长期和短期造血干细胞的分离方法

摘要

我们提出了使用Hoxb5报告系统分离长期造血干细胞（LT-HSC）和短期造血干细胞（ST-HSC）的分步方案。

摘要

自我更新能力和多谱系分化潜力通常被认为是造血干细胞（HSCs）的决定性特征。然而，大量研究表明，HSC隔室中存在功能异质性。最近的单细胞分析报告了HSC区室内具有不同细胞命运的HSC克隆，这被称为偏倚HSC克隆。异质性或可重复性差的结果背后的机制知之甚少，特别是关于通过常规免疫染色移植纯化的HSC级分时的自我更新时间。因此，建立一种可重复的长期HSC（LT-HSC）和短期HSC（ST-HSC）的分离方法，由其自我更新的长度定义，对于克服这个问题至关重要。使用无偏的多步骤筛选，我们鉴定了一种转录因子 Hoxb5，它可能是小鼠造血系统中LT-HSC的独家标志物。基于这一发现，我们建立了 Hoxb5 报告小鼠系，并成功分离出LT-HSC和ST-HSC。在这里，我们描述了使用 Hoxb5 报告系统分离LT-HSC和ST-HSC的详细协议。这种分离方法将有助于研究人员更好地了解自我更新的机制以及HSC隔室中这种异质性的生物学基础。

引言

造血干细胞（HSCs）具有自我更新能力和多能性，位于造血层次结构的顶点^1，2。1988年，Weissman及其同事首次证明可以使用流式细胞术³实现小鼠HSC的分离。随后，据报道，由细胞表面标志物组合定义的部分Lineage-c-Kit^+Sca-1 + CD150 ⁺ CD34 ^{/ lo}Flk2⁻含有小鼠⁴，5，⁶，7^，8中的所有HSC。

免疫表型定义的（谱系⁻c-Kit+Sca-1+CD150⁺CD34^−/loFlk2⁻）HSC（以下简称pHSC）以前被认为是功能同质的。然而，最近的单细胞分析显示，pHSCs在其自我更新能力⁹，¹⁰和多能性^11，12方面仍表现出异质性。具体而言，pHSC分数中似乎存在两个自我更新能力的人群:具有持续自我更新能力的长期造血干细胞（LT-HSCs）和具有短暂自我^{更新能力的}短期造血干细胞（ST-HSCs）9^，10。

迄今为止，区分LT-HSC和ST-HSC的自我更新能力的分子机制仍然知之甚少。根据细胞的自我更新能力分离两个细胞群并发现潜在的分子机制至关重要。还引入了几种报告系统来纯化LT-HSC¹³，^14，15;然而，每个报告系统定义的LT-HSC纯度是可变的，迄今为止尚未实现独家LT-HSC纯化。

因此，开发LT-HSC和ST-HSC的分离系统将加速pHSC部分自我更新能力的研究。在分离LT-HSC和ST-HSCs时，一项使用多步骤，无偏倚筛选的研究确定了单个基因Hoxb5，该基因在pHSC部分¹⁶中异质表达。此外，对Hoxb5报告小鼠的骨髓分析显示，大约20%-25%的pHSC部分由Hoxb5 ^pos细胞组成。使用Hoxb5 pos pHSC和Hoxb5阴性pHSC的竞争性移植测定显示，只有Hoxb5^pos pHSC具有长期自我更新能力，而Hoxb5^阴性pHSC在短时间内失去其自我更新能力，表明Hoxb5在pHSC部分¹⁶中识别LT-HSC。

在这里，我们演示了使用 Hoxb5 报告系统分离LT-HSC和ST-HSC的分步协议。此外，我们提出了一种竞争性移植测定法来评估Hoxb5^{pos / neg} pHSC的自我更新能力（图1）。该 Hoxb5 报告系统使我们能够前瞻性地分离LT-HSC和ST-HSC，并有助于了解LT-HSC特异性特征。

研究方案

所有描述的动物实验都得到了RIKEN生物系统动力学研究中心的批准。

1.受体小鼠的预处理

1. 准备8-10周龄的雄性C57BL / 6同源小鼠作为受体小鼠。受体小鼠的数量取决于实验方案。我们通常为每种情况准备10-20只小鼠。
   1. 用补充有恩诺沙星（170mg / L）的灭菌水喂养小鼠。由于受辐照的受体小鼠极易感染，因此请保持笼子尽可能清洁。
      注意:在照射前24小时开始补充抗生素，并在移植后持续3周以避免感染。
2. 全身照射
   1. 全身照射会破坏受体骨髓细胞，以确保供体细胞的植入。将受体小鼠转移到照射笼中。在移植前12-16小时以8.7Gy的单剂量照射受体小鼠。
      注意:辐射剂量和时间可能因设备而异。致死辐射剂量应通过研究人员的辐照器和小鼠品系确认。
   2. 全身照射后将它们放回笼子。

2. 采集供体骨髓细胞

1. 准备一只12周大的雄性 Hoxb5-tri-mCherry小鼠，并通过CO₂ 暴露后颈椎脱位或使用当地动物伦理委员会批准的方法对小鼠实施安乐死。
   注意:以下步骤描述了每只小鼠的试剂体积。
2. 在无菌条件下，去除皮肤，露出骨骼（股骨，胫骨，骨盆，肱骨）。切开主要肌肉，并从小鼠身上取出骨头（股骨，胫骨，骨盆，肱骨）。将它们放入不含Ca 2+-和Mg²⁺的冰冷PBS的无菌细胞培养皿中。
3. 使用镊子、小剪刀和湿巾修剪骨骼上的肌肉和纤维组织，以防止污染。在此步骤中注意不要折断骨头。丢弃任何骨折以保持无菌。
4. 用70%乙醇（EtOH）对研钵和研杵进行消毒，并让它们完全干燥。用细胞染色缓冲液（补充有 2% 热灭活 FBS、2 mM EDTA、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）平衡 Ca 2⁺- 和 Mg²⁺ 的 PBS）。
5. 将骨头放入研钵中，加入 3 mL 细胞染色缓冲液。用杵将骨头碾碎。通过轻柔移液分解细胞团块，并通过 100 μm 细胞过滤器将细胞悬液转移到 50 mL 管中。
6. 重复步骤2.5，直到解决方案变得清晰。通常，三次就足够了。

3. 通过磁选分离c-kit⁺ 细胞

1. 用于磁性分选的抗体染色
   1. 将样品在400× g 和4°C下离心5分钟。吸出上清液，并将沉淀重悬于1 mL细胞染色缓冲液中。加入 10 μL 大鼠 IgG （5 mg/mL） 以减少非特异性抗体结合，并使用 P1，000 移液器轻轻上下移液。在冰上孵育15分钟。
   2. 加入浓度为 4 μg/mL 的 c-Kit 抗体（克隆 2B8），并与 P1，000 移液器混合。在冰上孵育15分钟。
   3. 加入 5 mL 细胞染色缓冲液，并充分混合。将样品在400× g，4°C下离心5分钟。吸出上清液，并将沉淀重悬于500μL细胞染色缓冲液中。
   4. 加入 35 μL 抗 APC 微珠以富集 c-Kit⁺ 细胞，并与 P1，000 移液器混合。在冰上孵育15分钟。
   5. 加入 4-5 mL 细胞染色缓冲液。将样品在400× g 和4°C下离心5分钟。吸出上清液，并将沉淀重悬于1 mL细胞染色缓冲液中。
2. 对c-Kit⁺ 细胞进行磁性分选
   1. 按照制造商的说明对细胞进行分类。简而言之，用 3 mL 细胞染色缓冲液灌注磁性分选柱。通过 40 μm 细胞过滤器过滤样品 （1 mL），并将样品加载到磁性分选柱上。
   2. 通过加入 3 mL 细胞染色缓冲液洗涤 3 次。仅当色谱柱储液槽为空时添加细胞染色缓冲液。
   3. 将磁性分选柱放在冰冷的 15 mL 管顶部，并加入 5 mL 细胞染色缓冲液。通过将柱塞牢固地推入色谱柱中来冲洗细胞。将流出物保持在冰上。
      注意:如果样品意外丢失，我们会保持流通直到实验结束。

4. 造血干细胞染色

1. 将步骤3.2.3中制备的样品在400× g 和4°C下离心5分钟。吸出上清液。
2. 将浓度为50μg/ mL的CD34抗体（克隆RAM34）加入沉淀中，并在冰上孵育60分钟。
   注意:建议在用CD34孵育的第一个小时内制备支持细胞，以缩短处理时间。
3. 根据 表1制备抗体预混液。向样品中加入 100 μL 预混液，并在冰上孵育 30 分钟。CD34抗原抗体（克隆;RAM34）需要90分钟才能充分染色。
4. 加入 4-5 mL 细胞染色缓冲液。将样品在400× g 和4°C下离心5分钟。吸出上清液。向沉淀中加入浓度为3μg/ mL的链霉亲和素-BUV737，并在冰上孵育30分钟。
5. 加入 4-5 mL 细胞染色缓冲液。将样品在400× g 和4°C下离心5分钟。吸出上清液，并将沉淀重悬于 400 μL 细胞染色缓冲液中。将样品放在冰上。

5. 支持细胞制备

1. 准备12周龄的CD45.1 + CD45.2 ⁺同源小鼠;理想情况下，这应该与供体小鼠的年龄相同。通过CO₂暴露对小鼠实施安乐死，然后颈椎脱位或使用当地动物伦理委员会批准的方法。
   注意:在提供的示例中，CD45.1 + CD45.2 ⁺同源小鼠通过杂交B6在内部繁殖。CD45.1同源小鼠与C57BL / 6J小鼠¹⁶。
2. 在无菌条件下，取股骨和胫骨，并将它们放入不含Ca 2+和Mg²⁺的冰冷PBS的无菌细胞培养皿中。用镊子和小剪刀修剪骨骼上的肌肉和纤维组织。
3. 用锋利的无菌剪刀剪断骨头的两端。使用 23 G 针头和装有冰冷细胞悬浮缓冲液（不含^Ca 2+ 和 Mg²⁺ 的 PBS，补充有 2% 热灭活 FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）的 5 mL 注射器将骨髓冲洗到带有细胞悬浮缓冲液的无菌细胞培养皿中。通过轻柔移液分解细胞团块。
4. 使用P1，000移液器通过40μm细胞过滤器过滤细胞悬液。使用血细胞计数器计数细胞悬液的细胞数，并制备含有1 x 10⁶ 细胞/ mL的骨髓细胞悬液。
5. 将 200 μL 骨髓细胞悬液（2 x 10⁵ 个细胞）转移到 96 孔圆底板上。在冰上保持使用。
   注意:建议使用圆底板，以便于细胞收集。

6. Hoxb5^pos 或 Hoxb5^负 pHSC 排序

1. 浇口设置
   1. 将步骤 4.5 中制备的 400 μL 样品转移到带有 35 μm 细胞过滤器卡扣帽的圆底聚苯乙烯试管中。准备死细胞染色试剂，并根据制造商的说明在分析前将其添加到样品中。
   2. 打开流式细胞仪，根据制造商的说明启动分析软件。然后，按 加载并获取数据。
      注意:建议使用配备五个激光器和一个70 μm喷嘴的流式细胞仪，以提高分选细胞的纯度。
   3. 排除双联体、死细胞和谱系阳性细胞后，门控谱系-c-Kit^+Sca-1+级分。接下来，将 Flk2⁺ 部分排除在外。然后，在CD150 ⁺ CD34^−/低级分中门控Hoxb5^pos或Hoxb5^阴性pHSC（图2）。对第一个实验中的光谱重叠进行补偿。
      注意:Hoxb5阳性细胞预计占谱系^-c-Kit⁺Sca-1 + ^{CD150 +} CD34 - /^低Flk2⁻部分的20%^-25%。
2. Hoxb5^pos 或 Hoxb5^负 pHSC 排序
   1. 制备 1.5 mL 低蛋白结合管，其中含有 600 μL 不含^Ca 2+ 和 Mg²⁺ 的 PBS，并补充有 10% 热灭活 FBS。
   2. 将 1.5 mL 低蛋白结合管放在分选收集装置上，并使用步骤 6.1.3 中设置的门控策略将 Hoxb5^pos 或 Hoxb5^阴性 pHSC 分选到 1.5 mL 管中。在第一次排序中，使用排序精度模式的产量。
   3. 将96孔板与步骤5.5中制备的支持细胞放在自动细胞沉积单元（ACDU）台上。将步骤6.2.2中制备的1.5 mL低蛋白结合管置于流式细胞仪的上样口。
   4. 使用步骤6.1.3中设置的门控策略将Hoxb5^pos 或Hoxb5^阴性 pHSC分类到具有支持细胞的96孔板中。对10个Hoxb5^pos 或Hoxb5^阴性 pHSC进行分类，以测试它们的自我更新能力。
      注意:建议进行双重分选以提高纯度。在第二次分拣中，使用纯度作为推荐的分拣精度模式。
   5. 通常，在双重分选后收获500-1，000个Hoxb5^pos pHSC和1，500-4，000个Hoxb5^阴性 pHSC。在HSC分选后尽快进行移植程序，以提高细胞活力（理想情况下在1-2小时内）。

7. 移植

1. 将步骤6.2.4中制备的HSC分类的96孔板放在冰上。在无菌条件下处理HSC分选的96孔板，最好在细胞罩中。
2. 在气体麻醉诱导室中用2%异氟醚麻醉受体小鼠。动物完全麻醉后，将其取出，并将其侧放。为确保充分麻醉，请确认无运动以响应有害刺激。
3. 确认适当麻醉后，尽快进行眶后注射，以防止小鼠恢复意识。眶后注射需要不到30秒。
   注意:由于注射时间短，我们完成手术时无需在眼睛中使用眼药膏。但是，如果手术时间较长，我们建议使用眼药膏。
4. 轻轻移液HSC分选的96孔板中的细胞以混合它们。使用30G胰岛素注射器收集分选板中的供体细胞，并将它们注射到受体小鼠的眶后静脉丛中。推荐的进样体积为 ≤200 μL。
5. 观察直到小鼠有意识并在干净的笼子里移动。确认康复后，将它们放回笼子里。

8. 外周血分析

1. 从尾静脉收集 50 μL 外周血，并用 100 μL 不含^Ca 2+- 和 Mg²⁺ 的 PBS 和 2 mM EDTA 重悬。将所有样品转移到96孔板中。在400× g 和4°C下离心5分钟，弃去上清液。
2. 加入 200 μL 红细胞裂解缓冲液，在冰上孵育 3 分钟。将样品在400× g 和4°C下离心5分钟，弃去上清液。再重复一次。
3. 加入 200 μL 细胞染色缓冲液。将样品在400× g 和4°C下离心5分钟，弃去上清液。
4. 根据 表2制备抗体预混液。加入 50 μL 抗体预混液，在冰上孵育 30 分钟。
5. 加入 150 μL 细胞染色缓冲液。将样品在400× g 和4°C下离心5分钟，弃去上清液。
6. 加入 200 μL 细胞染色缓冲液。将样品在400× g 和4°C下离心5分钟，弃去上清液。重悬于200 μL细胞染色缓冲液中，并根据制造商的说明在分析前加入死细胞染色试剂。
7. 如前所述，使用流式细胞仪分析外周血嵌合体¹⁶.在移植后 4 周、8 周、12 周和 16 周采集血液，以遵循多系重建。代表性流式细胞术图如图 3所示。

结果

以前，已经使用竞争性移植测定法测量了自我更新能力，其中供体HSC被认为只有在观察到受体外周血中的多谱系供体细胞时才保持其自我更新能力¹⁷。此外，一些报告将LT-HSC定义为在第二次骨髓移植几个月后继续产生外周血细胞的细胞^10，18。因此，为了比较它们的自我更新能力，将从Hoxb5报告小鼠中分离出的10只Hoxb5^pos或Hoxb5...

讨论

传统上，已经制备了细胞表面标记定义的HSCs来研究HSC的功能，例如自我更新能力和多效性¹⁹，^20，21。然而，免疫表型定义的（谱系⁻c-Kit+Sca-1+CD150⁺CD34^−/loFlk2⁻）HSC部分包含两个离散的HSC群体:LT-HSC和ST-HSC^9，10。因此，对真正?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap	SSIbio	3230-00
0.5M EDTA pH 8.0	Iinvtrogen	AM9260G
100 µm Cell Strainer	Falcon	352360
30G insulin syringe	BD	326668
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	FALCON	352235
7-AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420404
96 well U-Bottom	FALCON	351177
Anti-APC-MicroBeads	Milteny biotec	130-090-855
Aspirator with trap flask	Biosan	FTA-1
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)	BioLegend	103232
B220-Biotin (RA3-6B2)	BioLegend	103204
B220-BV786 (RA3-6B2)	BD Biosciences	563894
B6.CD45.1 congenic mice	Sankyo Labo Service	N/A
Baytril 10%	BAYER	341106546
BD FACS Aria II special order system	BD	N/A
Brilliant stain buffer	BD	566349
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)	BioLegend	101222
CD11b-Biotin (M1/70)	BioLegend	101204
CD11b-BUV395 (M1/70)	BD Biosciences	563553
CD11b-BV711 (M1/70)	BD Biosciences	563168
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)	Invitrogen	56-1271-82
CD150-BV421 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115943
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)	Invitrogen	56-0161-82
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)	BD Biosciences	560230
CD34-FITC (RAM34)	Invitrogen	11034185
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)	BioLegend	100216
CD3ε -Biotin (145-2C11)	BioLegend	100304
CD3ε -BV421 (145-2C11)	BioLegend	100341
CD45.1/CD45.2 congenic mice	N/A	N/A	Bred in our Laboratory
CD45.1-FITC (A20)	BD Biosciences	553775
CD45.2-PE (104)	BD Biosciences	560695
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)	BioLegend	100430
CD4-Biotin (GK1.5)	BioLegend	100404
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)	BioLegend	100730
CD8a-Biotin (53-6.7)	BioLegend	100704
Centrifuge Tube 15ml	NICHIRYO	00-ETS-CT-15
Centrifuge Tube 50ml	NICHIRYO	00-ETS-CT-50
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)	Invitrogen	47117182
D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid	Nacalai	14249-24
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10270106
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)	eBioscience	46135182
FlowJo version 10	BD Biosciences	https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Gmmacell 40 Exactor	Best theratronics	N/A
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)	BioLegend	108422
Gr-1-Biotin (RB6-8C5)	BioLegend	108404
Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background)	N/A	N/A	Bred in our Laboratory
IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution	Sigma-Aldrich	I8015-100MG
isoflurane	Pfizer	4987-114-13340-3
Kimwipes S200	NIPPON PAPER CRECIA	6-6689-01
LS Columns	Milteny biotec	130-042-401
Lysis buffer	BD	555899
MACS  MultiStand	Milteny biotec	130-042-303
Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well	IWAKI	3810-006
MidiMACS Separator	Milteny biotec	130-042-302
Mouse Pie Cages	Natsume Seisakusho	KN-331
Multipurpose refrigerated Centrifuge	TOMY	EX-125
NARCOBIT-E (II)	Natsume Seisakusho	KN-1071-I
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)	BioLegend	108728
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution	nacalai	26253-84
Porcelain Mortar φ120mm with Pestle	Asone	6-549-03
Protein LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431081
Sca-I-BUV395 (D7)	BD Biosciences	563990
Stainless steel scalpel blade	FastGene	FG-B2010
Streptavidin-BUV737	BD Biosciences	612775
SYTOX-red	Invitrogen	S34859
Tailveiner Restrainer for Mice standard	Braintree	TV-150 STD
TCRb-BV421 (H57-597)	BioLegend	109230
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)	BioLegend	116220
Ter-119-Biotin (TER-119)	BioLegend	116204
Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe	TERUMO	SS-05LZ
Terumo Hypodermic Needle 23G x 1	TERUMO	NN-2325-R