Método de Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas de Longa e Curta Duração

Resumo

Apresentamos um protocolo passo a passo para o isolamento de células-tronco hematopoéticas de longa duração (CT-HSCs) e CTHs de curta duração (CTH-ST) utilizando o sistema repórter Hoxb5.

Resumo

A capacidade de autorrenovação e o potencial de diferenciação de múltiplas linhagens são geralmente considerados como as características definidoras das células-tronco hematopoéticas (CTH). No entanto, numerosos estudos têm sugerido que existe heterogeneidade funcional no compartimento das CTH. Análises recentes de célula única relataram clones de HSC com diferentes destinos celulares dentro do compartimento HSC, que são referidos como clones de HSC tendenciosos . Os mecanismos subjacentes aos resultados heterogêneos ou pouco reprodutíveis são pouco compreendidos, especialmente em relação ao tempo de auto-renovação quando frações purificadas de HSC são transplantadas por imunomarcação convencional. Portanto, estabelecer um método de isolamento reprodutível para HSCs de longa duração (CT-HSCs) e de curta duração (HSCs-ST), definido pelo tempo de sua auto-renovação, é crucial para superar essa questão. Usando triagem multi-etapa imparcial, identificamos um fator de transcrição, Hoxb5, que pode ser um marcador exclusivo de LT-HSCs no sistema hematopoiético de camundongos. Com base nesse achado, estabelecemos uma linhagem de camundongos repórteres Hoxb5 e isolamos com sucesso LT-HSCs e ST-HSCs. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de LT-HSCs e ST-HSCs usando o sistema de repórteres Hoxb5 . Este método de isolamento ajudará os pesquisadores a entender melhor os mecanismos de auto-renovação e as bases biológicas para tal heterogeneidade no compartimento HSC.

Introdução

As células-tronco hematopoéticas (CTH), que possuem capacidade de autorrenovação e multipotência, residem no ápice da hierarquia hematopoética ^1,2. Em 1988, Weissman e colaboradores demonstraram pela primeira vez que o isolamento de HSCs de camundongos poderia ser obtido usando citometria de fluxo³. Posteriormente, uma fração definida por uma combinação de marcadores de superfície celular, Lineage⁻c-Kit⁺Sca-1+CD150⁺CD34−^/loFlk2⁻, foi relatada como contendo todas as CTHs em camundongos 4,5,6,7,8.

As HSCs imunofenotipicamente definidas (Linhagem⁻c-Kit⁺Sca-1+CD150⁺CD34−/lo Flk2⁻) (^doravante, pHSCs) foram previamente consideradas funcionalmente homogêneas. No entanto, análises recentes de células únicas têm revelado que as pHSCs ainda exibem heterogeneidade em relação à sua capacidade de autorrenovação 9,10 e multipotência^11,12. Especificamente, duas populações parecem existir na fração pHSC no que diz respeito à sua capacidade de autorrenovação: as células-tronco hematopoéticas de longa duração (CTH-LT), que têm capacidade de auto-renovação contínua, e as células-tronco hematopoéticas de curto prazo (CTH-ST), que têm capacidade de autorrenovação transitória ^9,10.

Até o momento, os mecanismos moleculares da capacidade de auto-renovação que distinguem LT-HSCs e ST-HSCs permanecem pouco compreendidos. É crucial isolar ambas as populações celulares com base em suas capacidades de auto-renovação e descobrir mecanismos moleculares subjacentes. Vários sistemas repórteres também foram introduzidos para purificar LT-HSCs^13,14,15; no entanto, a pureza LT-HSC definida por cada sistema repórter é variável, e a purificação exclusiva de LT-HSC não foi alcançada até o momento.

Portanto, o desenvolvimento de um sistema de isolamento para LT-HSCs e ST-HSCs acelerará as pesquisas sobre a capacidade de auto-renovação na fração pHSC. No isolamento de LT-HSCs e ST-HSCs, um estudo utilizando triagem em várias etapas e sem viés identificou um único gene, Hoxb5, que é heterogeneamente expresso na fração pHSC¹⁶. Além disso, a análise da medula óssea dos camundongos repórteres Hoxb5 revelou que aproximadamente 20%-25% da fração pHSC consiste de células Hoxb5 ^pos. Um ensaio competitivo de transplante usando pHSCs Hoxb5 pos e pHSCs Hoxb5 neg revelou que apenas as pHSCs Hoxb5^pos possuem capacidade de auto-renovação de longo prazo, enquanto as^pHSCs Hoxb5^neg perdem sua capacidade de auto-renovação em um curto período, indicando que Hoxb5 identifica LT-HSCs na fração^{pHSC 16}.

Aqui, demonstramos um protocolo passo a passo para isolar LT-HSCs e ST-HSCs usando o sistema de relatório Hoxb5 . Além disso, apresentamos um ensaio competitivo de transplante para avaliar a capacidade de autorrenovação das pHSCs Hoxb5^pos/neg (Figura 1). Este sistema de reporte Hoxb5 nos permite isolar prospectivamente LT-HSCs e ST-HSCs e contribui para o entendimento das características específicas de LT-HSC.

Protocolo

Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.

1. Pré-condicionamento dos camundongos receptores

1. Preparar camundongos machos C57BL/6 congênicos com idade entre 8-10 semanas de idade como camundongos receptores. O número de camundongos receptores depende do protocolo experimental. Normalmente, preparamos de 10 a 20 camundongos para cada condição.
   1. Alimentar os camundongos com água esterilizada suplementada com enrofloxacina (170 mg/L). Como os camundongos receptores irradiados são altamente suscetíveis à infecção, mantenha as gaiolas o mais limpas possível.
      NOTA: A suplementação com antibióticos começa 24 h antes da irradiação e continua por 3 semanas após o transplante para evitar infecções.
2. Irradiação corporal total
   1. A irradiação corporal total destrói as células da medula óssea receptora para garantir o enxerto das células do doador. Transfira os camundongos receptores para uma gaiola de irradiação. Irradiar letalmente os camundongos receptores com dose única de 8,7 Gy em 12-16 h antes do transplante.
      NOTA: A dose e o tempo de radiação podem variar dependendo do equipamento. A dose letal de radiação deve ser confirmada com o irradiador do pesquisador e a cepa do camundongo.
   2. Devolvê-los às suas gaiolas após a irradiação total do corpo.

2. Coleta das células da medula óssea do doador

1. Preparar um camundongo Hoxb5-tri-mCherry macho com 12 semanas de idade e eutanasiar o camundongo por exposição ao CO₂ seguida de deslocamento cervical ou usando métodos aprovados pelo comitê de ética animal local.
   Observação : O volume de reagente por mouse é descrito nas etapas a seguir.
2. Sob condições estéreis, remova a pele e exponha os ossos (fêmur, tíbia, pelve, úmero). Corte os principais músculos e tire os ossos (fêmur, tíbia, pelve, úmero) do rato. Coloque-os em placas de cultura celular estéril com Ca 2+ e Mg²⁺-free, PBS gelado.
3. Corte os músculos e tecidos fibrosos dos ossos usando pinças, pequenas tesouras e lenços umedecidos para evitar a contaminação. Tenha cuidado para não quebrar os ossos durante esta etapa. Descarte os ossos quebrados para manter a esterilidade.
4. Esterilizar uma argamassa e pilão com etanol 70% (EtOH), e deixá-los secar completamente. Equilibre com tampão de coloração celular (PBS livre de Ca 2+ e Mg²⁺ suplementado com FBS inativado pelo calor a 2%, EDTA 2 mM, penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 μg/mL).
5. Coloque os ossos na argamassa e adicione 3 mL de tampão de coloração celular. Esmague os ossos abertos com o pilão. Desagregar os aglomerados celulares por pipetagem suave e transferir a suspensão celular através de um filtro celular de 100 μm para um tubo de 50 mL.
6. Repita o passo 2.5 até que a solução fique límpida. Normalmente, três vezes é suficiente.

3. Separação das células c-kit⁺ por classificação magnética

1. Coloração de anticorpos para classificação magnética
   1. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de tampão de coloração celular. Adicionar 10 μL de IgG de rato (5 mg/mL) para reduzir a ligação de anticorpos inespecíficos e pipetar suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta P1.000. Incubar no gelo por 15 min.
   2. Adicionar o anticorpo c-Kit (clone 2B8) na concentração de 4 μg/mL e misturar com uma pipeta P1.000. Incubar no gelo por 15 min.
   3. Adicione 5 mL de tampão de coloração celular e misture bem. Centrifugar as amostras a 400 x g, 4 °C, 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 μL de tampão de coloração celular.
   4. Adicione 35 μL de microesferas anti-APC para enriquecer as células c-Kit⁺ e misture com uma pipeta P1.000. Incubar no gelo por 15 min.
   5. Adicionar 4-5 mL de tampão de coloração celular. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de tampão de coloração celular.
2. Classificando as células c-Kit⁺ magneticamente
   1. Siga as instruções do fabricante para classificar as células. Em resumo, prima uma coluna de classificação magnética com 3 mL de tampão de coloração celular. Filtrar a amostra (1 ml) através de um filtro celular de 40 μm e carregar a amostra na coluna de classificação magnética.
   2. Lavar adicionando três vezes 3 mL de tampão de coloração celular. Adicione o buffer de coloração de célula somente quando o reservatório da coluna estiver vazio.
   3. Coloque a coluna de classificação magnética em cima de um tubo gelado de 15 mL e adicione 5 mL de tampão de coloração celular. Limpe as células empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna. Mantenha o fluxo no gelo.
      OBS: Em caso de perda acidental da amostra, mantemos o fluxo-through até o final do experimento.

4. Coloração de células-tronco hematopoéticas

1. Centrifugar a amostra preparada na etapa 3.2.3 a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante.
2. Adicionar o anticorpo CD34 (clone RAM34) na concentração de 50 μg/mL ao pellet e incubar no gelo por 60 min.
   NOTA: A preparação das células de suporte durante a primeira hora de incubação com CD34 é recomendada para encurtar o tempo de processamento.
3. Preparar a mistura mestra de anticorpos de acordo com a Tabela 1. Adicionar 100 μL da mistura principal à amostra e incubar no gelo durante 30 minutos. O anticorpo para o antígeno CD34 (clone; RAM34) requer 90 min para coloração suficiente.
4. Adicionar 4-5 mL de tampão de coloração celular. Centrifugar a amostra a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Adicionar estreptavidina-BUV737 a uma concentração de 3 μg/mL ao pellet e incubar no gelo por 30 min.
5. Adicionar 4-5 mL de tampão de coloração celular. Centrifugar a amostra a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 400 μL de tampão de coloração celular. Mantenha a amostra no gelo.

5. Apoio à preparação celular

1. Preparar um camundongo CD45.1+ CD45.2⁺ congênico com 12 semanas de idade; O ideal é que este tenha a mesma idade do camundongo doador. Eutanásia do camundongo por exposição ao CO₂ seguida de luxação cervical ou usando métodos aprovados pelo comitê de ética animal local.
   NOTA: No exemplo fornecido, camundongos CD45.1+ CD45.2⁺ congênicos foram criados internamente cruzando B6. Camundongos CD45.1 congênicos com camundongos C57BL/6J¹⁶.
2. Sob condições estéreis, pegue os fêmures e as tíbias e coloque-os em placas de cultura de células estéreis com PBS gelado sem Ca 2+ e Mg²⁺. Aparar os músculos e tecidos fibrosos dos ossos usando pinças e pequenas tesouras.
3. Corte as duas extremidades dos ossos com uma tesoura afiada e estéril. Use uma agulha de 23 G e uma seringa de 5 mL preenchida com tampão de suspensão de células geladas (PBS livre de Ca 2+ e Mg²⁺ suplementado com SFB inativado pelo calor a 2%, penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 μg/mL) para liberar a medula óssea em uma placa de cultura celular estéril com tampão de suspensão celular. Desagregar os aglomerados celulares por pipetagem suave.
4. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 40 μm usando uma pipeta P1.000. Contar o número de células da suspensão celular usando um hemocitômetro e preparar uma suspensão de células da medula óssea contendo 1 x 10⁶ células/mL.
5. Transferir 200 μL da suspensão de células da medula óssea (2 x 10⁵ células) para uma placa de fundo redondo de 96 poços. Manter no gelo até o uso.
   NOTA: Placas de fundo redondo são recomendadas para facilitar a coleta de células.

6. Hoxb5^pos ou Hoxb5^neg pHSC classificação

1. Configuração do Gating
   1. Transferir 400 μL da amostra preparada na etapa 4.5 para um tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo com uma tampa de encaixe do filtro de células de 35 μm. Preparar o reagente de coloração de células mortas e adicioná-lo à amostra antes da análise de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Ligue um citômetro de fluxo e inicie o software de análise de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, pressione Carregar e adquira os dados.
      NOTA: Um citômetro de fluxo equipado com cinco lasers e um bico de 70 μm é recomendado para aumentar a pureza das células classificadas.
   3. Depois de excluir duplos, células mortas e células positivas para linhagem, abra a fração Lineage⁻c-Kit⁺Sca-1⁺ . Em seguida, cancele a fração ^Flk2+ . Em seguida, gate Hoxb5^pos ou Hoxb5^neg pHSCs na fração CD150⁺CD34^−/baixa (Figura 2). Realizar compensação para a sobreposição espectral no primeiro experimento.
      NOTA: Espera-se que as células positivas para Hoxb5 representem 20%-25% da fração Lineage⁻c-Kit⁺Sca-1+CD150⁺CD34−^/Flk2− baixa.
2. Hoxb5^pos ou Hoxb5^neg pHSC classificação
   1. Preparar um tubo de 1,5 mL de baixa ligação à proteína com 600 μL de PBS livre de Ca 2+ e Mg²⁺ suplementado com FBS inativado pelo calor a 10%.
   2. Coloque o tubo de 1,5 mL de baixa ligação à proteína em um dispositivo de coleta de classificação e classifique os^pHSCs Hoxb5 pos ou Hoxb5^neg no tubo de 1,5 mL usando a estratégia de gating definida na etapa 6.1.3. Na primeira classificação, use o rendimento do modo de precisão de classificação.
   3. Ajuste a placa de 96 poços com as células de suporte preparadas na etapa 5.5 no estágio da unidade de deposição celular automatizada (ACDU). Ajustar o tubo de ligação de 1,5 ml de baixa proteína preparado no passo 6.2.2 para a porta de carregamento de um citómetro de fluxo.
   4. Classifique os^pHSCs Hoxb5 pos ou Hoxb5^neg em uma placa de 96 poços com as células de suporte usando a estratégia de gating definida na etapa 6.1.3. Classifique 10^pHSCs Hoxb5 pos ou Hoxb5^neg para testar suas capacidades de autorrenovação.
      NOTA: Recomenda-se a dupla classificação para aumentar a pureza. Na segunda classificação, use a pureza como o modo de precisão de classificação recomendado.
   5. Normalmente, 500-1.000^pHSCs Hoxb5 pos e 1.500-4.000 pHSCs Hoxb5^neg são colhidos após dupla classificação. Prossiga com os procedimentos de transplante o mais rápido possível após a triagem do HSC para melhorar a viabilidade celular (idealmente dentro de 1-2 h).

7. Transplante

1. Coloque no gelo a placa de 96 poços preparada na etapa 6.2.4 classificada por HSC. Manuseie a placa de 96 poços classificada para HSC em condições estéreis, idealmente em uma capela celular.
2. Anestesiar camundongo receptor com isoflurano a 2% em câmara de indução gasosa para anestesia. Assim que o animal estiver totalmente anestesiado, retire-o e coloque-o de lado. Para garantir anestesia suficiente, confirme que nenhum movimento em resposta a um estímulo nocivo.
3. Após a confirmação da anestesia adequada, realize uma injeção retro-orbital o mais rápido possível para evitar que o camundongo recupere a consciência. A injeção retro-orbital leva menos de 30 s.
   NOTA: Como o tempo de injeção é curto, terminamos o procedimento sem aplicar pomada oftálmica nos olhos. No entanto, se o procedimento demorar mais, recomendamos o uso de pomada oftálmica.
4. Pipetar suavemente as células na placa de 96 poços selecionada para HSC para misturá-las. Recolher as células do dador na placa de triagem utilizando uma seringa de insulina de 30 G e injetá-las no plexo venoso retro-orbital dos ratinhos receptores. O volume injetável recomendado é de ≤200 μL.
5. Observe até que os ratos estejam conscientes e se movendo em uma gaiola limpa. Devolva-os às suas gaiolas depois de confirmar a sua recuperação.

8. Análise do sangue periférico

1. Coletar 50 μL de sangue periférico da veia caudal e ressuspendê-lo com 100 μL de PBS livre de Ca 2+ e Mg²⁺ com EDTA 2 mM. Transfira todas as amostras para uma placa de 96 poços. Centrifugar a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante.
2. Adicionar 200 μL de tampão de lise de hemácias e incubar no gelo por 3 min. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante. Repita mais uma vez.
3. Adicionar 200 μL de tampão de coloração celular. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante.
4. Preparar a mistura mestre de anticorpos de acordo com a Tabela 2. Adicionar 50 μL de mistura mestra de anticorpos e incubar no gelo por 30 min.
5. Adicionar 150 μL de tampão de coloração celular. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante.
6. Adicionar 200 μL de tampão de coloração celular. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante. Ressuspender em 200 μL de tampão de coloração celular e adicionar reagente de coloração de células mortas antes da análise de acordo com as instruções do fabricante.
7. Analise o quimerismo do sangue periférico por citômetro de fluxo conforme descrito anteriormente¹⁶. Coletar sangue em 4 semanas, 8 semanas, 12 semanas e 16 semanas após o transplante para seguir a reconstituição de múltiplas linhagens. Gráficos representativos de citometria de fluxo são apresentados na Figura 3.

Resultados

Anteriormente, a capacidade de auto-renovação foi medida por meio de ensaios competitivos de transplante, nos quais acredita-se que as CTHs do doador retenham sua capacidade de auto-renovação apenas se forem observadas células de doadores de várias linhagens no sangue periférico do receptor¹⁷. Além disso, vários relatos definem LT-HSCs como células que continuam a produzir células do sangue periférico vários meses após o segundo transplante de medula óssea^10,18

Discussão

Tradicionalmente, as CTHs definidas por marcadores de superfície celular têm sido preparadas para estudar as funções das CTHs, como a capacidade de autorrenovação e a multipotência19,20,21. Entretanto, a fração HSC imunofenotipicamente definida (Lineage⁻c-Kit⁺Sca-1+CD150⁺CD34−^/loFlk2⁻) contém duas populações discretas de HSC: LT-HSCs e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap	SSIbio	3230-00
0.5M EDTA pH 8.0	Iinvtrogen	AM9260G
100 µm Cell Strainer	Falcon	352360
30G insulin syringe	BD	326668
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	FALCON	352235
7-AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420404
96 well U-Bottom	FALCON	351177
Anti-APC-MicroBeads	Milteny biotec	130-090-855
Aspirator with trap flask	Biosan	FTA-1
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)	BioLegend	103232
B220-Biotin (RA3-6B2)	BioLegend	103204
B220-BV786 (RA3-6B2)	BD Biosciences	563894
B6.CD45.1 congenic mice	Sankyo Labo Service	N/A
Baytril 10%	BAYER	341106546
BD FACS Aria II special order system	BD	N/A
Brilliant stain buffer	BD	566349
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)	BioLegend	101222
CD11b-Biotin (M1/70)	BioLegend	101204
CD11b-BUV395 (M1/70)	BD Biosciences	563553
CD11b-BV711 (M1/70)	BD Biosciences	563168
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)	Invitrogen	56-1271-82
CD150-BV421 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115943
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)	Invitrogen	56-0161-82
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)	BD Biosciences	560230
CD34-FITC (RAM34)	Invitrogen	11034185
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)	BioLegend	100216
CD3ε -Biotin (145-2C11)	BioLegend	100304
CD3ε -BV421 (145-2C11)	BioLegend	100341
CD45.1/CD45.2 congenic mice	N/A	N/A	Bred in our Laboratory
CD45.1-FITC (A20)	BD Biosciences	553775
CD45.2-PE (104)	BD Biosciences	560695
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)	BioLegend	100430
CD4-Biotin (GK1.5)	BioLegend	100404
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)	BioLegend	100730
CD8a-Biotin (53-6.7)	BioLegend	100704
Centrifuge Tube 15ml	NICHIRYO	00-ETS-CT-15
Centrifuge Tube 50ml	NICHIRYO	00-ETS-CT-50
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)	Invitrogen	47117182
D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid	Nacalai	14249-24
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10270106
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)	eBioscience	46135182
FlowJo version 10	BD Biosciences	https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Gmmacell 40 Exactor	Best theratronics	N/A
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)	BioLegend	108422
Gr-1-Biotin (RB6-8C5)	BioLegend	108404
Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background)	N/A	N/A	Bred in our Laboratory
IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution	Sigma-Aldrich	I8015-100MG
isoflurane	Pfizer	4987-114-13340-3
Kimwipes S200	NIPPON PAPER CRECIA	6-6689-01
LS Columns	Milteny biotec	130-042-401
Lysis buffer	BD	555899
MACS  MultiStand	Milteny biotec	130-042-303
Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well	IWAKI	3810-006
MidiMACS Separator	Milteny biotec	130-042-302
Mouse Pie Cages	Natsume Seisakusho	KN-331
Multipurpose refrigerated Centrifuge	TOMY	EX-125
NARCOBIT-E (II)	Natsume Seisakusho	KN-1071-I
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)	BioLegend	108728
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution	nacalai	26253-84
Porcelain Mortar φ120mm with Pestle	Asone	6-549-03
Protein LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431081
Sca-I-BUV395 (D7)	BD Biosciences	563990
Stainless steel scalpel blade	FastGene	FG-B2010
Streptavidin-BUV737	BD Biosciences	612775
SYTOX-red	Invitrogen	S34859
Tailveiner Restrainer for Mice standard	Braintree	TV-150 STD
TCRb-BV421 (H57-597)	BioLegend	109230
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)	BioLegend	116220
Ter-119-Biotin (TER-119)	BioLegend	116204
Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe	TERUMO	SS-05LZ
Terumo Hypodermic Needle 23G x 1	TERUMO	NN-2325-R