的隔热体。MICA陶瓷片用于阻止从金属显微镜架和载物台到不锈钢光学台的热传递。应在 MICA 板上钻几个通孔，以允许使用 1/4-20 螺钉安装框架和载物台的支脚。
5. 将显微镜架和载物台移回光学台，并沿着标记线小心地将脚对准MICA陶瓷片。使用1/4-20螺钉将框架和载物台安装在桌子上。
6. 重新对齐SRS光路。调整反射镜1和反射镜2的反射镜支架，使激光束穿过两个预装光圈的中心（图2）。
   注意:用于当前活细胞成像工作的实验室制造的SRS显微镜的技术细节如前^所述16。泵和斯托克斯光束的脉冲宽度为~3-4 ps，玻璃棒分散。系统使用扫描图像¹⁷ 软件进行控制。
7. 在此隔热基础之上，使用五块大型聚碳酸酯板（尺寸:31 x 29 x 28英寸，厚度:0.25英寸）组装环境外壳以覆盖整个显微镜框架。
   注意:外壳盒的尺寸根据显微镜架和载物台的尺寸确定。显微镜外壳盒的前面板需要暂时拆除，以安装柔性室并装载细胞培养皿。
   1. 要组装外壳，请进行简单的加工工作，包括在聚碳酸酯板的每个边缘上切割、钻孔和攻丝螺丝孔。在外壳的右侧和左侧板上切割两个直径为 2.6 英寸的大孔，以分别安装入口和出口管。在背板上切一个直径为 5 mm 的小孔，让激光束进入外壳。
8. 使用铝箔胶带密封盒子的边缘和接口。
9. 将柔性管道软管连接到外壳盒的入口和出口，以允许由加热器模块泵送和控制循环的暖气流。将加热器模块的热传感器放置在培养细胞和成像的柔性室中。将目标温度设置为 37 °C。
   注意: 可以使用扩散器在环境外壳中获得更均匀的气流分布。

2. 组装柔性腔室

1. 使用三个固定螺钉将机加工的空心圆柱形铝片1（材料:铝6061）安装到物镜的物镜转盘上（图2）。
2. 使用四个 1/4-20 螺钉将机加工的空心圆柱形铝片 2 安装到样品架上（图 2）。
   注意:必须修改样品架以容纳50 mm盖玻片底细胞培养皿。使用 1-7/8 英寸孔锯在样品架的中心钻一个通孔。使用50毫米孔锯沉孔，并保持通孔的深度~1毫米。
3. 将带有铝片 2 的样品架安装到电动载物台上，并使用螺钉安装。
4. 将天然橡胶膜套（厚度:0.01英寸;用氰基丙烯酸酯粘合剂粘合）放在两个机加工铝片之间，并在两端使用橡皮筋进行安装。
5. 使用适当的管道和连接器将压缩的 CO₂ 气瓶连接到气体混配器模块。将 CO₂ 输入压力设置为 20-25 psi。使用内置的 CO₂ 传感器和控制器，确保空气混合器模块可以调节 5% 的 CO₂ 并将其混合到气流中。使用在线过滤器清理气流。
6. 使用适当的管道和连接器，将混合空气（含 5% CO₂）引导到放置在热板上的预灭菌水瓶中，然后将加湿的空气引导到柔性室。将热板设置为37°C。 在温水中冒泡气流以增加气流的湿度。

3. 延时活细胞SRS成像实验的准备

1. 用70%乙醇擦拭柔性室的所有部件，包括物镜转换器、水浸物镜和样品架。
2. 使用放置在外壳中的紫外线灯对整个外壳系统进行 20 到 30 分钟的净化。
   注意:为了安全起见，在紫外线消毒过程中不要呆在实验室内。
3. 在常规培养箱的正常生理条件下，在50mm玻璃底培养皿中培养SKOV3细胞12小时。
   注意:在标准生物安全柜中启动SKOV3细胞培养^物18 。
4. 通过卸下螺钉将机加工的铝片 2 与样品架断开。
   注意:这是打开柔性室以装载细胞培养皿的方法。
5. 装入细胞培养皿。请记住在放置细胞培养皿之前在冷凝器顶部添加浸油。取下盘子的盖子，用夹子固定盘子。
   注意:为避免污染，所有操作都应戴手套进行。
6. 将物镜降低到细胞培养基中进行粗聚焦。降低铝片2以封闭柔性室，并使用螺钉将其安装到样品架上。
   注意:铝片 2 的底部附有 2 mm 的硅橡胶垫垫，以紧密密封间隙。
7. 用 5% CO 2 和 19% O₂ 设置空气供应，用于正常细胞培养，气流速率为 200 cc/min。
   注意:可以使用较低的气流速率。这取决于柔性腔室的密封程度。

4. 进行延时活细胞SRS成像实验

1. 将激光波长调谐到 805 nm，以瞄准 2854 ^cm-1 拉曼位移，这归因于 CH₂ 化学键的振动。使用低激光功率来减少对细胞的光损伤。要遵循此协议，请使用泵浦激光器的~15 mW平均功率和~7.5 mW的斯托克斯激光器（固定在1，045 nm）进行长期活细胞成像。
   注意:更高的激光功率将产生更好的SRS成像质量。然而，过高的激光功率会对活细胞造成光损伤。图像质量和光损伤之间存在权衡。
2. 调整和聚焦物镜，使用软件主控制面板上的FOCUS按钮实现细胞的良好SRS成像。要执行快速对焦，请在"配置"面板上将像素数设置为 512 × 512 像素，像素停留时间为 4.8 μs。
3. 将锁相放大器输入范围（通常为5 mV）设置为最大信号电压的两倍。将低通滤波器设置为与像素停留时间相同（4.8 μs）。
   注意:不同的实验室构建的SRS系统可能使用不同的数据采集设置。
4. 获得良好对焦后，将成像分辨率设置为 2，048 × 2，048 像素，以获得 175 μm² 视场，以采集高质量图像。检查主控制面板上的保存功能，并检查通道面板上的 SRS 通道。在主控制通道上将两帧之间的间隔时间设置为 180 秒（3 分钟）。将采集编号设置为 480，以便在 24 小时内进行延时成像。
   注意:根据实验的目的，可以使用较低的成像分辨率。
5. 使用主控制面板上的 LOOP 功能启动自动成像采集。
   注意:检查成像的第一个小时内是否存在由于温度不稳定而导致的焦点漂移。第一个小时的影像学检查可能不稳定。在延时成像会话期间每2-3小时检查一次聚焦。
6. 使用 ImageJ¹⁹ 处理收集的图像。使用以下两种方法进行LD定量:（i）LD/细胞体面积比，和（ii）总LD的平均SRS强度。 通过在2，854 ^cm-1处阈值和归零SRS图像中的非细胞像素来测量细胞体面积。通过阈值化和归零SRS图像中的非LD像素来测量LD面积和强度。
   注:有关 SRS 图像处理的更多详细信息已在之前报告¹⁶.

结果

我们制造并组装了用于延时SRS成像的柔性腔室系统（图1 和 图2），然后评估了系统的性能。显微镜环境外壳内的温度在1小时内达到预期的37°C，这没有显着影响室温（图3A）。柔性室中的温度在1.5 h内达到37 °C，并且在37 °C稳定保持至少24 h（图3B）。柔性室中的相对湿度可在1小时内达到85%，然后保持至少24?...

讨论

延时活细胞SRS显微镜是一种以无标记方式进行分子追踪的替代成像技术。与荧光标记相比，SRS成像没有光漂白，可以对分子进行长期监测。然而，迄今为止，正立式SRS显微镜上的活细胞成像系统尚未商业化。在这项工作中，开发了一种具有稳定隔热显微镜外壳盒和柔性内部软室的活细胞成像系统，以实现透射SRS延时成像。在此设置中，大型外壳盒将温度稳定性保持在37°C，而内部软室提供加湿空?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
A lab-built SRS microscope			https://rdcu.be/cP6ve
HF2LI 50 MHz lock-in amplifer	Zurich Instruments	HF2LI
Iris diaphragm	Thorlabs Inc	SM1D12
Kinematic mirror mount	Thorlabs Inc	KM100
Microscope frame	Nikon Inc	FN-1
Motorized microscopy stage	Prior Scientific	Z-Deck
Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)	Nikon Inc	MBL71405
Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300)	Nikon Inc	MRD77225
Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H)
Airtherm heater module	World Precision Instruments (WPI)	AIRTHERM-SAT-1W
Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor	World Precision Instruments (WPI)	AIRTHERM-SMT-1W
Air/CO2 mixer module	World Precision Instruments (WPI)	ECU-HOC-W
Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD)	McMaster-Carr	56675K71
High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness)	McMaster-Carr	8489K62
Polycarbonate sheets (thickness 0.25'')	McMaster-Carr	8574K286
Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'')	McMaster-Carr	5827T43
Materials and parts for the Flexible chamber
Hot plate	McMaster-Carr	31745K11
High-purity inline filter, 1/4 NPT	McMaster-Carr	6645T18
Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch)	McMaster-Carr	4066A34
Hole saw (cutting diameter 50 mm)	McMaster-Carr	4556A19
High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD	McMaster-Carr	5054K313
Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)	McMaster-Carr	98385K843
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD)	McMaster-Carr	9056K42
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD)	McMaster-Carr	9056K47
Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'')	McMaster-Carr	8975K142
Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'')	McMaster-Carr	9246K21
Objective nosepiece (single)	Nikon Inc	FN-MN-H
Sample holder (modified)	Prior Scientific	HZ202
Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'')	McMaster-Carr	8611K13
Vacuum-sealable glass jar	McMaster-Carr	3231T44
Software
MATLAB	MathWorks
ImageJ (Fiji)		imagej.net
ScanImage	Vidrio Technologies, LLC		SRS imaging software
Materials for live-cell imaging
Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm)	Electron Microscopy Sciences (EMS)	70674-02
DMEM cell culture medium	ThermoFisher Scientific	11965092
Fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	26140079
LysoSensor fluorescent dye DND-189	ThermoFisher Scientific	L7535 (Invitrogen)
Oleic acid	MilliporeSigma	364525
SKOV3 cell line	ATCC	HTB-77