Eine flexible Kammer für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Zusammenfassung

Wir berichten über eine flexible Klimakammer mit Tischaufsatz für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen mittels aufrecht stimulierter Raman-Streumikroskopie mit Transitsignaldetektion. Lipidtröpfchen wurden in SKOV3-Zellen, die mit Ölsäure behandelt wurden, für bis zu 24 h in einem Zeitintervall von 3 Minuten abgebildet.

Zusammenfassung

Die stimulierte Raman-Streumikroskopie (SRS) ist eine markierungsfreie chemische Bildgebungstechnologie. Die Lebendzellbildgebung mit SRS wurde für viele biologische und biomedizinische Anwendungen demonstriert. Die Langzeit-Zeitraffer-SRS-Bildgebung von lebenden Zellen ist jedoch noch nicht weit verbreitet. Die SRS-Mikroskopie verwendet häufig ein Wasserimmersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur (NA) und einen Ölimmersionskondensator mit hoher NA, um eine hochauflösende Bildgebung zu erzielen. In diesem Fall beträgt der Abstand zwischen Objektiv und Kondensor nur wenige Millimeter. Daher können die meisten kommerziellen Stage-Top-Klimakammern aufgrund ihrer großen Dicke mit einer starren Glasabdeckung nicht für die SRS-Bildgebung verwendet werden. Dieser Artikel beschreibt das Design und die Herstellung einer flexiblen Kammer, die für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen mit transmittierter SRS-Signaldetektion auf einem aufrechten Mikroskoprahmen verwendet werden kann. Die Flexibilität der Kammer wird durch die Verwendung eines weichen Materials - einer dünnen Naturkautschukfolie - erreicht. Das neue Gehäuse- und Kammerdesign kann problemlos in ein bestehendes SRS-Bildgebungssystem integriert werden. Die Tests und vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass das flexible Kammersystem eine stabile, langfristige Zeitraffer-SRS-Bildgebung von lebenden Zellen ermöglicht, die in Zukunft für verschiedene Bioimaging-Anwendungen verwendet werden kann.

Einleitung

Die optische Mikroskopie dient der Beobachtung der Mikrostrukturen von Proben. Die optische Bildgebung ist schnell, weniger invasiv und weniger zerstörerisch als andere Technologien¹. Die Bildgebung lebender Zellen mit optischer Mikroskopie wurde entwickelt, um die Dynamik kultivierter lebender Zellen über einen langen Zeitraum zu erfassen². Verschiedene Arten von optischen Kontrasten liefern unterschiedliche Informationen über biologische Proben. Zum Beispiel zeigt die optische Phasenmikroskopie den feinen Unterschied in den Brechungsindizes in der Probe³. Die Fluoreszenzmikroskopie wird häufig verwendet, um bestimmte Biomoleküle oder Zellorganellen abzubilden. Die breitbandigen Anregungs- und Emissionsspektren der Fluoreszenz führen jedoch in der Regel zu spektralen Überlappungen, wenn eine Mehrfarbenbildgebung durchgeführt wird⁴. Fluoreszierende Moleküle sind lichtempfindlich und können nach längerer, periodischer Lichtexposition gebleicht werden. Darüber hinaus kann die Fluoreszenzmarkierung die Bioverteilung der Moleküle in Zellen verändern⁵. Die SRS-Mikroskopie ist eine markierungsfreie chemische Bildgebungstechnologie⁶. Der Kontrast von SRS beruht auf dem Schwingungsübergang spezifischer chemischer Bindungen. Die Schwingungsfrequenz einer chemischen Bindung weist oft eine schmale spektrale Bandbreite auf, so dass es möglich ist, mehrere Raman-Banden in denselben Proben abzubilden⁷. Die SRS-Mikroskopie ist ein einzigartiges Werkzeug für die Bildgebung lebender Zellen, das mehrere chemische Kontraste auf markierungsfreie Weise liefert⁸.

Während die SRS-Bildgebung von ungefärbten Zellen für viele Studien verwendet wurde, ist die Langzeit-Zeitraffer-SRS-Bildgebung von lebenden Zellen noch nicht weit verbreitet. Ein Grund dafür ist, dass kommerzielle offene Kammern aufgrund ihrer großen Dicke nicht direkt für die SRS-Bildgebung verwendet werden können 9,10,11,12. Diese Kammern mit Glasdeckel sind meist für die Hellfeld- oder Fluoreszenzbildgebung mit einem einzigen Objektiv mit hoher NA und einem Rückwärtsdetektionsschema ausgelegt. Die SRS-Bildgebung bevorzugt jedoch die transmittierte Detektion sowohl mit einem Objektiv mit hoher NA als auch mit einem Kondensator mit hoher NA, wodurch nur ein sehr kurzer Abstand (typischerweise einige Millimeter) zwischen dem Objektiv und dem Kondensator verbleibt. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine flexible Kammer aus weichem Material entwickelt, die eine Zeitraffer-SRS-Bildgebung von lebenden Zellen mit einem aufrechten Mikroskoprahmen ermöglicht. Bei dieser Konstruktion wurde das Wassertauchobjektiv in der weichen Kammer eingeschlossen und kann sich zu Fokussier- und Abbildungszwecken frei dreidimensional bewegen.

Die optimale Temperatur für die Kultivierung der meisten Säugetierzellen liegt bei 37 °C, während die Raumtemperatur immer 10° niedriger ist. Eine Temperatur von mehr oder weniger als 37 °C hat einen dramatischen Einfluss auf die Zellwachstumsrate¹³. Daher ist eine Temperaturkontrolle der Zellkulturumgebung in einem Lebendzell-Bildgebungssystem erforderlich. Es ist bekannt, dass Temperaturinstabilität während der Langzeitbildgebung zu Defokussierungsproblemen führt¹⁴. Um eine stabile Umgebung bei 37 °C zu erreichen, haben wir eine große Gehäusekammer gebaut, die den gesamten Mikroskoprahmen abdeckt, einschließlich einer Wärmedämmschicht unter dem Mikroskop (Abbildung 1). Innerhalb der großen Temperaturregelkammer trägt die kleine flexible Kammer dazu bei, die physiologische Luftfeuchtigkeit und den pH-Wert durch den regulierten Luftstrom, der mit 5 % CO 2 ergänzt wird, genau aufrechtzuerhalten (Abbildung 2). Die Temperatur und Luftfeuchtigkeit der Kammern wurden gemessen, um zu bestätigen, dass das Doppelkammerdesign die optimalen Zellkulturbedingungen für das Zellwachstum unter langfristiger, periodischer SRS-Bildgebung bot (Abbildung 3). Anschließend demonstrierten wir die Anwendung des Systems zur Zeitraffer-Bildgebung und Verfolgung von Lipidtröpfchen (LDs) in SKOV3-Krebszellen (Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6).

Protokoll

1. Bauen Sie die Umgebungseinhausung des Mikroskops

Anmerkungen: Dieses große Mikroskopgehäuse wird verwendet, um die Temperatur des Mikroskopgehäuses und der zu stabilisierenden Bildgebungsumgebung bei 37 °C zu steuern (Abbildung 1A).

1. Markieren Sie die Positionen der Füße des SRS-Mikroskoprahmens und des motorisierten Tisches mit einem Markierungsstift auf dem optischen Tisch. Montieren Sie zwei Irisblenden vor dem Galvanometer-Scanner des Mikroskops und stellen Sie sie so ein, dass die Pump- und Stokes-Laserstrahlen durch die Mitte der Irisblenden geleitet werden.
2. Entfernen Sie das Mikroskopgestell und den Tisch vom optischen Tisch.
3. Legen Sie die Silikonkautschukplatte (Größe: 31 x 29 Zoll, Dicke: 1/8 Zoll) auf den optischen Tisch (Abbildung 1B).
4. Schneiden Sie den Silikonkautschuk mit einem Messer entlang der Markierungen ab, entfernen Sie kleine Gummistücke und legen Sie die quadratischen MICA-Keramikplatten (Größe: 6 x 6 Zoll, Dicke: 1/4 Zoll) an die gleichen Stellen.
   HINWEIS: MICA-Keramik ist ein leicht zu bearbeitendes Material¹⁵. Es ist so hart wie Aluminium, aber ein ausgezeichneter Wärmeisolator. MICA-Keramikplatten wurden verwendet, um die Wärmeübertragung vom Mikroskoprahmen und -tisch aus Metall auf den optischen Tisch aus Edelstahl zu verhindern. Es sollten einige Durchgangslöcher in die MICA-Platten gebohrt werden, um die Verwendung von 1/4-20 Schrauben für die Befestigung der Füße des Rahmens und der Bühne zu ermöglichen.
5. Bewegen Sie das Mikroskopgestell und den Tisch zurück zum optischen Tisch und richten Sie die Füße vorsichtig entlang der Markierungslinien auf den MICA-Keramikplatten aus. Verwenden Sie 1/4-20 Schrauben, um den Rahmen und die Bühne auf dem Tisch zu befestigen.
6. Richten Sie den optischen SRS-Pfad neu aus. Stellen Sie die Spiegelhalterungen von Spiegel 1 und Spiegel 2 so ein, dass der Laserstrahl durch die Mitte der beiden vormontierten Irisblenden geht (Abbildung 2).
   HINWEIS: Die technischen Details des im Labor gebauten SRS-Mikroskops, das für die aktuellen Lebendzell-Bildgebungsarbeiten verwendet wird, wurden zuvor^{beschrieben 16}. Die Pulsbreite der Pumpe und der Stokes-Strahlen beträgt ~3-4 ps mit Glasstabdispersion. Gesteuert wird das System mit der Software ScanImage¹⁷ .
7. Montieren Sie auf diesem Wärmedämmfundament das Umgebungsgehäuse so, dass es den gesamten Mikroskoprahmen mit fünf großen Polycarbonatplatten (Größe: 31 x 29 x 28 Zoll, Dicke: 0,25 Zoll) abdeckt.
   HINWEIS: Die Größe des Gehäusekastens wird anhand der Abmessungen des Mikroskoprahmens und des Tisches bestimmt. Die Frontplatte des Mikroskopgehäuses muss vorübergehend entfernt werden, um die flexible Kammer zu installieren und die Zellkulturschale zu beladen.
   1. Um das Gehäuse zusammenzubauen, führen Sie einfache Bearbeitungsarbeiten durch, einschließlich Schneiden, Bohren und Gewindebohren von Schraubenlöchern an jeder Kante der Polycarbonatplatten. Schneiden Sie zwei große Löcher mit einem Durchmesser von 2,6 Zoll auf die rechten und linken Bleche des Gehäuses, um den Einlass- bzw. Auslassschlauch anzupassen. Schneiden Sie ein kleines Loch mit einem Durchmesser von 5 mm in die Rückseite, damit die Laserstrahlen in das Gehäuse eindringen können.
8. Versiegeln Sie die Kanten und Schnittstellen der Box mit Alufolienklebeband.
9. Schließen Sie den flexiblen Kanalschlauch an die Einlass- und Auslassöffnungen des Gehäusekastens an, damit der zirkulierte Warmluftstrom vom Heizmodul gepumpt und gesteuert wird. Platzieren Sie den Thermosensor des Heizmoduls in der flexiblen Kammer, in der die Zellen kultiviert und abgebildet werden. Stellen Sie die Zieltemperatur auf 37 °C ein.
   Anmerkungen: Ein Diffusor kann verwendet werden, um eine gleichmäßigere Luftstromverteilung im Umgebungsgehäuse zu erzielen.

2. Montieren Sie die flexible Kammer

1. Montieren Sie das bearbeitete hohlzylindrische Aluminiumstück 1 (Material: Aluminium 6061) mit drei Stellschrauben am Objektivrevolver des Objektivs (Abbildung 2).
2. Montieren Sie das bearbeitete hohlzylindrische Aluminiumstück 2 mit vier 1/4-20-Schrauben am Probenhalter (Abbildung 2).
   Anmerkungen: Der Probenhalter muss so modifiziert werden, dass er die 50-mm-Deckelzellkulturschale mit Glasboden aufnehmen kann. Bohren Sie mit einer 1-7/8-Zoll-Lochsäge ein Durchgangsloch in die Mitte des Probenhalters. Bohren Sie das Loch mit einer 50-mm-Lochsäge ab und halten Sie die Tiefe der Durchgangsbohrung bei ~1 mm.
3. Montieren Sie den Probenhalter mit dem Aluminiumstück 2 auf dem Motortisch und befestigen Sie ihn mit Schrauben.
4. Legen Sie die Naturkautschuk-Folienhülle (Dicke: 0,01 Zoll; mit Cyanacrylat-Kleber verklebt) zwischen die beiden bearbeiteten Aluminiumteile und montieren Sie sie mit Gummibändern an jedem Ende.
5. Verbinden Sie die komprimierte CO_{2 -}Flasche mit den richtigen Schläuchen und Anschlüssen mit dem Gasmischermodul. Stellen Sie den CO₂ -Eingangsdruck auf 20-25 psi ein. Verwenden Sie einen eingebauten CO 2 -Sensor und einen Regler, um sicherzustellen, dass das Luftmischermodul 5 % CO₂ regulieren und in den Luftstrom mischen kann. Verwenden Sie Inline-Filter, um den Luftstrom zu reinigen.
6. Leiten Sie die Mischluft (mit 5 % CO₂) mit geeigneten Schläuchen und Anschlüssen zu der vorsterilisierten Wasserflasche, die sich auf der Heizplatte befindet, und leiten Sie dann die befeuchtete Luft in die flexible Kammer. Stellen Sie die Kochplatte auf 37 °C ein. Blasen Sie den Luftstrom im warmen Wasser, um die Luftfeuchtigkeit des Luftstroms zu erhöhen.

3. Vorbereitung für Zeitraffer-Live-Cell-SRS-Bildgebungsexperimente

1. Wischen Sie alle Teile der flexiblen Kammer mit 70%igem Ethanol ab, einschließlich des Objektivrevolvers, des Wassertauchobjektivs und des Probenhalters.
2. Dekontaminieren Sie das gesamte Gehäusesystem mit einer UV-Lampe, die 20 bis 30 Minuten lang im Gehäuse platziert wird.
   Anmerkungen: Halten Sie sich aus Sicherheitsgründen während des UV-Desinfektionsprozesses nicht im Laborraum auf.
3. Kultivieren Sie SKOV3-Zellen in einer 50-mm-Petrischale mit Glasboden für 12 h unter normalen physiologischen Bedingungen in einem normalen Inkubator.
   HINWEIS: Starten Sie die SKOV3-Zellkultur¹⁸ in einer Standard-Biosicherheitswerkbank.
4. Trennen Sie das bearbeitete Aluminiumteil 2 vom Probenhalter, indem Sie die Schrauben entfernen.
   Anmerkungen: Auf diese Weise wird die flexible Kammer geöffnet, um die Zellkulturschale zu beladen.
5. Legen Sie die Zellkulturschale ein. Denken Sie daran, Immersionsöl auf die Oberseite des Kondensators zu geben, bevor Sie die Zellkulturschale aufstellen. Entfernen Sie den Deckel der Schüssel und fixieren Sie die Schüssel mit den Klammern.
   Anmerkungen: Um eine Kontamination zu vermeiden, sollten alle Vorgänge mit Handschuhen durchgeführt werden.
6. Senken Sie das Objektiv in das Zellkulturmedium, um eine grobe Fokussierung zu erzielen. Senken Sie das Aluminiumstück 2 ab, um die flexible Kammer zu umschließen, und befestigen Sie es mit Schrauben am Probenhalter.
   Anmerkungen: Eine 2 mm dicke Silikongummi-Polsterauflage ist an der Unterseite des Aluminiumstücks 2 angebracht, um den Spalt dicht abzudichten.
7. Stellen Sie die Luftzufuhr auf 5 % CO₂ und 19 %_O2 für normale Zellkulturen mit einem Luftdurchsatz von 200 cc/min ein.
   Anmerkungen: Es kann ein geringerer Luftdurchsatz verwendet werden. Es kommt darauf an, wie gut die flexible Kammer abgedichtet ist.

4. Führen Sie Zeitraffer-SRS-Bildgebungsexperimente mit lebenden Zellen durch

1. Stimmen Sie die Laserwellenlänge auf 805 nm ab, um die ^{Raman-Verschiebung} von 2854 cm-1 zu erreichen, die auf die Schwingung chemischer_{CH2-Bindungen} zurückzuführen ist. Verwenden Sie eine niedrige Laserleistung, um Lichtschäden an den Zellen zu reduzieren. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie ~15 mW durchschnittliche Leistung des Pumplasers und ~7,5 mW des Stokes-Lasers (fixiert auf 1.045 nm) für die Langzeitbildgebung lebender Zellen.
   HINWEIS: Eine höhere Laserleistung führt zu einer besseren SRS-Bildqualität. Eine zu hohe Laserleistung führt jedoch zu einer Lichtschädigung lebender Zellen. Es gibt einen Kompromiss zwischen Bildqualität und Lichtschäden.
2. Passen Sie das Objektiv an und fokussieren Sie es, um eine gute SRS-Bildgebung der Zellen zu erzielen, indem Sie die FOCUS-Taste auf dem Bedienfeld MAIN CONTROLS der Software verwenden. Um eine schnelle Fokussierung durchzuführen, stellen Sie die Pixelzahl auf 512 × 512 Pixel mit einer Pixelverweildauer von 4,8 μs im Bedienfeld KONFIGURATION ein.
3. Stellen Sie den Eingangsbereich des Lock-in-Verstärkers (typischerweise 5 mV) auf das Doppelte der maximalen Signalspannung ein. Stellen Sie den Tiefpassfilter so ein, dass er mit der Pixelverweildauer (4,8 μs) übereinstimmt.
   HINWEIS: Verschiedene im Labor gebaute SRS-Systeme können unterschiedliche Datenerfassungseinstellungen verwenden.
4. Nachdem Sie eine gute Fokussierung erreicht haben, stellen Sie die Bildauflösung auf 2.048 × 2.048 Pixel für ein Sichtfeld von 175^μm2 für die Aufnahme hochwertiger Bilder ein. Aktivieren Sie die SAVE-Funktion im Bedienfeld " HAUPTEINSTELLUNGEN " und überprüfen Sie den SRS-Kanal im Bedienfeld "KANÄLE ". Stellen Sie die Intervallzeit zwischen zwei Bildern auf 180 s (3 min) auf dem MAIN CONTROLS-Kanal ein. Stellen Sie die Erfassungszahl auf 480 ein, um Zeitrafferaufnahmen über 24 Stunden zu machen.
   HINWEIS: Je nach Zweck der Experimente kann eine niedrigere Bildauflösung verwendet werden.
5. Starten Sie die automatische Bildaufnahme mit der LOOP-Funktion auf dem Bedienfeld MAIN CONTROLS .
   HINWEIS: Prüfen Sie, ob in der ersten Stunde der Bildgebung eine Fokusdrift aufgrund von Temperaturinstabilität vorliegt. Die Bildgebung in der ersten Stunde ist möglicherweise nicht stabil. Überprüfen Sie die Fokussierung alle 2-3 Stunden während der Zeitrafferaufnahme.
6. Bearbeiten Sie die gesammelten Bilder mit ImageJ¹⁹. Verwenden Sie die folgenden zwei Methoden für die LD-Quantifizierung: (i) das LD/Zellkörperflächen-Verhältnis und (ii) die mittlere SRS-Intensität der gesamten LDs. Messen Sie die Zellkörperfläche, indem Sie die nicht-zellulären Pixel in den SRS-Bildern bei 2.854 ^cm-1 auf Null setzen. Messen Sie den LD-Bereich und die Intensität, indem Sie die Nicht-LD-Pixel in den SRS-Bildern mit einem Schwellenwert versehen und auf Null setzen.
   HINWEIS: Weitere Details zur SRS-Bildverarbeitung wurden bereits¹⁶ gemeldet.

Ergebnisse

Wir haben das flexible Kammersystem für die Zeitraffer-SRS-Bildgebung hergestellt und montiert (Abbildung 1 und Abbildung 2) und dann die Leistung des Systems bewertet. Die Temperatur im Inneren des Mikroskopgehäuses erreichte innerhalb von 1 h die erwarteten 37 °C, was die Raumtemperatur nicht wesentlich beeinflusste (Abbildung 3A). Die Temperatur in der flexiblen Kammer erreichte in 1,5 h 37 °C und wurde mindestens 24 h lang s...

Diskussion

Die Zeitraffer-Lebendzell-SRS-Mikroskopie ist ein alternatives bildgebendes Verfahren zur markierungsfreien Molekülverfolgung. Im Vergleich zur Fluoreszenzmarkierung ist die SRS-Bildgebung frei von Photobleichung, was eine Langzeitüberwachung von Molekülen ermöglicht. Bisher ist das Lebendzell-Bildgebungssystem auf einer aufrechten SRS-Mikroskopie jedoch nicht kommerziell erhältlich. In dieser Arbeit wurde ein Lebendzell-Bildgebungssystem mit einer stabilen, thermisch isolierten Mikroskopgehäusebox und einer flexib...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A lab-built SRS microscope			https://rdcu.be/cP6ve
HF2LI 50 MHz lock-in amplifer	Zurich Instruments	HF2LI
Iris diaphragm	Thorlabs Inc	SM1D12
Kinematic mirror mount	Thorlabs Inc	KM100
Microscope frame	Nikon Inc	FN-1
Motorized microscopy stage	Prior Scientific	Z-Deck
Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)	Nikon Inc	MBL71405
Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300)	Nikon Inc	MRD77225
Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H)
Airtherm heater module	World Precision Instruments (WPI)	AIRTHERM-SAT-1W
Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor	World Precision Instruments (WPI)	AIRTHERM-SMT-1W
Air/CO2 mixer module	World Precision Instruments (WPI)	ECU-HOC-W
Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD)	McMaster-Carr	56675K71
High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness)	McMaster-Carr	8489K62
Polycarbonate sheets (thickness 0.25'')	McMaster-Carr	8574K286
Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'')	McMaster-Carr	5827T43
Materials and parts for the Flexible chamber
Hot plate	McMaster-Carr	31745K11
High-purity inline filter, 1/4 NPT	McMaster-Carr	6645T18
Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch)	McMaster-Carr	4066A34
Hole saw (cutting diameter 50 mm)	McMaster-Carr	4556A19
High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD	McMaster-Carr	5054K313
Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)	McMaster-Carr	98385K843
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD)	McMaster-Carr	9056K42
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD)	McMaster-Carr	9056K47
Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'')	McMaster-Carr	8975K142
Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'')	McMaster-Carr	9246K21
Objective nosepiece (single)	Nikon Inc	FN-MN-H
Sample holder (modified)	Prior Scientific	HZ202
Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'')	McMaster-Carr	8611K13
Vacuum-sealable glass jar	McMaster-Carr	3231T44
Software
MATLAB	MathWorks
ImageJ (Fiji)		imagej.net
ScanImage	Vidrio Technologies, LLC		SRS imaging software
Materials for live-cell imaging
Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm)	Electron Microscopy Sciences (EMS)	70674-02
DMEM cell culture medium	ThermoFisher Scientific	11965092
Fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	26140079
LysoSensor fluorescent dye DND-189	ThermoFisher Scientific	L7535 (Invitrogen)
Oleic acid	MilliporeSigma	364525
SKOV3 cell line	ATCC	HTB-77