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Resumen

Informamos una cámara ambiental flexible en la parte superior de la etapa para obtener imágenes de lapso de tiempo de células vivas utilizando microscopía de dispersión Raman estimulada vertical con detección de señal transmitida. Se obtuvieron imágenes de gotitas lipídicas en células SKOV3 tratadas con ácido oleico durante un máximo de 24 h con un intervalo de tiempo de 3 minutos.

Resumen

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) es una tecnología de imágenes químicas sin etiquetas. Las imágenes de células vivas con SRS se han demostrado para muchas aplicaciones biológicas y biomédicas. Sin embargo, las imágenes SRS de lapso de tiempo a largo plazo de células vivas no se han adoptado ampliamente. La microscopía SRS a menudo utiliza un objetivo de inmersión en agua de alta apertura numérica (NA) y un condensador de inmersión en aceite de alta NA para lograr imágenes de alta resolución. En este caso, el espacio entre el objetivo y el condensador es de solo unos pocos milímetros. Por lo tanto, la mayoría de las cámaras ambientales comerciales de etapa superior no se pueden usar para imágenes SRS debido a su gran grosor con una cubierta de vidrio rígido. Este documento describe el diseño y la fabricación de una cámara flexible que se puede utilizar para imágenes de células vivas de lapso de tiempo con detección de señal SRS transmitida en un marco de microscopio vertical. La flexibilidad de la cámara se logra mediante el uso de un material blando: una película delgada de caucho natural. El nuevo diseño de la carcasa y la cámara se puede agregar fácilmente a una configuración de imágenes SRS existente. Las pruebas y los resultados preliminares demuestran que el sistema de cámara flexible permite obtener imágenes SRS estables, a largo plazo y de lapso de tiempo de células vivas, que se pueden utilizar para diversas aplicaciones de bioimagen en el futuro.

Introducción

La microscopía óptica se utiliza para observar las microestructuras de las muestras. La imagen óptica es rápida, menos invasiva y menos destructiva que otras tecnologías1. La obtención de imágenes de células vivas con microscopía óptica se desarrolla para capturar la dinámica de células vivas cultivadas durante un largo período2. Los diferentes tipos de contrastes ópticos proporcionan información distinta sobre las muestras biológicas. Por ejemplo, la microscopía óptica de fase muestra la sutil diferencia en los índices de refracción en la muestra3. La microscopía de fluorescencia se usa ampliamente para obtener imágenes de biomoléculas específicas u orgánulos celulares. Sin embargo, los espectros de excitación y emisión de banda ancha de fluorescencia generalmente resultan en superposición espectral cuando se realizan imágenes multicolor4. Las moléculas fluorescentes son sensibles a la luz y pueden blanquearse después de una exposición periódica a la luz a largo plazo. Además, el etiquetado de fluorescencia puede cambiar la biodistribución de las moléculas en las células5. La microscopía SRS es una tecnología de imagen química sin etiquetas6. El contraste de SRS se basa en la transición vibracional de enlaces químicos específicos. La frecuencia vibratoria de un enlace químico a menudo exhibe un ancho de banda espectral estrecho, lo que hace factible obtener imágenes de múltiples bandas Raman en las mismas muestras7. La microscopía SRS es una herramienta única para la obtención de imágenes de células vivas, que proporciona múltiples contrastes químicos sin etiquetas8.

Si bien las imágenes SRS de células no teñidas se han utilizado para muchos estudios, las imágenes SRS de lapso de tiempo a largo plazo de células vivas no se han adoptado ampliamente. Una razón es que las cámaras abiertas comerciales no se pueden usar directamente para imágenes SRS debido a su gran espesor 9,10,11,12. Estas cámaras con una tapa de vidrio están diseñadas principalmente para imágenes de campo claro o fluorescencia utilizando un solo objetivo de alta NA con un esquema de detección hacia atrás. Sin embargo, las imágenes SRS prefieren la detección transmitida utilizando tanto un objetivo de alta NA como un condensador de alta NA, lo que deja solo un espacio muy corto (generalmente unos pocos milímetros) entre el objetivo y el condensador. Para superar este problema, diseñamos una cámara flexible utilizando un material blando para permitir la obtención de imágenes SRS de lapso de tiempo de células vivas utilizando un marco de microscopio vertical. En este diseño, el objetivo de inmersión de agua estaba encerrado en la cámara blanda y puede moverse libremente en tres dimensiones para fines de enfoque e imagen.

La temperatura óptima para cultivar la mayoría de las células de mamíferos es de 37 ° C, mientras que la temperatura ambiente es siempre 10 ° más baja que esto. Una temperatura superior o inferior a 37 °C tiene un efecto dramático en la tasa de crecimiento celular13. Por lo tanto, se requiere el control de la temperatura del entorno de cultivo celular en un sistema de imágenes de células vivas. Se sabe que la inestabilidad de la temperatura dará lugar a problemas de desenfoque durante las imágenes a largo plazo14. Para lograr un entorno estable de 37 °C, construimos una gran cámara de recinto para cubrir todo el marco del microscopio, incluida una capa de aislamiento térmico debajo del microscopio (Figura 1). Dentro de la cámara de control de temperatura considerable, la pequeña cámara flexible ayuda a mantener con precisión la humedad fisiológica y el pH a través del flujo de aire regulado complementado con 5% deCO2 (Figura 2). La temperatura y la humedad de las cámaras se midieron para confirmar que el diseño de doble cámara proporcionaba la condición óptima de cultivo celular para el crecimiento celular bajo imágenes SRS periódicas a largo plazo (Figura 3). Luego demostramos la aplicación del sistema para imágenes de lapso de tiempo y seguimiento de gotas de lípidos (LD) en células cancerosas SKOV3 (Figura 4, Figura 5 y Figura 6).

Protocolo

1. Construir el recinto ambiental del microscopio

NOTA: Esta gran carcasa ambiental de microscopio se utiliza para controlar la temperatura del cuerpo del microscopio y el entorno de imágenes que se estabilizará a 37 °C (Figura 1A).

  1. Marque las ubicaciones de los pies del marco del microscopio SRS y la etapa motorizada con un rotulador en la mesa óptica. Monte dos diafragmas de iris frente al escáner galvanómetro del microscopio y ajuste para que la bomba y los rayos láser de Stokes pasen por el centro de los diafragmas de iris.
  2. Retire el marco del microscopio y la plataforma de la mesa óptica.
  3. Coloque la lámina de goma de silicona (tamaño: 31 x 29 pulgadas, grosor: 1/8 de pulgada) sobre la mesa óptica (Figura 1B).
  4. Corte la goma de silicona a lo largo de las marcas con un cuchillo, retire las piezas de goma pequeñas y coloque las láminas de cerámica MICA cuadradas (tamaño: 6 x 6 pulgadas, grosor: 1/4 de pulgada) en los mismos lugares.
    NOTA: La cerámica MICA es un material fácil de mecanizar15. Es tan duro como el aluminio pero es un excelente aislante térmico. Se utilizaron láminas cerámicas MICA para detener la transferencia de calor desde el marco y el escenario del microscopio metálico a la mesa óptica de acero inoxidable. Se deben perforar algunos orificios pasantes en las hojas MICA para permitir el uso de tornillos 1/4-20 para montar los pies del marco y el escenario.
  5. Mueva el marco del microscopio y el escenario de nuevo a la mesa óptica y alinee cuidadosamente los pies sobre las láminas cerámicas MICA a lo largo de las líneas de marcador. Use tornillos 1/4-20 para montar el marco y el escenario en la mesa.
  6. Vuelva a alinear la ruta óptica SRS. Ajuste los soportes del espejo del espejo 1 y el espejo 2 para que el rayo láser pase por el centro de los dos diafragmas de iris premontados (Figura 2).
    NOTA: Los detalles técnicos del microscopio SRS construido en laboratorio utilizado para el trabajo actual de imágenes de células vivas se describen anteriormente16. El ancho de pulso de la bomba y los haces de Stokes es ~3-4 ps con dispersión de varilla de vidrio. El sistema se controla mediante el software ScanImage17 .
  7. Sobre esta base de aislamiento térmico, ensamble el recinto ambiental para cubrir todo el marco del microscopio utilizando cinco piezas de láminas grandes de policarbonato (tamaño: 31 x 29 x 28 pulgadas, grosor: 0.25 pulgadas).
    NOTA: El tamaño de la caja de la carcasa se determina en función de las dimensiones del marco del microscopio y la plata. El panel frontal de la caja de la carcasa del microscopio deberá retirarse temporalmente para instalar la cámara flexible y cargar la placa de cultivo celular.
    1. Para ensamblar la carcasa, realice trabajos de mecanizado simples, que incluyen cortar, taladrar y roscar los orificios de los tornillos en cada borde de las láminas de policarbonato. Corte dos orificios grandes con un diámetro de 2.6 pulgadas en las hojas derecha e izquierda del gabinete para adaptarse al tubo de entrada y salida, respectivamente. Corte un pequeño orificio con un diámetro de 5 mm en la lámina posterior para permitir que los rayos láser entren en el recinto.
  8. Selle los bordes y las interfaces de la caja con cinta de papel de aluminio.
  9. Conecte la manguera de conducto flexible a los puertos de entrada y salida de la caja del gabinete para permitir el flujo de aire caliente circulante bombeado y controlado por el módulo del calentador. Coloque el sensor térmico del módulo calentador en la cámara flexible donde se cultivan las células y se obtienen imágenes. Ajuste la temperatura objetivo a 37 °C.
    NOTA: Se puede usar un difusor para obtener una distribución más uniforme del flujo de aire en el recinto ambiental.

2. Montar la cámara flexible

  1. Monte la pieza cilíndrica de aluminio hueco mecanizado 1 (material: aluminio 6061) en la nariz del objetivo utilizando tres tornillos de fijación (Figura 2).
  2. Monte la pieza cilíndrica de aluminio hueca mecanizada 2 en el soporte de la muestra utilizando cuatro tornillos 1/4-20 (Figura 2).
    NOTA: El portamuestras debe modificarse para sostener la placa de cultivo celular con fondo de vidrio cubierta de 50 mm. Perfore un orificio pasante en el centro del soporte de la muestra con una sierra de orificio de 1-7/8 pulgadas. Contraperfore el orificio con una sierra de orificio de 50 mm y mantenga la profundidad del orificio pasante ~ 1 mm.
  3. Coloque el portamuestras con la pieza de aluminio 2 en la platina motorizada y móntela con tornillos.
  4. Coloque el manguito de la película de caucho natural (grosor: 0.01 pulgadas; pegado con adhesivo de cianoacrilato) entre las dos piezas de aluminio mecanizadas y móntelo con bandas de goma en cada extremo.
  5. Conecte el cilindro de CO2 comprimido al módulo mezclador de gas utilizando tubos y conectores adecuados. Ajuste la presión de entrada deCO2 a 20-25 psi. Utilice un sensor de CO2 incorporado y un controlador para garantizar que el módulo mezclador de aire pueda regular y mezclar un 5% deCO2 en el flujo de aire. Use filtros en línea para limpiar el flujo de aire.
  6. Usando tubos y conectores adecuados, guíe el aire mezclado (con 5% deCO2) a la botella de agua preesterilizada colocada en la placa caliente, y luego guíe el aire humidificado a la cámara flexible. Ajuste la placa caliente a 37 °C. Burbujee el flujo de aire en el agua tibia para aumentar la humedad del flujo de aire.

3. Preparación para experimentos de imágenes SRS de células vivas de lapso de tiempo

  1. Limpie todas las partes de la cámara flexible con etanol al 70%, incluida la pieza nasal, el objetivo de inmersión en agua y el soporte de la muestra.
  2. Descontamine todo el sistema de la carcasa utilizando una lámpara UV colocada en la carcasa durante 20 a 30 min.
    NOTA: No permanezca en la sala de laboratorio durante el proceso de desinfección UV por seguridad.
  3. Cultivar células SKOV3 en una placa de Petri con fondo de vidrio de 50 mm durante 12 h en condiciones fisiológicas normales en una incubadora regular.
    NOTA: Inicie el cultivo celular SKOV318 en un gabinete de bioseguridad estándar.
  4. Desconecte la pieza de aluminio mecanizado 2 del portamuestras retirando los tornillos.
    NOTA: Esta es la forma de abrir la cámara flexible para cargar la placa de cultivo celular.
  5. Cargue la placa de cultivo celular. Recuerde agregar aceite de inmersión en la parte superior del condensador antes de colocar la placa de cultivo celular. Retire la tapa del plato e inmovilice el plato con las abrazaderas.
    NOTA: Para evitar la contaminación, todas las operaciones deben realizarse con guantes.
  6. Baje el objetivo en los medios de cultivo celular para un enfoque grueso. Baje la pieza de aluminio 2 para encerrar la cámara flexible y móntela en el portamuestras con tornillos.
    NOTA: Una almohadilla de cojín de goma de silicona de 2 mm está unida a la parte inferior de la pieza de aluminio 2 para sellar el espacio herméticamente.
  7. Ajuste el suministro de aire con 5% de CO2 y 19% deO2 para cultivo celular normal con un caudal de aire de 200 cc/min.
    NOTA: Se puede utilizar un caudal de aire más bajo. Depende de qué tan bien esté sellada la cámara flexible.

4. Realizar experimentos de imágenes SRS de células vivas de lapso de tiempo

  1. Sintoniza la longitud de onda del láser a 805 nm para apuntar al desplazamiento Raman de 2854 cm-1 , que se atribuye a la vibración de los enlaces químicos CH2 . Utilice baja potencia láser para reducir el fotodaño a las células. Para seguir este protocolo, use ~ 15 mW de potencia promedio del láser de la bomba y ~ 7.5 mW del láser Stokes (fijado a 1,045 nm) para imágenes de células vivas a largo plazo.
    NOTA: Una mayor potencia láser producirá una mejor calidad de imagen SRS. Sin embargo, una potencia láser demasiado alta inducirá fotodaño a las células vivas. Hay una compensación entre la calidad de imagen y el fotodaño.
  2. Ajuste y enfoque el objetivo para lograr una buena imagen SRS de las células utilizando el botón FOCUS en el panel MAIN CONTROLS del software. Para realizar un enfoque rápido, establezca el número de píxeles en 512 × 512 píxeles con un tiempo de permanencia de píxeles de 4,8 μs en el panel CONFIGURACIÓN.
  3. Ajuste el rango de entrada del amplificador de bloqueo (normalmente 5 mV) para que sea el doble del voltaje máximo de la señal. Establezca el filtro de paso bajo para que sea el mismo que el tiempo de permanencia de píxeles (4,8 μs).
    NOTA: Los diferentes sistemas SRS construidos en laboratorio pueden utilizar diferentes configuraciones de adquisición de datos.
  4. Después de lograr un buen enfoque, establezca la resolución de imagen en 2.048 × 2.048 píxeles para un campo de visión de175 μm 2 para la adquisición de imágenes de alta calidad. Marque la función GUARDAR en el panel CONTROLES PRINCIPALES y compruebe el canal SRS en el panel CANALES . Defina el intervalo de tiempo entre dos fotogramas para que sea de 180 s (3 min) en el canal MAIN CONTROLS. Establezca el número de adquisición en 480 para imágenes de lapso de tiempo durante 24 h.
    NOTA: Se puede utilizar una resolución de imagen más baja según el propósito de los experimentos.
  5. Inicie la adquisición automatizada de imágenes mediante la función LOOP del panel MAIN CONTROLS .
    NOTA: Compruebe si hay desviación focal debido a la inestabilidad de la temperatura en la primera hora de imagen. La primera hora de imágenes puede no ser estable. Compruebe el enfoque cada 2-3 h durante la sesión de imágenes de lapso de tiempo.
  6. Procese las imágenes recopiladas utilizando ImageJ19. Utilice los dos métodos siguientes para la cuantificación de LD: (i) la relación LD/área corporal celular, y (ii) la intensidad media de SRS de LD total. Mida el área del cuerpo celular mediante umbrales y reducción a cero de los píxeles no celulares en las imágenes SRS a 2.854 cm-1. Mida el área LD y la intensidad mediante el umbral y la puesta a cero de los píxeles no LD en las imágenes SRS.
    NOTA: Anteriormente se informaron más detalles sobre el procesamiento de imágenes SRS16.

Resultados

Fabricamos y ensamblamos el sistema de cámara flexible para imágenes SRS de lapso de tiempo (Figura 1 y Figura 2), y luego evaluamos el rendimiento del sistema. La temperatura dentro del recinto ambiental del microscopio alcanzó los 37 °C esperados en 1 h, lo que no afectó significativamente la temperatura ambiente (Figura 3A). La temperatura en la cámara flexible alcanzó los 37 °C en 1,5 h, y se mantuvo estable a 37 °C dur...

Discusión

La microscopía SRS de células vivas de lapso de tiempo es una técnica de imagen alternativa para el seguimiento de moléculas sin etiquetas. En comparación con el etiquetado de fluorescencia, las imágenes SRS están libres de fotoblanqueo, lo que permite el monitoreo a largo plazo de las moléculas. Sin embargo, hasta la fecha, el sistema de imágenes de células vivas en una microscopía SRS vertical no está disponible comercialmente. En este trabajo, se desarrolló un sistema de imágenes de células vivas con un...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Queremos agradecer al Equipo de Diseño Senior de Pregrado 2019 (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza y James Walsh) de la Universidad de Binghamton por el diseño, fabricación y prueba de la caja de la carcasa del microscopio. Agradecemos a Scott Hancock, Olga Petrova y Fabiola Moreno Olivas de la Universidad de Binghamton por sus útiles discusiones. Esta investigación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio R15GM140444.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
A lab-built SRS microscopehttps://rdcu.be/cP6ve
HF2LI 50 MHz lock-in ampliferZurich InstrumentsHF2LI
Iris diaphragmThorlabs IncSM1D12
Kinematic mirror mountThorlabs IncKM100
Microscope frameNikon IncFN-1
Motorized microscopy stagePrior ScientificZ-Deck
Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)Nikon IncMBL71405
Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300)Nikon IncMRD77225
Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H)
Airtherm heater moduleWorld Precision Instruments (WPI)AIRTHERM-SAT-1W
Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitorWorld Precision Instruments (WPI)AIRTHERM-SMT-1W
Air/CO2 mixer moduleWorld Precision Instruments (WPI)ECU-HOC-W
Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD)McMaster-Carr56675K71
High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness)McMaster-Carr8489K62
Polycarbonate sheets (thickness 0.25'')McMaster-Carr8574K286
Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'')McMaster-Carr5827T43
Materials and parts for the Flexible chamber
Hot plateMcMaster-Carr31745K11
High-purity inline filter, 1/4 NPTMcMaster-Carr6645T18
Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch)McMaster-Carr4066A34
Hole saw (cutting diameter 50 mm)McMaster-Carr4556A19
High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm ODMcMaster-Carr5054K313
Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)McMaster-Carr98385K843
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD)McMaster-Carr9056K42
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD)McMaster-Carr9056K47
Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'')McMaster-Carr8975K142
Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'')McMaster-Carr9246K21
Objective nosepiece (single)Nikon IncFN-MN-H
Sample holder (modified)Prior ScientificHZ202
Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'')McMaster-Carr8611K13
Vacuum-sealable glass jarMcMaster-Carr3231T44
Software
MATLABMathWorks
ImageJ (Fiji)imagej.net
ScanImageVidrio Technologies, LLCSRS imaging software
Materials for live-cell imaging
Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm)Electron Microscopy Sciences (EMS)70674-02
DMEM cell culture mediumThermoFisher Scientific11965092
Fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher Scientific26140079
LysoSensor fluorescent dye DND-189ThermoFisher ScientificL7535 (Invitrogen)
Oleic acidMilliporeSigma364525
SKOV3 cell lineATCCHTB-77

Referencias

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