Uma câmara flexível para imagens de células vivas com lapso de tempo com microscopia de espalhamento Raman estimulada

Resumo

Relatamos uma câmara ambiental flexível e de estágio para obtenção de imagens de lapso de tempo de células vivas usando microscopia de espalhamento Raman estimulada vertical com detecção de sinal transmitido. As gotículas lipídicas foram fotografadas em células SKOV3 tratadas com ácido oleico por até 24 h com um intervalo de tempo de 3 min.

Resumo

A microscopia de espalhamento Raman estimulado (SRS) é uma tecnologia de imagem química livre de marcação. A imagem de células vivas com SRS tem sido demonstrada para muitas aplicações biológicas e biomédicas. No entanto, a imagem de longo prazo com SRS de lapso de tempo de células vivas não tem sido amplamente adotada. A microscopia SRS geralmente usa uma objetiva de imersão em água de alta abertura numérica (NA) e um condensador de imersão em óleo de alto NA para obter imagens de alta resolução. Neste caso, o espaço entre a objetiva e o condensador é de apenas alguns milímetros. Portanto, a maioria das câmaras ambientais comerciais de topo de palco não pode ser usada para imagens SRS devido à sua grande espessura com uma cobertura de vidro rígida. Este artigo descreve o projeto e a fabricação de uma câmara flexível que pode ser usada para imagens de células vivas com lapso de tempo com detecção de sinal SRS transmitido em um quadro de microscópio vertical. A flexibilidade da câmara é alcançada usando um material macio - uma fina película de borracha natural. O novo design do gabinete e da câmara pode ser facilmente adicionado a uma configuração de imagem SRS existente. Os testes e os resultados preliminares demonstram que o sistema de câmara flexível permite imagens SRS estáveis, de longo prazo e com lapso de tempo de células vivas, que podem ser usadas para várias aplicações de bioimagem no futuro.

Introdução

A microscopia óptica é utilizada para observar as microestruturas das amostras. A imagem óptica é rápida, menos invasiva e menos destrutiva do que outras tecnologias¹. A imagem de células vivas com microscopia óptica é desenvolvida para capturar a dinâmica de células vivas cultivadas por um longo período². Diferentes tipos de contrastes ópticos fornecem informações distintas sobre amostras biológicas. Por exemplo, a microscopia óptica de fase mostra a diferença sutil nos índices de refração ao longo da amostra³. A microscopia de fluorescência é amplamente utilizada para obter imagens de biomoléculas específicas ou organelas celulares. No entanto, os espectros de excitação e emissão de fluorescência geralmente resultam em sobreposição espectral quando imagens multicoloridas são realizadas⁴. As moléculas fluorescentes são sensíveis à luz e podem ser branqueadas após exposição periódica à luz a longo prazo. Além disso, a marcação por fluorescência pode alterar a biodistribuição das moléculas nas células⁵. A microscopia SRS é uma tecnologia de imagem química livre de^marcação6. O contraste do SRS depende da transição vibracional de ligações químicas específicas. A frequência vibracional de uma ligação química frequentemente exibe uma largura de banda espectral estreita, tornando viável a obtenção de imagens de múltiplas bandas Raman nas mesmas amostras⁷. A microscopia SRS é uma ferramenta única para imagens de células vivas, fornecendo múltiplos contrastes químicos de forma livre de^marcação8.

Embora a imagem SRS de células não coradas tenha sido usada para muitos estudos, a imagem SRS de longo prazo com lapso de tempo de células vivas não foi amplamente adotada. Uma razão é que as câmaras abertas comerciais não podem ser usadas diretamente para imagens SRS devido à sua grande espessura 9,10,11,12. Essas câmaras com tampa de vidro são projetadas principalmente para imagens de campo brilhante ou fluorescência usando uma única objetiva de NA alta com um esquema de detecção para trás. No entanto, a imagem SRS prefere a detecção transmitida usando uma objetiva de NA alta e um condensador de NA alto, o que deixa apenas um intervalo muito curto (normalmente alguns milímetros) entre a objetiva e o condensador. Para superar esse problema, projetamos uma câmara flexível usando um material macio para permitir imagens SRS de lapso de tempo de células vivas usando uma estrutura de microscópio vertical. Neste projeto, a objetiva de imersão de água foi fechada na câmara mole e pode mover-se livremente em três dimensões para fins de focalização e imagem.

A temperatura ideal para o cultivo da maioria das células de mamíferos é de 37 °C, enquanto a temperatura ambiente é sempre 10 ° inferior a esta. Temperaturas superiores ou inferiores a 37 °C têm um efeito dramático na taxa de crescimento celular¹³. Portanto, o controle da temperatura do ambiente de cultura celular é necessário em um sistema de imagem de células vivas. Sabe-se que a instabilidade da temperatura levará a problemas de desfocalização durante exames de imagem de longo prazo¹⁴. Para alcançar um ambiente estável de 37 °C, construímos uma grande câmara de fechamento para cobrir toda a estrutura do microscópio, incluindo uma camada de isolamento térmico sob o microscópio (Figura 1). Dentro da considerável câmara de controle de temperatura, a pequena câmara flexível ajuda a manter com precisão a umidade fisiológica e o pH através do fluxo de ar regulado suplementado com 5% de CO 2 (Figura 2). A temperatura e a umidade das câmaras foram medidas para confirmar que o desenho de câmara dupla forneceu a condição ideal de cultura celular para o crescimento celular sob imagens SRS periódicas de longo prazo (Figura 3). Em seguida, demonstramos a aplicação do sistema para obtenção de imagens por lapso de tempo e rastreamento de gotículas lipídicas (DLs) em células cancerosas SKOV3 (Figura 4, Figura 5 e Figura 6).

Protocolo

1. Construa o gabinete ambiental do microscópio

NOTA: Este grande gabinete ambiental do microscópio é usado para controlar a temperatura do corpo do microscópio e o ambiente de imagem a ser estabilizado em 37 °C (Figura 1A).

1. Marque a localização dos pés do quadro do microscópio SRS e do estágio motorizado usando uma caneta marcadora na mesa óptica. Monte dois Diafragmas de Íris na frente do scanner Galvanômetro do microscópio e ajuste para fazer a bomba e os feixes de laser de Stokes passarem pelo centro dos Diafragmas de Íris.
2. Remova a estrutura do microscópio e o estágio da mesa óptica.
3. Coloque a folha de borracha de silicone (tamanho: 31 x 29 polegadas, espessura: 1/8 polegada) sobre a mesa óptica (Figura 1B).
4. Corte a borracha de silicone ao longo das marcas usando uma faca, remova pequenos pedaços de borracha e coloque as folhas de cerâmica MICA quadradas (tamanho: 6 x 6 polegadas, espessura: 1/4 polegada) nos mesmos locais.
   NOTA: A cerâmica MICA é um material fácil de usinar¹⁵. É tão duro quanto o alumínio, mas é um excelente isolante térmico. Chapas cerâmicas MICA foram usadas para interromper a transferência de calor da estrutura e do estágio do microscópio metálico para a mesa óptica de aço inoxidável. Alguns furos devem ser perfurados nas folhas MICA para permitir o uso de parafusos 1/4-20 para montar os pés do quadro e do palco.
5. Mova a estrutura do microscópio e o palco de volta para a mesa óptica e alinhe cuidadosamente os pés nas folhas de cerâmica MICA ao longo das linhas do marcador. Use 1/4-20 parafusos para montar o quadro e o palco na mesa.
6. Realinhe o caminho óptico SRS. Ajuste os suportes de espelho do Espelho 1 e do Espelho 2 para fazer o feixe de laser passar pelo centro dos dois Diafragmas de Íris pré-montados (Figura 2).
   NOTA: Detalhes técnicos do microscópio SRS construído em laboratório usado para o trabalho atual de imagem de células vivas são descritos anteriormente¹⁶. A largura de pulso da bomba e dos feixes de Stokes são ~3-4 ps com dispersão de haste de vidro. O sistema é controlado usando o software ScanImage¹⁷ .
7. Em cima desta fundação de isolamento térmico, monte o gabinete ambiental para cobrir toda a estrutura do microscópio usando cinco peças de grandes folhas de policarbonato (tamanho: 31 x 29 x 28 polegadas, espessura: 0,25 polegadas).
   NOTA: O tamanho da caixa do compartimento é determinado com base nas dimensões da estrutura do microscópio e do estágio. O painel frontal da caixa do gabinete do microscópio precisará ser removido temporariamente para instalar a câmara flexível e carregar a placa de cultura celular.
   1. Para montar o gabinete, realize um trabalho de usinagem simples, incluindo corte, perfuração e rosqueamento de furos de parafuso em cada borda das chapas de policarbonato. Corte dois furos grandes com um diâmetro de 2,6 polegadas na direita e nas folhas esquerdas do gabinete para encaixar a tubulação de entrada e saída, respectivamente. Corte um pequeno orifício com um diâmetro de 5 mm na folha traseira para permitir que os feixes de laser entrem no compartimento.
8. Sele as bordas e interfaces da caixa usando fita de alumínio.
9. Conecte a mangueira flexível do duto às portas de entrada e saída da caixa do compartimento para permitir o fluxo de ar quente circulado bombeado e controlado pelo módulo aquecedor. Coloque o sensor térmico do módulo aquecedor na câmara flexível onde as células são cultivadas e fotografadas. Defina a temperatura alvo em 37 °C.
   NOTA: Um difusor pode ser usado para obter uma distribuição de fluxo de ar mais uniforme no recinto ambiental.

2. Montar a câmara flexível

1. Monte a peça cilíndrica oca usinada de alumínio 1 (material: alumínio 6061) no nariz da objetiva usando três parafusos ajustados (Figura 2).
2. Monte a peça cilíndrica oca usinada de alumínio 2 no porta-amostras usando quatro parafusos 1/4-20 (Figura 2).
   NOTA: O porta-amostras deve ser modificado de modo a conter a placa de cultura celular com fundo de vidro com tampa de 50 mm. Faça um furo no centro do porta-amostras usando uma serra de furo de 1-7/8 polegadas. Contrafure o furo usando uma serra de furo de 50 mm e mantenha a profundidade do furo de passagem ~1 mm.
3. Encaixe o suporte da amostra com a peça de alumínio 2 no palco motorizado e monte-o usando parafusos.
4. Coloque a manga de filme de borracha natural (espessura: 0,01 polegada; colada com adesivo de cianoacrilato) entre as duas peças de alumínio usinadas e monte-a usando elásticos em cada extremidade.
5. Conecte o cilindro de CO₂ comprimido ao módulo misturador de gás usando tubulação e conectores adequados. Ajuste a pressão de entrada do CO₂ em 20-25 psi. Use um sensor CO 2 integrado e um controlador para garantir que o módulo misturador de ar possa regular e misturar 5% de CO₂ no fluxo de ar. Use filtros em linha para limpar o fluxo de ar.
6. Usando tubos e conectores adequados, guie o ar misturado (com 5% de CO₂) até a garrafa de água pré-esterilizada colocada na placa quente e, em seguida, guie o ar umidificado até a câmara flexível. Ajuste a placa quente a 37 °C. Borbulhe o fluxo de ar na água morna para aumentar a umidade do fluxo de ar.

3. Preparação para experimentos de imagem SRS de células vivas com lapso de tempo

1. Limpe todas as partes da câmara flexível com etanol 70%, incluindo o nariz, a objetiva de imersão de água e o porta-amostras.
2. Descontaminar todo o sistema de compartimento usando uma lâmpada UV colocada no compartimento por 20 a 30 min.
   NOTA: Não fique na sala do laboratório durante o processo de desinfecção UV por segurança.
3. Cultura de células SKOV3 em uma placa de Petri com fundo de vidro de 50 mm por 12 h em condições fisiológicas normais em uma incubadora regular.
   NOTA: Inicie a cultura de células SKOV3¹⁸ em um gabinete de biossegurança padrão.
4. Desconecte a peça de alumínio usinada 2 do suporte da amostra removendo os parafusos.
   NOTA: Esta é a maneira de abrir a câmara flexível para carregar a placa de cultura celular.
5. Carregue a placa de cultura celular. Lembre-se de adicionar óleo de imersão na parte superior do condensador antes de colocar a placa de cultura celular. Retire a tampa do prato e imobilize o prato usando os grampos.
   OBS: Para evitar contaminação, todas as operações devem ser realizadas com luvas.
6. Abaixe a objetiva no meio de cultura celular para focalização grosseira. Abaixe a peça de alumínio 2 para fechar a câmara flexível e monte-a no suporte da amostra usando parafusos.
   NOTA: Uma almofada de borracha de silicone de 2 mm é fixada na parte inferior da peça de alumínio 2 para selar bem a folga.
7. Ajuste a fonte de ar com 5% de CO 2 e 19% de O₂ para cultura de células normais com uma taxa de fluxo de ar de 200 cc/min.
   NOTA: Pode ser utilizada uma caudal de ar mais baixa. Depende de quão bem a câmara flexível é selada.

4. Conduzir experimentos de imagem SRS de células vivas com lapso de tempo

1. Ajuste o comprimento de onda do laser para 805 nm para atingir o deslocamento Raman de 2854 ^cm-1 , que é atribuído à vibração das ligações químicas CH₂ . Use baixa potência do laser para reduzir o fotodano às células. Para seguir este protocolo, use ~15 mW de potência média do laser da bomba e ~7,5 mW do laser de Stokes (fixado em 1.045 nm) para imagens de células vivas de longo prazo.
   NOTA: Maior potência do laser produzirá melhor qualidade de imagem SRS. No entanto, uma potência laser muito alta induzirá fotodanos às células vivas. Há uma compensação entre qualidade de imagem e fotodanos.
2. Ajuste e foque o objetivo de obter uma boa imagem SRS das células usando o botão FOCUS no painel PRINCIPAIS CONTROLES do software. Para executar o foco rápido, defina o número de pixels como 512 × 512 pixels com um tempo de permanência de pixels de 4,8 μs no painel CONFIGURAÇÃO.
3. Defina a faixa de entrada do amplificador de bloqueio (normalmente 5 mV) para ser o dobro da tensão máxima do sinal. Defina o filtro passa-baixa para ser o mesmo que o tempo de permanência do pixel (4,8 μs).
   NOTA: Diferentes sistemas SRS criados em laboratório podem usar configurações de aquisição de dados diferentes.
4. Depois de alcançar um bom foco, defina a resolução de imagem para 2.048 × 2.048 pixels para um campo de visão de 175 μm² para a aquisição de imagens de alta qualidade. Verifique a função SAVE no painel MAIN CONTROLS e verifique o canal SRS no painel CHANNELS . Defina o tempo de intervalo entre dois quadros como 180 s (3 min) no canal MAIN CONTROLS. Defina o número de aquisição como 480 para imagens de lapso de tempo ao longo de 24 horas.
   NOTA: Uma resolução de imagem mais baixa pode ser usada com base no objetivo dos experimentos.
5. Inicie a aquisição automatizada de imagens usando a função LOOP no painel CONTROLES PRINCIPAIS .
   NOTA: Verifique se há desvio focal devido à instabilidade de temperatura na primeira hora de imagem. As imagens de primeira hora podem não ser estáveis. Verifique o foco a cada 2-3 h durante a sessão de imagem de lapso de tempo.
6. Processe as imagens coletadas usando o ImageJ¹⁹. Use os dois métodos a seguir para quantificação de DL: (i) a razão LD/área corporal da célula e (ii) a intensidade média do SRS do total de DLs. Meça a área do corpo celular limitando e zerando os pixels não celulares nas imagens SRS em 2.854 ^cm-1. Meça a área e a intensidade do LD limitando e zerando os pixels não-LD nas imagens SRS.
   NOTA: Mais detalhes sobre o processamento de imagens SRS foram relatados anteriormente¹⁶.

Resultados

Fabricamos e montamos o sistema de câmara flexível para obtenção de imagens SRS com lapso de tempo (Figura 1 e Figura 2) e, em seguida, avaliamos o desempenho do sistema. A temperatura no interior do compartimento ambiente do microscópio atingiu os 37 °C esperados em 1 h, o que não afetou significativamente a temperatura ambiente (Figura 3A). A temperatura na câmara flexível atingiu 37 °C em 1,5 h, mantendo-se estável a 3...

Discussão

A microscopia SRS de células vivas com lapso de tempo é uma técnica alternativa de imagem para rastreamento de moléculas de maneira livre de marcação. Em comparação com a marcação por fluorescência, a imagem SRS é livre de fotoclareamento, permitindo o monitoramento de moléculas a longo prazo. No entanto, até o momento, o sistema de imagem de células vivas em uma microscopia SRS vertical não está disponível comercialmente. Neste trabalho, um sistema de imagem de células vivas com uma caixa de gabinete ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
A lab-built SRS microscope			https://rdcu.be/cP6ve
HF2LI 50 MHz lock-in amplifer	Zurich Instruments	HF2LI
Iris diaphragm	Thorlabs Inc	SM1D12
Kinematic mirror mount	Thorlabs Inc	KM100
Microscope frame	Nikon Inc	FN-1
Motorized microscopy stage	Prior Scientific	Z-Deck
Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)	Nikon Inc	MBL71405
Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300)	Nikon Inc	MRD77225
Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H)
Airtherm heater module	World Precision Instruments (WPI)	AIRTHERM-SAT-1W
Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor	World Precision Instruments (WPI)	AIRTHERM-SMT-1W
Air/CO2 mixer module	World Precision Instruments (WPI)	ECU-HOC-W
Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD)	McMaster-Carr	56675K71
High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness)	McMaster-Carr	8489K62
Polycarbonate sheets (thickness 0.25'')	McMaster-Carr	8574K286
Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'')	McMaster-Carr	5827T43
Materials and parts for the Flexible chamber
Hot plate	McMaster-Carr	31745K11
High-purity inline filter, 1/4 NPT	McMaster-Carr	6645T18
Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch)	McMaster-Carr	4066A34
Hole saw (cutting diameter 50 mm)	McMaster-Carr	4556A19
High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD	McMaster-Carr	5054K313
Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)	McMaster-Carr	98385K843
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD)	McMaster-Carr	9056K42
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD)	McMaster-Carr	9056K47
Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'')	McMaster-Carr	8975K142
Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'')	McMaster-Carr	9246K21
Objective nosepiece (single)	Nikon Inc	FN-MN-H
Sample holder (modified)	Prior Scientific	HZ202
Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'')	McMaster-Carr	8611K13
Vacuum-sealable glass jar	McMaster-Carr	3231T44
Software
MATLAB	MathWorks
ImageJ (Fiji)		imagej.net
ScanImage	Vidrio Technologies, LLC		SRS imaging software
Materials for live-cell imaging
Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm)	Electron Microscopy Sciences (EMS)	70674-02
DMEM cell culture medium	ThermoFisher Scientific	11965092
Fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	26140079
LysoSensor fluorescent dye DND-189	ThermoFisher Scientific	L7535 (Invitrogen)
Oleic acid	MilliporeSigma	364525
SKOV3 cell line	ATCC	HTB-77