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要約

我々は、送信シグナル検出を備えた直立刺激ラマン散乱顕微鏡を用いた生細胞のタイムラプスイメージングのためのステージトップの柔軟な環境チャンバーについて報告する。脂肪滴は、オレイン酸で処理したSKOV3細胞で最大24時間、3分の時間間隔で画像化されました。

要約

誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、ラベルフリーの化学イメージング技術です。SRSを用いた生細胞イメージングは、多くの生物学的および生物医学的用途で実証されています。しかし、生細胞の長期タイムラプスSRSイメージングは広く採用されていません。SRS顕微鏡では、高解像度のイメージングを実現するために、高開口数(NA)水浸対物レンズと高NA油浸コンデンサーを使用することがよくあります。この場合、対物レンズとコンデンサーの間のギャップはわずか数ミリメートルです。したがって、ほとんどの市販のステージトップ環境チャンバーは、剛性のあるガラスカバーで厚さが大きいため、SRSイメージングには使用できません。この論文では、正立顕微鏡フレーム上で送信されたSRS信号検出を備えたタイムラプスライブセルイメージングに使用できる柔軟なチャンバーの設計と製造について説明します。チャンバーの柔軟性は、柔らかい素材(薄い天然ゴムフィルム)を使用することで実現されます。新しいエンクロージャとチャンバーの設計は、既存のSRSイメージングセットアップに簡単に追加できます。試験と予備的な結果は、フレキシブルチャンバーシステムにより、生細胞の安定した長期タイムラプスSRSイメージングを可能にし、将来のさまざまなバイオイメージングアプリケーションに使用できることを示しています。

概要

光学顕微鏡は、サンプルの微細構造を観察するために使用されます。光学イメージングは、他の技術よりも迅速で、侵襲性が低く、破壊的ではありません1。光学顕微鏡による生細胞イメージングは、培養生細胞の動態を長期間にわたって捉えるために開発されています2。異なるタイプの光学コントラストは、生物学的サンプルに関する異なる情報を提供します。例えば、光学位相顕微鏡は、試料3全体の屈折率の微妙な違いを示す。蛍光顕微鏡は、特定の生体分子や細胞小器官の画像化に広く使用されています。しかしながら、蛍光の広帯域励起スペクトルおよび発光スペクトルは、通常、多色イメージングが行われるときにスペクトルオーバーラップをもたらす4。蛍光分子は光に敏感であり、長期間の定期的な光曝露後に漂白することができます。さらに、蛍光標識は、細胞5における分子の生体分布を変化させ得る。SRS顕微鏡は、ラベルフリーの化学イメージング技術です6。SRSのコントラストは、特定の化学結合の振動遷移に依存しています。化学結合の振動周波数は狭いスペクトル帯域幅を示すことが多く、同じサンプル内の複数のラマンバンドを画像化することが可能になります7。SRS顕微鏡は、生細胞イメージングのためのユニークなツールであり、ラベルフリーの方法で複数の化学的コントラストを提供します8。

染色されていない細胞のSRSイメージングは多くの研究に使用されていますが、生細胞の長期タイムラプスSRSイメージングは広く採用されていません。その理由の1つは、市販のオープンチャンバーは厚さ9,10,11,12が大きいため、SRSイメージングに直接使用できないことです。ガラス蓋付きのこれらのチャンバーは、主に、後方検出スキームを備えた単一の高NA対物レンズを使用した明視野または蛍光イメージング用に設計されています。ただし、SRSイメージングでは、高NA対物レンズと高NAコンデンサーの両方を使用した透過検出が好まれるため、対物レンズとコンデンサーの間に非常に短いギャップ(通常は数ミリメートル)しか残されません。この問題を克服するために、我々は、正立顕微鏡フレームを使用して生細胞のタイムラプスSRSイメージングを可能にするために、柔らかい材料を使用して柔軟なチャンバーを設計しました。この設計では、水浸対物レンズはソフトチャンバーに封入されており、焦点合わせとイメージングの目的で3次元で自由に移動できます。

ほとんどの哺乳類細胞を培養するのに最適な温度は37°Cですが、室温は常にこれより10°C低くなっています。37°Cより高いまたは低い温度は、細胞増殖速度に劇的な影響を及ぼします13。そのため、生細胞イメージングシステムにおいては細胞培養環境の温度制御が求められている。温度の不安定性は、長期イメージング中に焦点ぼけの問題につながることが知られています14。37°Cの安定した環境を実現するため、顕微鏡下の断熱層を含む顕微鏡フレーム全体を覆う大型の筐体チャンバーを構築しました(図1)。大きな温度制御チャンバー内では、小さな柔軟なチャンバーは、5%CO2を補充した調整された空気の流れを介して生理学的湿度とpHを正確に維持するのに役立ちます(図2)。チャンバーの温度と湿度を測定し、ダブルチャンバー設計が長期の定期的なSRSイメージング下での細胞増殖に最適な細胞培養条件を提供することを確認しました(図3)。次に、SKOV3がん細胞のタイムラプスイメージングと脂肪滴(LD)の追跡へのシステムの応用を実証しました(図4、図5、および図6)。

プロトコル

1.顕微鏡環境エンクロージャを構築する

注:この大型顕微鏡環境エンクロージャは、顕微鏡本体の温度とイメージング環境を37°Cで安定させるために使用されます(図1A)。

  1. SRS顕微鏡フレームの足の位置と電動ステージの位置を、光学テーブルのマーカーペンでマークします。顕微鏡のガルバノスキャナーの前に2つのアイリスダイアフラムを取り付け、ポンプとストークスのレーザービームがアイリスダイアフラムの中心を通過するように調整します。
  2. 顕微鏡フレームとステージを光学テーブルから取り外します。
  3. シリコーンゴムシート(サイズ:31 x 29インチ、厚さ:1/8インチ)を光学テーブルに置きます(図1B)。
  4. ナイフを使用してマークに沿ってシリコーンゴムを切断し、小さなゴム片を取り除き、正方形のMICAセラミックシート(サイズ:6 x 6インチ、厚さ:1/4インチ)を同じ場所に配置します。
    注:MICAセラミックは機械加工が容易な材料です15。アルミニウムと同じくらい硬いですが、優れた断熱材です。MICAセラミックシートを使用して、金属顕微鏡フレームとステージからステンレス鋼の光学テーブルへの熱伝達を停止しました。フレームとステージの脚を取り付けるために1 / 4-20ネジを使用できるように、MICAシートにいくつかの貫通穴を開ける必要があります。
  5. 顕微鏡フレームとステージを光学テーブルに戻し、マーカーラインに沿って脚をMICAセラミックシートに慎重に合わせます。1 / 4-20ネジを使用して、フレームとステージをテーブルに取り付けます。
  6. SRS 光路を再調整します。ミラー1とミラー2のミラーマウントを調整して、レーザービームが2つの事前に取り付けられたアイリスダイアフラムの中央を通過するようにします(図2)。
    注:現在の生細胞イメージング作業に使用されているラボ製のSRS顕微鏡の技術的な詳細は、前述の16に記載されています。ポンプとストークスビームのパルス幅は、ガラスロッド分散で~3-4psです。システムは、ScanImage17 ソフトウェアを使用して制御されます。
  7. この断熱基礎の上に、5枚の大きなポリカーボネートシート(サイズ:31 x 29 x 28インチ、厚さ:0.25インチ)を使用して、顕微鏡フレーム全体を覆うように環境エンクロージャを組み立てます。
    注意: エンクロージャボックスのサイズは、顕微鏡フレームとステージの寸法に基づいて決定されます。顕微鏡エンクロージャボックスのフロントパネルは、フレキシブルチャンバーを設置し、細胞培養皿をロードするために一時的に取り外す必要があります。
    1. エンクロージャーを組み立てるには、ポリカーボネートシートの両端にねじ穴を開ける、穴あけ、タッピングなどの簡単な機械加工作業を実行します。エンクロージャーの右側と左側のシートに直径2.6インチの2つの大きな穴を開けて、それぞれ入口チューブと出口チューブに合います。背面シートに直径5 mmの小さな穴を開けて、レーザービームがエンクロージャーに入るようにします。
  8. アルミホイルテープを使用してボックスの端とインターフェースをシールします。
  9. フレキシブルダクトホースをエンクロージャボックスの入口ポートと出口ポートに接続して、ヒーターモジュールによってポンプで送られて制御される温風の流れを循環させます。ヒーターモジュールの熱センサーを、細胞を培養して画像化するフレキシブルチャンバーに配置します。目標温度を37°Cに設定します。
    注意: ディフューザーを使用して、環境エンクロージャ内の気流分布をより均一にすることができます。

2.フレキシブルチャンバーを組み立てます

  1. 3本の止めネジを使用して、機械加工された中空の円筒形のアルミニウム片1(材質:アルミニウム6061)を対物レンズのノーズピースに取り付けます(図2)。
  2. 機械加工された中空の円筒形のアルミニウム片2を、4本の1 / 4-20ネジを使用してサンプルホルダーに取り付けます(図2)。
    注:サンプルホルダーは、50 mmのカバーガラス底細胞培養皿を保持するように変更する必要があります。1-7 / 8インチのホールソーを使用して、サンプルホルダーの中央に貫通穴を開けます。50mmのホールソーを使用して穴をぐるぐりし、貫通穴の深さを~1mmに保ちます。
  3. アルミニウム片2を備えたサンプルホルダーを電動ステージに取り付け、ネジを使用して取り付けます。
  4. 天然ゴムフィルムスリーブ(厚さ:0.01インチ、シアノアクリレート接着剤で接着)を2つの機械加工されたアルミニウム片の間に置き、両端に輪ゴムを使用して取り付けます。
  5. 適切なチューブとコネクタを使用して、圧縮されたCO2シリンダーをガスミキサーモジュールに接続します。CO2入力圧力を20〜25psiに設定します。内蔵のCO 2センサーとコントローラーを使用して、エアミキサーモジュールが5%のCO2を調整して気流に混合できるようにします。インライン フィルタを使用して、エアフローをクリーンアップします。
  6. 適切なチューブとコネクタを使用して、混合空気(5%CO2を含む)をホットプレートに置かれた滅菌済みウォーターボトルに導き、加湿された空気をフレキシブルチャンバーに導きます。ホットプレートを37°Cに設定します。 温水で気流を泡立てて、気流の湿度を上げます。

3. タイムラプス生細胞SRSイメージング実験の準備

  1. ノーズピース、水浸対物レンズ、サンプルホルダーなど、フレキシブルチャンバーのすべての部分を70%エタノールで拭きます。
  2. エンクロージャー内に20〜30分間配置したUVランプを使用して、エンクロージャシステム全体を除染します。
    注意: 安全のため、UV消毒プロセス中は実験室にとどまらないでください。
  3. SKOV3細胞を50mmガラス底シャーレに入れて、通常のインキュベーター内で通常の生理条件下で12時間培養します。
    注:SKOV3細胞培養18 は、標準のバイオセーフティキャビネットで開始します。
  4. ネジを外して、機械加工されたアルミニウム片2をサンプルホルダーから外します。
    注:これは、細胞培養皿をロードするために柔軟なチャンバーを開く方法です。
  5. 細胞培養皿をロードします。細胞培養皿を置く前に、コンデンサーの上部に浸漬油を追加することを忘れないでください。皿のカバーを取り外し、クランプを使用して皿を固定します。
    注意: 汚染を避けるために、すべての操作は手袋で実行する必要があります。
  6. 対物レンズを細胞培養培地に下げて、粗い焦点を合わせます。アルミニウム片2を下げてフレキシブルチャンバーを囲み、ネジを使用してサンプルホルダーに取り付けます。
    注意: 2 mmのシリコーンゴムクッションパッドがアルミニウム片2の底に取り付けられ、隙間をしっかりと密閉します。
  7. 通常の細胞培養用に5%CO2および19%O2の空気供給を200cc/minのエアフローレートで設定します。
    注意: より低い空気流量を使用できます。それは、フレキシブルチャンバーがどれだけうまく密閉されているかによって異なります。

4. タイムラプス生細胞SRSイメージング実験の実施

  1. レーザー波長を805 nmに調整して、CH2化学結合の振動に起因する2854 cm-1ラマンシフトをターゲットにします。低レーザー出力を使用して、細胞への光損傷を減らします。このプロトコルに従うには、ポンプレーザーの平均出力~15 mWとストークスレーザーの~7.5 mW(1,045 nmに固定)を使用して、長期の生細胞イメージングを行います。
    注意: レーザー出力が高いほど、SRSイメージング品質が向上します。ただし、レーザー出力が高すぎると、生細胞に光損傷が誘発されます。画質とフォトダメージの間にはトレードオフがあります。
  2. 対物レンズを調整して焦点を合わせ、ソフトウェアのメインコントロールパネルにあるFOCUSボタンを使用して、細胞の良好なSRSイメージングを実現します。高速フォーカスを実行するには、CONFIGURATIONパネルでピクセル数を512ピクセル×512ピクセルに設定し、ピクセル滞留時間を4.8μsに設定します。
  3. ロックイン・アンプの入力範囲(通常5mV)を最大信号電圧の2倍に設定します。ローパスフィルタをピクセル滞留時間(4.8μs)と同じに設定します。
    注意: ラボで構築されたSRSシステムが異なれば、使用するデータ取得設定も異なる場合があります。
  4. 良好なピント合わせを実現した後、175μm2の視野に対して2,048×2,048ピクセルの画像解像度に設定して、高品質の画像を取得します。メインコントロールパネルのSAVE機能を確認し、チャンネルパネルのSRSチャンネルを確認します。 メインコントロールチャンネルで2つのフレーム間の間隔時間を180秒(3分)に設定します。取得番号を480に設定して、24時間以上のタイムラプスイメージングを行います。
    注:実験の目的に基づいて、より低い画像解像度を使用できます。
  5. メインコントロールパネルのLOOP機能を使用して自動画像取得を開始します。
    注意: イメージングの最初の1時間に温度の不安定性による焦点ドリフトがあるかどうかを確認してください。最初の1時間のイメージングは安定していない可能性があります。タイムラプスイメージングセッション中は、2〜3時間ごとにフォーカスを確認してください。
  6. 収集した画像をImageJ19で処理します。LDの定量化には、(i)LD /細胞体面積比、および(ii)総LDの平均SRS強度の2つの方法を使用します。 SRS画像の非細胞ピクセルを2,854 cm-1で閾値化およびゼロにすることにより、細胞本体面積を測定します。SRS画像の非LDピクセルをしきい値化およびゼロにして、LD面積と強度を測定します。
    注:SRS画像処理の詳細については、以前に報告されています16。

結果

タイムラプスSRSイメージング用のフレキシブルチャンバーシステムを作製して組み立て(図1 、 図2)、システムの性能を評価しました。顕微鏡環境エンクロージャ内の温度は1時間以内に予想される37°Cに達し、室温に大きな影響を与えませんでした(図3A)。フレキシブルチャンバー内の温度は1.5時間で37°Cに達し、少なくとも24?...

ディスカッション

タイムラプス生細胞SRS顕微鏡は、ラベルフリーの方法で分子追跡を行うための代替イメージング技術です。蛍光標識と比較して、SRSイメージングは光退色がなく、分子の長期モニタリングが可能です。しかしながら、今日まで、正立SRS顕微鏡上の生細胞イメージングシステムは市販されていない。本研究では、安定した断熱顕微鏡エンクロージャボックスと柔軟な内部ソフトチャンバーを備?...

開示事項

著者は開示する利益相反を持っていません。

謝辞

ビンガムトン大学の2019年学部シニアデザインチーム(Suk Chul Yuon、Ian Foxton、Louis Mazza、James Walsh)に、顕微鏡エンクロージャーボックスの設計、製造、テストを行ったことに感謝します。有益な議論をしてくれたビンガムトン大学のスコット・ハンコック、オルガ・ペトロワ、ファビオラ・モレノ・オリバスに感謝します。この研究は、国立衛生研究所の支援を受けて、受賞番号R15GM140444で行われました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
A lab-built SRS microscopehttps://rdcu.be/cP6ve
HF2LI 50 MHz lock-in ampliferZurich InstrumentsHF2LI
Iris diaphragmThorlabs IncSM1D12
Kinematic mirror mountThorlabs IncKM100
Microscope frameNikon IncFN-1
Motorized microscopy stagePrior ScientificZ-Deck
Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)Nikon IncMBL71405
Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300)Nikon IncMRD77225
Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H)
Airtherm heater moduleWorld Precision Instruments (WPI)AIRTHERM-SAT-1W
Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitorWorld Precision Instruments (WPI)AIRTHERM-SMT-1W
Air/CO2 mixer moduleWorld Precision Instruments (WPI)ECU-HOC-W
Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD)McMaster-Carr56675K71
High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness)McMaster-Carr8489K62
Polycarbonate sheets (thickness 0.25'')McMaster-Carr8574K286
Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'')McMaster-Carr5827T43
Materials and parts for the Flexible chamber
Hot plateMcMaster-Carr31745K11
High-purity inline filter, 1/4 NPTMcMaster-Carr6645T18
Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch)McMaster-Carr4066A34
Hole saw (cutting diameter 50 mm)McMaster-Carr4556A19
High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm ODMcMaster-Carr5054K313
Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)McMaster-Carr98385K843
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD)McMaster-Carr9056K42
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD)McMaster-Carr9056K47
Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'')McMaster-Carr8975K142
Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'')McMaster-Carr9246K21
Objective nosepiece (single)Nikon IncFN-MN-H
Sample holder (modified)Prior ScientificHZ202
Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'')McMaster-Carr8611K13
Vacuum-sealable glass jarMcMaster-Carr3231T44
Software
MATLABMathWorks
ImageJ (Fiji)imagej.net
ScanImageVidrio Technologies, LLCSRS imaging software
Materials for live-cell imaging
Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm)Electron Microscopy Sciences (EMS)70674-02
DMEM cell culture mediumThermoFisher Scientific11965092
Fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher Scientific26140079
LysoSensor fluorescent dye DND-189ThermoFisher ScientificL7535 (Invitrogen)
Oleic acidMilliporeSigma364525
SKOV3 cell lineATCCHTB-77

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