JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы сообщаем о том, что в верхней части сцены используется гибкая экологическая камера для покадровой визуализации живых клеток с использованием вертикальной вынужденной микроскопии комбинационного рассеяния света с детектированием передаваемого сигнала. Липидные капли визуализировали в клетках SKOV3, обработанных олеиновой кислотой, в течение 24 ч с интервалом времени 3 мин.

Аннотация

Микроскопия с вынужденным комбинационным рассеянием света (SRS) представляет собой технологию химической визуализации без меток. Визуализация живых клеток с помощью SRS была продемонстрирована для многих биологических и биомедицинских применений. Тем не менее, долгосрочная покадровая SRS-визуализация живых клеток не получила широкого распространения. В микроскопии SRS часто используется объектив с высокой числовой апертурой (NA) и масляный конденсатор с высоким содержанием NA для получения изображений с высоким разрешением. В этом случае зазор между объективом и конденсатором составляет всего несколько миллиметров. Поэтому большинство коммерческих сценических экологических камер не могут быть использованы для визуализации SRS из-за их большой толщины с жесткой стеклянной крышкой. В этой статье описывается конструкция и изготовление гибкой камеры, которая может быть использована для покадровой визуализации живых клеток с детектированием передаваемого сигнала SRS на вертикальной рамке микроскопа. Гибкость камеры достигается за счет использования мягкого материала – тонкой пленки натурального каучука. Новая конструкция корпуса и камеры может быть легко добавлена к существующей установке визуализации SRS. Испытания и предварительные результаты показывают, что гибкая камерная система обеспечивает стабильную, долгосрочную, покадровую SRS-визуализацию живых клеток, которая может быть использована для различных приложений биовизуализации в будущем.

Введение

Оптическая микроскопия используется для наблюдения за микроструктурами образцов. Оптическая визуализация является быстрой, менее инвазивной и менее разрушительной, чем другие технологии1. Визуализация живых клеток с помощью оптической микроскопии разработана для захвата динамики культивируемых живых клеток в течение длительного периода2. Различные типы оптических контрастов предоставляют различную информацию о биологических образцах. Например, оптическая фазовая микроскопия показывает тонкую разницу в показателях преломления в образце3. Флуоресцентная микроскопия широко используется для визуализации конкретных биомолекул или клеточных органелл. Однако широкополосные спектры возбуждения и излучения флуоресценции обычно приводят к спектральному перекрытию при выполнении многоцветной визуализации4. Флуоресцентные молекулы светочувствительны и могут быть обесцвечены после длительного периодического воздействия света. Кроме того, флуоресцентная маркировка может изменить биораспределение молекул в клетках5. Микроскопия SRS - это технология химической визуализации без меток6. Контраст SRS основан на колебательном переходе определенных химических связей. Колебательная частота химической связи часто имеет узкую спектральную полосу пропускания, что позволяет получать изображения нескольких полос комбинационного рассеяния света в одних и тех же образцах7. Микроскопия SRS — это уникальный инструмент для визуализации живых клеток, обеспечивающий множественные химические контрасты без меток8.

В то время как SRS-визуализация неокрашенных клеток использовалась для многих исследований, долгосрочная покадровая SRS-визуализация живых клеток не получила широкого распространения. Одна из причин заключается в том, что коммерческие открытые камеры не могут быть непосредственно использованы для визуализации SRS из-за их большой толщины 9,10,11,12. Эти камеры со стеклянной крышкой в основном предназначены для визуализации светлого поля или флуоресценции с использованием одного объектива с высоким уровнем NA со схемой обратного обнаружения. Тем не менее, SRS-визуализация предпочитает передаваемое обнаружение с использованием как объектива с высоким NA, так и конденсатора с высоким NA, что оставляет только очень короткий зазор (обычно несколько миллиметров) между объективом и конденсатором. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали гибкую камеру с использованием мягкого материала, чтобы обеспечить покадровую SRS-визуализацию живых клеток с использованием вертикальной рамки микроскопа. В этой конструкции объектив для погружения в воду был заключен в мягкую камеру и может свободно перемещаться в трех измерениях для фокусировки и визуализации.

Оптимальная температура для культивирования большинства клеток млекопитающих составляет 37 ° C, в то время как температура в помещении всегда на 10 ° ниже. Температура выше или ниже 37 °C оказывает существенное влияние на скорость роста клеток13. Поэтому в системе визуализации живых клеток требуется контроль температуры среды клеточных культур. Известно, что температурная нестабильность приведет к проблемам с расфокусировкой при длительной визуализации14. Для достижения стабильной температуры 37 °C мы построили большую камеру корпуса, которая покрывает всю раму микроскопа, включая теплоизоляционный слой под микроскопом (рис. 1). В большой камере контроля температуры небольшая гибкая камера помогает точно поддерживать физиологическую влажность и рН за счет регулируемого воздушного потока, дополненного 5% CO 2 (рис. 2). Температура и влажность камер были измерены, чтобы подтвердить, что двухкамерная конструкция обеспечивает оптимальные условия культивирования клеток для роста клеток при длительной периодической визуализации SRS (рис. 3). Затем мы продемонстрировали применение системы для покадровой визуализации и отслеживания липидных капель (LD) в раковых клетках SKOV3 (рис. 4, рис. 5 и рис. 6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Постройте экологический корпус микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот большой корпус микроскопа используется для контроля температуры корпуса микроскопа и среды визуализации, которая должна быть стабилизирована при 37 ° C (рис. 1A).

  1. Отметьте расположение ножек рамы микроскопа SRS и моторизованного столика с помощью маркера на оптическом столе. Установите две диафрагмы радужной оболочки перед сканером гальванометра микроскопа и отрегулируйте так, чтобы лазерные лучи накачки и Стокса проходили через центр диафрагмы радужной оболочки.
  2. Снимите рамку микроскопа и предметный столик с оптического стола.
  3. Положите лист силиконовой резины (размер: 31 x 29 дюймов, толщина: 1/8 дюйма) на оптический стол (рис. 1B).
  4. Разрежьте силиконовую резину вдоль следов с помощью ножа, удалите мелкие кусочки резины и поместите квадратные керамические листы MICA (размер: 6 x 6 дюймов, толщина: 1/4 дюйма) в те же места.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Керамика MICA - это легко обрабатываемый материал15. Он такой же твердый, как алюминий, но является отличным теплоизолятором. Керамические листы MICA использовались для остановки передачи тепла от металлической рамы микроскопа и столика к оптическому столу из нержавеющей стали. На листах MICA необходимо просверлить несколько сквозных отверстий, чтобы можно было использовать 1/4-20 винтов для крепления ножек рамы и сцены.
  5. Переместите рамку микроскопа и предметный столик обратно на оптический стол и аккуратно выровняйте ножки на керамических листах MICA вдоль линий маркера. Используйте 1/4-20 винтов, чтобы закрепить раму и сцену на столе.
  6. Выровняйте оптический тракт SRS. Отрегулируйте крепления зеркал зеркала 1 и зеркала 2 так, чтобы лазерный луч проходил через центр двух предварительно установленных диафрагм радужной оболочки глаза (рис. 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Технические детали лабораторного микроскопа SRS, используемого для текущей работы по визуализации живых клеток, описаны ранее16. Ширина импульса насоса и пучков Стокса составляет ~3-4 пс с дисперсией стеклянных стержней. Управление системой осуществляется с помощью программного обеспечения ScanImage17 .
  7. Поверх этого теплоизоляционного фундамента соберите экологический корпус, чтобы покрыть всю раму микроскопа, используя пять кусков больших поликарбонатных листов (размер: 31 x 29 x 28 дюймов, толщина: 0,25 дюйма).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер корпусной коробки определяется в зависимости от размеров рамы микроскопа и предметного столика. Переднюю панель корпуса микроскопа необходимо временно снять, чтобы установить гибкую камеру и загрузить чашку для клеточных культур.
    1. Чтобы собрать корпус, выполните простые механические работы, включая резку, сверление и нарезание отверстий для винтов на каждом краю листов поликарбоната. Вырежьте два больших отверстия диаметром 2.6 дюйма на правом и левом листах корпуса, чтобы они соответствовали впускной и выпускной трубкам соответственно. Вырежьте небольшое отверстие диаметром 5 мм на заднем листе, чтобы лазерные лучи могли проникать в корпус.
  8. Заклейте края и стыки коробки с помощью ленты из алюминиевой фольги.
  9. Подсоедините гибкий шланг воздуховода к впускному и выпускному отверстиям коробки корпуса, чтобы обеспечить циркуляцию теплого воздуха, перекачиваемого и контролируемого модулем нагревателя. Поместите термодатчик нагревательного модуля в гибкую камеру, где клетки культивируются и визуализируются. Установите целевую температуру на 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Диффузор можно использовать для более равномерного распределения воздушного потока в корпусе окружающей среды.

2. Соберите гибкую камеру

  1. Прикрепите обработанную полую цилиндрическую алюминиевую деталь 1 (материал: алюминий 6061) к носовой части объектива с помощью трех установочных винтов (рис. 2).
  2. Установите обработанную полую цилиндрическую алюминиевую деталь 2 на держатель образца с помощью четырех винтов 1/4-20 (рис. 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель образца должен быть модифицирован таким образом, чтобы он мог удерживать 50-миллиметровую чашку для культивирования клеток со стеклянным дном. Просверлите сквозное отверстие в центре держателя образца с помощью пилы с отверстиями 1-7/8 дюйма. Просверлите отверстие с помощью пилы с отверстиями 50 мм и сохраняйте глубину сквозного отверстия ~ 1 мм.
  3. Установите держатель образца с алюминиевой деталью 2 на моторизованный столик и установите его с помощью винтов.
  4. Поместите втулку из натуральной каучуковой пленки (толщина: 0,01 дюйма; склеена цианакрилатным клеем) между двумя обработанными алюминиевыми деталями и закрепите ее с помощью резиновых лент на каждом конце.
  5. Подсоедините баллон со сжатым CO2 к модулю газового смесителя, используя соответствующие трубки и соединители. Установите входное давление CO2 на уровне 20-25 фунтов на квадратный дюйм. Используйте встроенный датчик CO 2 и контроллер, чтобы модуль воздушного смесителя мог регулировать и смешивать 5% CO2 с воздушным потоком. Используйте встроенные фильтры для очистки воздушного потока.
  6. Используя соответствующие трубки и соединители, направьте смешанный воздух (с 5% CO2) в предварительно стерилизованную бутылку с водой, помещенную на конфорку, а затем направьте увлажненный воздух в гибкую камеру. Установите конфорку на 37 °C. Пузырьки воздушного потока в теплой воде, чтобы увеличить влажность воздушного потока.

3. Подготовка к экспериментам по покадровой визуализации SRS живых клеток

  1. Протрите все части гибкой камеры 70% этанолом, включая наконечник, объектив для погружения в воду и держатель образца.
  2. Обеззаразьте всю систему корпуса с помощью УФ-лампы, помещенной в корпус на 20-30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставайтесь в лабораторном помещении во время процесса УФ-дезинфекции в целях безопасности.
  3. Культивируют клетки SKOV3 в чашке Петри со стеклянным дном диаметром 50 мм в течение 12 ч при нормальных физиологических условиях в обычном инкубаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запустите культуру клеток SKOV318 в стандартном шкафу биобезопасности.
  4. Отсоедините обработанную алюминиевую деталь 2 от держателя образца, открутив винты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это способ открыть гибкую камеру для загрузки чашки для культивирования клеток.
  5. Загрузите чашку для культивирования клеток. Не забудьте добавить иммерсионное масло в верхнюю часть конденсатора перед установкой чашки для культивирования клеток. Снимите крышку посуды и обездвижьте посуду с помощью зажимов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание загрязнения все операции следует выполнять в перчатках.
  6. Опустите объектив в питательную среду для грубой фокусировки. Опустите алюминиевую деталь 2, чтобы закрыть гибкую камеру, и закрепите ее на держателе образца с помощью винтов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подушка из силиконовой резины толщиной 2 мм прикреплена к нижней части алюминиевой детали 2 для плотной герметизации зазора.
  7. Установите подачу воздуха с 5% CO 2 и 19% O2 для нормальной культуры клеток со скоростью воздушного потока 200 куб. см / мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать меньший расход воздуха. Это зависит от того, насколько хорошо герметична гибкая камера.

4. Проведение экспериментов по покадровой визуализации SRS с живыми клетками.

  1. Настройте длину волны лазера на 805 нм, чтобы нацелиться на рамановский сдвиг 2854 см-1 , который объясняется вибрацией химических связей CH2 . Используйте низкую мощность лазера, чтобы уменьшить фотоповреждение клеток. Чтобы следовать этому протоколу, используйте среднюю мощность лазера накачки ~ 15 мВт и ~ 7,5 мВт лазера Стокса (фиксированную на длине волны 1,045 нм) для длительной визуализации живых клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокая мощность лазера обеспечит лучшее качество изображения SRS. Однако слишком высокая мощность лазера приведет к фотоповреждению живых клеток. Существует компромисс между качеством изображения и фотоповреждением.
  2. Отрегулируйте и сфокусируйте цель, чтобы добиться хорошей визуализации клеток SRS, используя кнопку FOCUS на панели MAIN CONTROLS программного обеспечения. Чтобы выполнить быструю фокусировку, установите число пикселей 512 × 512 пикселей с временем выдержки пикселей 4,8 мкс на панели КОНФИГУРАЦИЯ .
  3. Установите диапазон входного сигнала синхронизирующего усилителя (обычно 5 мВ) так, чтобы он в два раза превышал максимальное напряжение сигнала. Установите фильтр нижних частот таким образом, чтобы он совпадал со временем выдержки пикселя (4,8 мкс).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные лабораторные системы SRS могут использовать разные настройки сбора данных.
  4. После достижения хорошей фокусировки установите разрешение изображения на 2,048 × 2,048 пикселей для поля зрения 175мкм2 для получения высококачественных изображений. Проверьте функцию SAVE на панели MAIN CONTROLS и проверьте канал SRS на панели CHANNELS . Установите интервал между двумя кадрами равным 180 с (3 мин) на канале MAIN CONTROLS. Установите номер сбора данных на 480 для покадровой съемки в течение 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкое разрешение изображения может быть использовано в зависимости от цели экспериментов.
  5. Запустите автоматическое получение изображений с помощью функции LOOP на панели MAIN CONTROLS .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте, нет ли фокального дрейфа из-за нестабильности температуры в первый час съемки. Визуализация в первый час может быть нестабильной. Проверяйте фокусировку каждые 2-3 часа во время сеанса покадровой съемки.
  6. Обработайте собранные изображения с помощью ImageJ19. Используйте следующие два метода для количественной оценки LD: (i) отношение LD к площади тела клетки и (ii) средняя интенсивность SRS для общего LD. Измерьте площадь тела клетки, установив порог и обнулив неклеточные пиксели на изображениях SRS на уровне 2,854 см-1. Измерьте площадь и интенсивность LD, установив пороговые значения и обнулив пиксели, отличные от LD, на изображениях SRS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробная информация об обработке изображений SRS была сообщена ранее16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы изготовили и собрали гибкую камерную систему для покадровой визуализации SRS (рис. 1 и рис. 2), а затем оценили производительность системы . Температура внутри корпуса микроскопа достигала ожидаемых 37 °C в течение 1 часа, что не оказывало существенного вли...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Покадровая SRS-микроскопия живых клеток является альтернативным методом визуализации для отслеживания молекул без меток. По сравнению с флуоресцентной маркировкой, визуализация SRS не подвержена фотообесцвечиванию, что позволяет осуществлять долгосрочный мониторинг молекул. Однако н?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Благодарности

Мы хотим поблагодарить группу старших дизайнеров бакалавриата 2019 года (Сук Чул Юн, Ян Фокстон, Луи Мацца и Джеймс Уолш) в Бингемтонском университете за проектирование, изготовление и тестирование корпуса микроскопа. Мы благодарим Скотта Хэнкока, Ольгу Петрову и Фабиолу Морено Оливас из Бингемтонского университета за полезные дискуссии. Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения под номером R15GM140444.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
A lab-built SRS microscopehttps://rdcu.be/cP6ve
HF2LI 50 MHz lock-in ampliferZurich InstrumentsHF2LI
Iris diaphragmThorlabs IncSM1D12
Kinematic mirror mountThorlabs IncKM100
Microscope frameNikon IncFN-1
Motorized microscopy stagePrior ScientificZ-Deck
Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)Nikon IncMBL71405
Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300)Nikon IncMRD77225
Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H)
Airtherm heater moduleWorld Precision Instruments (WPI)AIRTHERM-SAT-1W
Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitorWorld Precision Instruments (WPI)AIRTHERM-SMT-1W
Air/CO2 mixer moduleWorld Precision Instruments (WPI)ECU-HOC-W
Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD)McMaster-Carr56675K71
High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness)McMaster-Carr8489K62
Polycarbonate sheets (thickness 0.25'')McMaster-Carr8574K286
Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'')McMaster-Carr5827T43
Materials and parts for the Flexible chamber
Hot plateMcMaster-Carr31745K11
High-purity inline filter, 1/4 NPTMcMaster-Carr6645T18
Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch)McMaster-Carr4066A34
Hole saw (cutting diameter 50 mm)McMaster-Carr4556A19
High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm ODMcMaster-Carr5054K313
Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)McMaster-Carr98385K843
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD)McMaster-Carr9056K42
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD)McMaster-Carr9056K47
Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'')McMaster-Carr8975K142
Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'')McMaster-Carr9246K21
Objective nosepiece (single)Nikon IncFN-MN-H
Sample holder (modified)Prior ScientificHZ202
Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'')McMaster-Carr8611K13
Vacuum-sealable glass jarMcMaster-Carr3231T44
Software
MATLABMathWorks
ImageJ (Fiji)imagej.net
ScanImageVidrio Technologies, LLCSRS imaging software
Materials for live-cell imaging
Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm)Electron Microscopy Sciences (EMS)70674-02
DMEM cell culture mediumThermoFisher Scientific11965092
Fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher Scientific26140079
LysoSensor fluorescent dye DND-189ThermoFisher ScientificL7535 (Invitrogen)
Oleic acidMilliporeSigma364525
SKOV3 cell lineATCCHTB-77

Ссылки

  1. Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
  2. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  3. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
  4. Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
  5. lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004(2020).
  6. Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870(2015).
  7. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  8. Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
  9. Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. Methods in Cell Biology. (139), Elsevier. 81-101 (2017).
  10. Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365(2020).
  11. Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
  12. Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
  13. Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
  14. Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. Fluorescent Microscopy. , Springer. 57-73 (2022).
  15. Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
  16. Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
  17. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
  18. Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416(2021).
  19. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  20. Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
  21. Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  22. Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
  23. Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
  24. Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003(2022).
  25. Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
  26. Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353(2022).
  27. Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
  28. Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
  29. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  30. Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
  31. Cole, R. Live-cell imaging: the cell's perspective. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).
  32. Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
  33. Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
  34. Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. Mechanoreciprocity in cell migration. Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).
  35. Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  36. Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены