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要約

Hoxb5レポーターシステムを使用して、長期造血幹細胞(LT-HSC)および短期造血幹細胞(ST-HSC)を分離するための段階的なプロトコルを提示します。

要約

自己複製能力と多系統分化能は、一般に造血幹細胞(HSC)の決定的な特徴と見なされています。しかしながら、多くの研究は、HSCコンパートメントに機能的不均一性が存在することを示唆している。最近のシングルセル解析では、HSCコンパートメント内で異なる細胞運命を持つHSCクローンが報告されており、これらはバイアスHSCクローンと呼ばれています。不均一または再現性の低い結果の根底にあるメカニズムは、特に精製されたHSC画分を従来の免疫染色によって移植する際の自己複製の長さに関して、ほとんど理解されていません。したがって、長期HSC(LT-HSC)と短期HSC(ST-HSC)の自己複製の長さによって定義される再現性のある分離法を確立することは、この問題を克服するために重要です。偏りのない多段階スクリーニングを用いて、マウス造血系におけるLT-HSCの排他的マーカーである可能性のある転写因子 Hoxb5を同定しました。この知見に基づき、 Hoxb5 レポーターマウス系統を樹立し、LT-HSCとST-HSCの単離に成功しました。ここでは、 Hoxb5 レポーターシステムを使用してLT-HSCとST-HSCを分離するための詳細なプロトコルについて説明します。この単離方法は、研究者が自己複製のメカニズムとHSCコンパートメントにおけるそのような不均一性の生物学的基盤をよりよく理解するのに役立ちます。

概要

自己複製能と多能性を持つ造血幹細胞(HSC)は、造血ヒエラルキーの頂点に存在します1,2。1988年、Weissmanらは、フローサイトメトリー3を用いてマウス造血幹細胞の単離を達成できることを初めて実証した。その後、細胞表面マーカーの組み合わせによって定義される画分、系統-c-キット+Sca-1+CD150+CD34-/loFlk2-が、マウス4,5,6,7,8のすべての造血幹細胞を含むことが報告されました。

免疫表現型で定義された(系統-c-キット+Sca-1+CD150+CD34-/loFlk2-)造血幹細胞(以下、pHSC)は、以前は機能的に均質であると考えられていました。しかし、最近の単一細胞解析により、pHSCは自己複製能力9,10および多能性11,12に関して依然として不均一性を示すことが明らかになりました。具体的には、自己複製能に関して、pHSC画分には、継続的な自己複製能を有する長期造血幹細胞(LT-HSC)と、一過性の自己複製能を有する短期造血幹細胞(ST-HSC)の2つの集団が存在するようである9,10。

今日まで、LT-HSCとST-HSCを区別する自己複製能力の分子メカニズムはよくわかっていません。自己複製能力に基づいて両方の細胞集団を分離し、その根底にある分子メカニズムを発見することが重要です。LT-HSCを精製するために、いくつかのレポーターシステムも導入されています13,14,15;しかし、各レポーター系で規定されるLT-HSC純度は可変であり、これまで排他的なLT-HSC精製は達成されていません。

したがって、LT-HSCおよびST-HSCの分離システムを開発することで、pHSC画分の自己複製能力に関する研究が加速します。LT-HSCおよびST-HSCの単離において、多段階の偏りのないスクリーニングを用いた研究により、pHSC画分16に不均一に発現する単一の遺伝子Hoxb5が同定された。さらに、Hoxb5レポーターマウスの骨髄分析により、pHSC画分の約20%〜25%がHoxb5pos細胞からなることが明らかになりました。Hoxb5pos pHSCとHoxb5neg pHSCを用いた競合移植アッセイでは、Hoxb5pos pHSCのみが長期自己複製能を有するのに対し、Hoxb5neg pHSCは短期間で自己複製能を失うことがわかり、Hoxb5がpHSC画分16でLT-HSCを同定することが示された。

ここでは、 Hoxb5 レポーターシステムを使用してLT-HSCとST-HSCを分離するための段階的なプロトコルを示します。さらに、Hoxb5pos/neg pHSCの自己複製能力を評価するための競合移植アッセイを提示します(図1)。この Hoxb5 レポーターシステムは、LT-HSCとST-HSCを前向きに分離することを可能にし、LT-HSC特有の特性の理解に貢献します。

プロトコル

記載されているすべての動物実験は、理化学研究所生命機能科学研究センターによって承認されました。

1. レシピエントマウスのプレコンディショニング

  1. レシピエントマウスとして8〜10週齢の雄C57BL / 6コンジェニックマウスを準備します。レシピエントマウスの数は、実験プロトコールに依存する。通常、各条件に対して10〜20匹のマウスを準備します。
    1. エンロフロキサシン(170 mg / L)を添加した滅菌水をマウスに与えます。.照射されたレシピエントマウスは感染しやすいため、ケージはできるだけ清潔に保ってください。
      注:抗生物質の補給は、感染を避けるために、照射の24時間前に開始し、移植後3週間継続します。
  2. 全身照射
    1. 全身照射は、レシピエント骨髄細胞を破壊し、ドナー細胞の生着を確実にします。レシピエントマウスを照射ケージに移す。移植前の12〜16時間にレシピエントマウスに8.7Gyの単回投与を致死的に照射する。
      注意: 放射線量と時間は機器によって異なる場合があります。致死放射線量は、研究者の照射器とマウス系統で確認する必要があります。
    2. 全身照射後、ケージに戻します。

2.ドナー骨髄細胞の収集

  1. 12週齢の雄の Hoxb5-tri-mCherryマウスを準備し、CO2 曝露とそれに続く頸部脱臼または地元の動物倫理委員会によって承認された方法を使用してマウスを安楽死させます。
    注: マウスあたりの試薬容量については、次の手順で説明します。
  2. 無菌条件下で、皮膚を取り除き、骨(大腿骨、脛骨、骨盤、上腕骨)を露出させます。主要な筋肉を切り取り、マウスから骨(大腿骨、脛骨、骨盤、上腕骨)を取ります。それらを、Ca 2+-およびMg2+を含まない氷冷PBSを含む滅菌細胞培養皿に入れます。
  3. 汚染を防ぐために、ピンセット、小さなはさみ、ワイプを使用して骨から筋肉と線維組織を取り除きます。このステップで骨を折らないように注意してください。無菌性を維持するために骨折したものはすべて捨ててください。
  4. 乳鉢と乳棒を70%エタノール(EtOH)で滅菌し、完全に乾かします。細胞染色バッファー(2%熱不活化FBS、2 mM EDTA、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを添加したCa2+およびMg2+フリーPBS)で平衡化します。
  5. 骨を乳鉢に入れ、3 mLの細胞染色バッファーを加えます。乳棒で骨をつぶします。穏やかなピペッティングで細胞凝集塊を分解し、細胞懸濁液を100 μmのセルストレーナーを通して50 mLチューブに移します。
  6. 解決策が明確になるまで、手順2.5を繰り返します。通常、3回で十分です。

3. 磁気ソーティングによるc-kit+ 細胞の分離

  1. 磁気ソーティングのための抗体染色
    1. サンプルを400 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを1 mLの細胞染色バッファーに再懸濁した。非特異的抗体の結合を減らすために10 μLのラットIgG(5 mg/mL)を添加し、P1,000ピペットを使用してゆっくりと上下にピペットで移します。氷上で15分間インキュベートします。
    2. c-Kit抗体(クローン2B8)を4 μg/mLの濃度で添加し、P1,000ピペットで混合します。氷上で15分間インキュベートします。
    3. 5 mLの細胞染色バッファーを加え、よく混ぜます。サンプルを400 x g、4°C、5分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを500 μLの細胞染色バッファーに再懸濁した。
    4. c-Kit+ 細胞を濃縮するために35 μLの抗APCマイクロビーズを添加し、P1,000ピペットで混合します。氷上で15分間インキュベートします。
    5. 4〜5 mLの細胞染色バッファーを加えます。サンプルを400 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを1 mLの細胞染色バッファーに再懸濁した。
  2. c-Kit+ 細胞を磁気的にソーティングする
    1. 製造元の指示に従って、セルを並べ替えます。簡単に言うと、磁気ソーティングカラムに3 mLの細胞染色バッファーをプライミングします。サンプル(1 mL)を40 μmのセルストレーナーでろ過し、サンプルを磁気ソーティングカラムにロードします。
    2. 3 mLの細胞染色バッファーを3回加えて洗浄します。細胞染色バッファーは、カラムリザーバーが空の場合にのみ追加してください。
    3. 磁気ソーティングカラムを氷冷した15 mLチューブの上に置き、5 mLの細胞染色バッファーを加えます。プランジャーをカラムにしっかりと押し込んで、細胞を洗い流します。氷の上でフロースルーを保ちます。
      注:誤ってサンプルが失われた場合は、実験が終了するまでフロースルーを維持します。

4. 造血幹細胞染色

  1. ステップ3.2.3で調製したサンプルを400 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。上清を吸引する。
  2. 50 μg/mLの濃度のCD34抗体(クローンRAM34)をペレットに加え、氷上で60分間インキュベートします。
    注:処理時間を短縮するために、CD34とのインキュベーションの最初の1時間の間に支持細胞を調製することをお勧めします。
  3. 表1に従って抗体マスターミックスを調製する。100 μLのマスターミックスをサンプルに加え、氷上で30分間インキュベートします。CD34抗原に対する抗体(クローン;RAM34)は、十分な染色に90分を要します。
  4. 4〜5 mLの細胞染色バッファーを加えます。サンプルを400 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。上清を吸引する。ストレプトアビジン-BUV737を3 μg/mLの濃度でペレットに加え、氷上で30分間インキュベートします。
  5. 4〜5 mLの細胞染色バッファーを加えます。サンプルを400 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを400 μLの細胞染色バッファーに再懸濁した。サンプルを氷の上に置いてください。

5. 細胞調製のサポート

  1. 12週齢のCD45.1+ CD45.2+コンジェニックマウスを調製する。理想的には、これはドナーマウスと同じ年齢でなければなりません。CO2曝露とそれに続く頸部脱臼、または地元の動物倫理委員会によって承認された方法を使用してマウスを安楽死させます。
    注:提供された例では、CD45.1+ CD45.2+コンジェニックマウスをB6を交配することによって社内で飼育した。CD45.1コンジェニックマウスとC57BL/6Jマウス16.
  2. 無菌条件下で、大腿骨と脛骨の両方を採取し、Ca2+-およびMg2+を含まない氷冷PBSを含む滅菌細胞培養皿に入れます。ピンセットと小さなハサミを使用して骨から筋肉と線維組織を取り除きます。
  3. 鋭利で滅菌したハサミで骨の両端を切ります。23 Gの針と氷冷した細胞懸濁液バッファー(2%熱不活化FBS、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを添加したCa2+およびMg2+を含まないPBS)で満たされた5 mLシリンジを使用して、細胞懸濁バッファーを含む滅菌細胞培養皿に骨髄を洗い流します。穏やかなピペッティングで細胞凝集塊を分解します。
  4. P1,000ピペットを使用して40 μmのセルストレーナーで細胞懸濁液をろ過します。血球計算盤を用いて細胞懸濁液の細胞数をカウントし、1 x 106 細胞/mLを含む骨髄細胞懸濁液を調製する。
  5. 200 μLの骨髄細胞懸濁液(2 x 105 細胞)を96ウェル丸底プレートに移します。使用するまで氷上に保管してください。
    注:細胞を簡単に収集するには、丸底プレートをお勧めします。

6. Hoxb5位置 または Hoxb5負の pHSC ソーティング

  1. ゲーティングのセットアップ
    1. ステップ4.5で調製したサンプル400 μLを、35 μmのセルストレーナースナップキャップ付きの丸底ポリスチレン試験管に移します。死細胞染色試薬を調製し、製造元の指示に従って分析前にサンプルに追加します。
    2. フローサイトメーターの電源を入れ、製造元の指示に従って解析ソフトウェアを起動します。次に、 ロードを押してデータを取得します。
      注:選別された細胞の純度を高めるために、5つのレーザーと70 μmのノズルを備えたフローサイトメーターをお勧めします。
    3. ダブレット、死細胞、および系統陽性細胞を除外した後、系統-c-キット+Sca-1+画分をゲートします。次に、Flk2+フラクションをゲートアウトします。次に、Hoxb5posまたはHoxb5neg pHSCをCD150+CD34-/低画分にゲートします(図2)。最初の実験でスペクトルのオーバーラップの補正を実行します。
      注:Hoxb5陽性細胞は、系統-c-キット+ Sca-1 + CD150 + CD34-/低Flk2-画分の20%〜25%を占めると予想されます。
  2. Hoxb5pos または Hoxb5neg pHSC ソーティング
    1. 10%熱不活化FBSを添加した600 μLのCa2+-およびMg2+ フリーPBSを含む1.5 mL低タンパク質結合チューブを準備します。
    2. 1.5 mL低タンパク質結合チューブをソーティングコレクションデバイスにセットし、ステップ6.1.3で設定したゲーティングストラテジーを使用して、Hoxb5pos またはHoxb5neg pHSCを1.5 mLチューブにソーティングします。最初の並べ替えでは、並べ替え精度モードの歩留まりを使用します。
    3. ステップ5.5で調製した支持細胞を入れた96ウェルプレートを自動細胞沈着ユニット(ACDU)ステージにセットします。ステップ6.2.2で調製した1.5 mL低タンパク質結合チューブをフローサイトメーターのローディングポートにセットします。
    4. ステップ 6.1.3 で設定したゲーティング戦略を使用して、Hoxb5pos または Hoxb5neg pHSC を支持細胞と共に 96 ウェルプレートにソーティングします。10個のHoxb5pos またはHoxb5neg pHSCをソートして、自己複製能力をテストします。
      注:純度を高めるために、ダブルソートをお勧めします。2 番目の並べ替えでは、推奨される並べ替え精度モードとして純度を使用します。
    5. 典型的には、500〜1,000個のHoxb5pos pHSCおよび1,500〜4,000個のHoxb5neg pHSCがダブルソート後に回収される。細胞生存率を高めるために、HSCソーティング後できるだけ早く移植手順を進めてください(理想的には1〜2時間以内)。

7.移植

  1. ステップ6.2.4で調製したHSCで選別した96ウェルプレートを氷上に置きます。HSCで選別された96ウェルプレートは、無菌状態で、理想的にはセルフード内で取り扱ってください。
  2. レシピエントマウスをガス麻酔誘導チャンバー内で2%イソフルランで麻酔する。動物が完全に麻酔されたら、それを取り外して横に置きます。十分な麻酔を確保するために、有害な刺激に反応して動きがないことを確認してください。
  3. 適切な麻酔の確認後、マウスが意識を取り戻すのを防ぐために、できるだけ早く後眼窩注射を行います。逆軌道注入は30秒未満かかります。
    注:注射時間が短いため、眼軟膏を目に塗布せずに手順を完了します。ただし、手順に時間がかかる場合は、眼科用軟膏の使用をお勧めします。
  4. HSCで選別した96ウェルプレートで細胞を静かにピペットで混合します。30Gインスリンシリンジを用いてソーティングプレートにドナー細胞を採取し、レシピエントマウスの眼窩後静脈叢に注入する。推奨される注入可能量は≤200μLです。
  5. マウスが意識を持ち、きれいなケージの中で動き回るまで観察します。回復を確認した後、ケージに戻します。

8.末梢血分析

  1. 尾静脈から末梢血50 μLを採取し、2 mM EDTAを含む100 μLのCa2+-およびMg2+フリーPBSで再懸濁します。すべてのサンプルを96ウェルプレートに移します。400 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
  2. 200 μLの赤血球溶解バッファーを加え、氷上で3分間インキュベートします。サンプルを400 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。もう一度繰り返します。
  3. 200 μLの細胞染色バッファーを添加します。サンプルを400 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
  4. 表2に従って抗体マスターミックスを調製する。50 μLの抗体マスターミックスを加え、氷上で30分間インキュベートします。
  5. 150 μLの細胞染色バッファーを添加します。サンプルを400 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
  6. 200 μLの細胞染色バッファーを添加します。サンプルを400 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。200 μLの細胞染色バッファーに再懸濁し、製造元の指示に従って分析前に死細胞染色試薬を追加します。
  7. 末梢血キメラを前述のようにフローサイトメーターを用いて分析する16。移植後4週間、8週間、12週間、および16週間で採血し、多系統再構成を追跡します。代表的なフローサイトメトリープロットを 図3に示します。

結果

これまで、自己複製能は競合移植アッセイを用いて測定されており、ドナー造血幹細胞は、レシピエント末梢血中の多系列ドナー細胞が観察された場合にのみ自己複製能を保持すると考えられていました17。さらに、いくつかの報告では、LT-HSCを、2回目の骨髄移植後数ヶ月で末梢血細胞を産生し続ける細胞と定義しています10,18。...

ディスカッション

伝統的に、細胞表面マーカーで定義されたHSCは、自己複製能力や多能価などのHSCの機能を研究するために調製されてきました19,20,21。ただし、免疫表現型的に定義された(系統-c-キット+ Sca-1 + CD150 + CD34-/loFlk2-)HSC画分には、LT-HSCとST-HSCの2つの個別のHSC集団が含まれています

開示事項

著者らは、この研究に関連する利益相反を宣言していません。

謝辞

清成宏さんには理研BDRの動物飼育とレシピエントマウスの提供、神戸大学の研究室運営には小賀仁美さん、長坂佳代子さん、宮橋正樹さんに感謝いたします。著者はまた、この作業に対する継続的な支援に大いに感謝しています。宮西雅則弁護士が、日本学術振興会(JSPS)科研費JP17K07407、JP20H03268、持田記念医薬研究財団、公益財団法人ライフサイエンス財団、武田科学振興財団、アステラス代謝障害研究財団、AMED-PRIME(AMED)の助成番号JP18gm6110020の助成を受けています。 坂巻太郎さんは、JSPS科研費JP21K20669、JP22K16334の助成を受けています。日本学術振興会コア・トゥ・コア・プログラム、理化学研究所ジュニア・リサーチ・アソシエイト・プログラム西克之さんがJSPS課題番号科研費JP18J13408の支援を受けて行われました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome CapSSIbio3230-00
0.5M EDTA pH 8.0IinvtrogenAM9260G
100 µm Cell StrainerFalcon352360
30G insulin syringeBD326668
40 µm Cell StrainerFalcon352340
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapFALCON352235
7-AAD Viability Staining SolutionBioLegend420404
96 well U-BottomFALCON351177
Anti-APC-MicroBeadsMilteny biotec130-090-855
Aspirator with trap flaskBiosanFTA-1
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)BioLegend103232
B220-Biotin (RA3-6B2)BioLegend103204
B220-BV786 (RA3-6B2)BD Biosciences563894
B6.CD45.1 congenic mice Sankyo Labo ServiceN/A
Baytril 10%BAYER341106546
BD FACS Aria II special order system BDN/A
Brilliant stain bufferBD566349
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)BioLegend101222
CD11b-Biotin (M1/70)BioLegend101204
CD11b-BUV395 (M1/70)BD Biosciences563553
CD11b-BV711 (M1/70)BD Biosciences563168
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)Invitrogen56-1271-82
CD150-BV421 (TC15-12F12.2)BioLegend115943
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)Invitrogen56-0161-82
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)BD Biosciences560230
CD34-FITC (RAM34)Invitrogen11034185
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)BioLegend100216
CD3ε -Biotin (145-2C11)BioLegend100304
CD3ε -BV421 (145-2C11)BioLegend100341
CD45.1/CD45.2 congenic miceN/AN/ABred in our Laboratory
CD45.1-FITC (A20)BD Biosciences553775
CD45.2-PE (104)BD Biosciences560695
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)BioLegend100430
CD4-Biotin (GK1.5)BioLegend100404
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)BioLegend100730
CD8a-Biotin (53-6.7)BioLegend100704
Centrifuge Tube 15mlNICHIRYO00-ETS-CT-15
Centrifuge Tube 50mlNICHIRYO00-ETS-CT-50
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)Invitrogen47117182
D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid Nacalai14249-24
Fetal Bovine SerumThermo Fisher10270106
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)eBioscience46135182
FlowJo version 10BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Gmmacell 40 ExactorBest theratronicsN/A
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)BioLegend108422
Gr-1-Biotin (RB6-8C5)BioLegend108404
Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) N/AN/ABred in our Laboratory
IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solutionSigma-AldrichI8015-100MG
isofluranePfizer4987-114-13340-3 
Kimwipes S200NIPPON PAPER CRECIA 6-6689-01
LS ColumnsMilteny biotec130-042-401
Lysis buffer BD555899
MACS  MultiStandMilteny biotec130-042-303
Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6WellIWAKI3810-006
MidiMACS SeparatorMilteny biotec130-042-302
Mouse Pie CagesNatsume SeisakushoKN-331
Multipurpose refrigerated CentrifugeTOMYEX-125
NARCOBIT-E (II)Natsume SeisakushoKN-1071-I
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)BioLegend108728
Penicillin-Streptomycin Mixed Solutionnacalai26253-84
Porcelain Mortar φ120mm with PestleAsone6-549-03
Protein LoBind Tube 1.5 mL Eppendorf22431081
Sca-I-BUV395 (D7)BD Biosciences563990
Stainless steel scalpel bladeFastGeneFG-B2010
Streptavidin-BUV737BD Biosciences612775
SYTOX-redInvitrogenS34859
Tailveiner Restrainer for Mice standardBraintreeTV-150 STD
TCRb-BV421 (H57-597)BioLegend109230
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)BioLegend116220
Ter-119-Biotin (TER-119)BioLegend116204
Terumo 5ml Concentric Luer-Slip SyringeTERUMOSS-05LZ
Terumo Hypodermic Needle 23G x 1TERUMONN-2325-R

参考文献

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