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用于使用受激拉曼散射显微镜进行延时活细胞成像的柔性腔室
摘要
我们报告了一种台顶柔性环境室，用于使用具有透射信号检测的正置受激拉曼散射显微镜对活细胞进行延时成像。脂质液滴在用油酸处理的SKOV3细胞中成像长达24小时，时间间隔为3分钟。
摘要
受激拉曼散射（SRS）显微镜是一种无标记化学成像技术。SRS活细胞成像已被证明可用于许多生物和生物医学应用。然而，活细胞的长期延时SRS成像尚未被广泛采用。SRS显微镜通常使用高数值孔径（NA）水浸物镜和高数值孔径油浸式冷凝器来实现高分辨率成像。在这种情况下，物镜和聚光镜之间的间隙只有几毫米。因此，大多数商用载物台环境箱不能用于SRS成像，因为它们的厚度很大，带有刚性玻璃盖。本文描述了一种柔性腔室的设计和制造，该腔室可用于延时活细胞成像，并在正置显微镜架上进行透射SRS信号检测。腔室的柔韧性是通过使用柔软的材料 - 薄的天然橡胶膜来实现的。新的外壳和腔室设计可以轻松添加到现有的SRS成像设置中。测试和初步结果表明，灵活的腔室系统能够对活细胞进行稳定、长期、延时SRS成像，可用于未来的各种生物成像应用。
引言
光学显微镜用于观察样品的微观结构。与其他技术相比，光学成像速度快、侵入性更小、破坏性更小1。使用光学显微镜进行活细胞成像是为了长时间捕获培养活细胞的动态2。不同类型的光学对比度提供有关生物样品的不同信息。例如，光学相位显微镜显示了样品3中折射率的细微差异。荧光显微镜广泛用于对特定的生物分子或细胞器进行成像。然而，当进行多色成像时，荧光的宽带激发和发射光谱通常会导致光谱重叠4。荧光分子对光敏感，可以在长期、周期性的光照后漂白。此外，荧光标记可以改变细胞中分子的生物分布5。SRS显微镜是一种无标记的化学成像技术6。SRS的对比度依赖于特定化学键的振动跃迁。化学键的振动频率通常表现出较窄的光谱带宽，因此可以对同一样品中的多个拉曼波段进行成像7。SRS显微镜是一种独特的活细胞成像工具，以无标记的方式提供多种化学对比8。
虽然未染色细胞的SRS成像已被用于许多研究，但活细胞的长期延时SRS成像尚未被广泛采用。一个原因是商业开放室不能直接用于SRS成像，因为它们的厚度为9
研究方案
1.构建显微镜环境外壳
注意：这个大型显微镜环境外壳用于控制显微镜主体的温度和要稳定在37°C的成像环境（图1A）。
- 使用光学台上的记号笔标记SRS显微镜架和电动载物台的支脚位置。在显微镜的振镜扫描仪前面安装两个虹膜，并进行调整以使泵浦和斯托克斯激光束穿过虹膜光阑的中心。
- 从光学台上取下显微镜架和载物台。
- 将硅橡胶片（尺寸：31 x 29英寸，厚度：1/8英寸）放在光学工作台上（图1B）。
- 用刀沿着标记切割硅橡胶，取出小橡胶片，然后将方形MICA陶瓷片（尺寸：6 x 6英寸，厚度：1/4英寸）放入相同位置。
注意：MICA陶瓷是一种易于加工的材料15。它和铝一样坚硬，但是一种极好的隔热体。MICA陶瓷片用于阻止从金属显微镜架和载物台到不锈钢光学台的热传递。应在 MICA 板上钻几个通孔，以允许使用 1/4-20 螺钉安装框架和载物台的支脚。 - 将显微镜架和载物台移回光学台，并沿着标记线小心地将脚对准MICA陶瓷片。使用1/4-20螺钉将框架和载物台安装在桌子上。
- 重新对齐SRS光路。调整反射镜1和反射镜2的反射镜支架，使激光束穿过两个预装光圈的中心（
结果
我们制造并组装了用于延时SRS成像的柔性腔室系统（图1 和 图2），然后评估了系统的性能。显微镜环境外壳内的温度在1小时内达到预期的37°C，这没有显着影响室温（图3A）。柔性室中的温度在1.5 h内达到37 °C，并且在37 °C稳定保持至少24 h（图3B）。柔性室中的相对湿度可在1小时内达到85%，然后保持至少24?.......
讨论
延时活细胞SRS显微镜是一种以无标记方式进行分子追踪的替代成像技术。与荧光标记相比，SRS成像没有光漂白，可以对分子进行长期监测。然而，迄今为止，正立式SRS显微镜上的活细胞成像系统尚未商业化。在这项工作中，开发了一种具有稳定隔热显微镜外壳盒和柔性内部软室的活细胞成像系统，以实现透射SRS延时成像。在此设置中，大型外壳盒将温度稳定性保持在37°C，而内部软室提供加湿空?.......
披露声明
作者没有利益冲突需要披露。
致谢
我们要感谢宾汉姆顿大学2019年本科生高级设计团队（Suk Chul Yoon，Ian Foxton，Louis Mazza和James Walsh）对显微镜外壳盒的设计，制造和测试。我们感谢宾汉姆顿大学的Scott Hancock，Olga Petrova和Fabiola Moreno Olivas的有益讨论。这项研究得到了美国国立卫生研究院的支持，奖励号为R15GM140444。
....材料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
参考文献
- Mertz, J. . Introduction to Optical Microscopy. , (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.
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