Uzun Süreli ve Kısa Süreli Hematopoetik Kök Hücreler için İzolasyon Yöntemi

Özet

Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC'ler) ve kısa süreli HSC'lerin (ST-HSC'ler) izolasyonu için adım adım bir protokol sunuyoruz.

Özet

Kendini yenileme kapasitesi ve çok soylu farklılaşma potansiyeli genellikle hematopoetik kök hücrelerin (HSC) tanımlayıcı özellikleri olarak kabul edilir. Bununla birlikte, çok sayıda çalışma, HSC kompartmanında fonksiyonel heterojenitenin var olduğunu ileri sürmüştür. Son zamanlarda yapılan tek hücreli analizler, HSC bölmesinde farklı hücre kaderlerine sahip HSC klonlarını bildirmiştir ve bunlar önyargılı HSC klonları olarak adlandırılmaktadır. Heterojen veya kötü tekrarlanabilir sonuçların altında yatan mekanizmalar, özellikle saflaştırılmış HSC fraksiyonları konvansiyonel immün boyama ile nakledildiğinde kendini yenilemenin uzunluğu ile ilgili olarak çok az anlaşılmıştır. Bu nedenle, uzun vadeli HSC'ler (LT-HSC'ler) ve kısa vadeli HSC'ler (ST-HSC'ler) için, kendilerini yenileme süreleri ile tanımlanan tekrarlanabilir bir izolasyon yöntemi oluşturmak, bu sorunun üstesinden gelmek için çok önemlidir. Tarafsız çok adımlı tarama kullanarak, fare hematopoetik sistemindeki LT-HSC'lerin özel bir belirteci olabilecek bir transkripsiyon faktörü olan Hoxb5'i tanımladık. Bu bulguya dayanarak, bir Hoxb5 muhabir fare hattı oluşturduk ve LT-HSC'leri ve ST-HSC'leri başarıyla izole ettik. Burada, Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak LT-HSC'lerin ve ST-HSC'lerin izolasyonu için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu izolasyon yöntemi, araştırmacıların kendini yenileme mekanizmalarını ve HSC bölmesindeki bu heterojenliğin biyolojik temelini daha iyi anlamalarına yardımcı olacaktır.

Giriş

Kendini yenileme kapasitesine ve multipotensine sahip hematopoetik kök hücreler (HSC'ler), hematopoetik hiyerarşi ^1,2'nin zirvesinde yer almaktadır. 1988'de Weissman ve meslektaşları ilk kez fare HSC'lerinin izolasyonunun akış sitometrisi³ kullanılarak sağlanabileceğini gösterdi. Daha sonra, hücre yüzey belirteçlerinin bir kombinasyonu ile tanımlanan bir fraksiyonun, Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 ⁺ CD34 ^{− / lo}Flk2 ⁻, farelerde tüm HSC'leri içerdiği bildirildi 4,5,6,7,8.

İmmünofenotipik olarak tanımlanmış (Lineage-c-Kit+^Sca-1+CD150⁺CD34−^/loFlk2⁻) HSC'ler (bundan böyle pHSC'ler) daha önce fonksiyonel olarak homojen olarak kabul edildi. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan tek hücreli analizler, pHSC'lerin hala kendini yenileme kapasiteleri^9,10 ve multipotens^11,12 açısından heterojenlik sergilediklerini ortaya koymuştur. Spesifik olarak, pHSC fraksiyonunda kendini yenileme kapasiteleri açısından iki popülasyon var gibi görünmektedir: sürekli kendini yenileme kapasitesine sahip uzun süreli hematopoetik kök hücreler (LT-HSC'ler) ve geçici kendini yenileme kapasitesine sahip kısa süreli hematopoetik kök hücreler (ST-HSC'ler) ^9,10.

Bugüne kadar, LT-HSC'leri ve ST-HSC'leri birbirinden ayıran kendini yenileme kapasitesinin moleküler mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır. Her iki hücre popülasyonunu da kendini yenileme kapasitelerine göre izole etmek ve altta yatan moleküler mekanizmaları keşfetmek çok önemlidir. LT-HSC'leri saflaştırmak için çeşitli muhabir sistemleri de tanıtılmıştır^13,14,15; Bununla birlikte, her bir muhabir sistemi tarafından tanımlanan LT-HSC saflığı değişkendir ve bugüne kadar özel LT-HSC saflaştırması sağlanamamıştır.

Bu nedenle, LT-HSC'ler ve ST-HSC'ler için bir izolasyon sistemi geliştirmek, pHSC fraksiyonunda kendini yenileme kapasitesi ile ilgili araştırmaları hızlandıracaktır. LT-HSC'lerin ve ST-HSC'lerin izolasyonunda, çok adımlı, tarafsız tarama kullanan bir çalışma, pHSC fraksiyonu^16'da heterojen olarak ifade edilen tek bir gen, Hoxb5'i tanımladı. Ek olarak, Hoxb5 muhabir farelerinin kemik iliği analizi, pHSC fraksiyonunun yaklaşık% 20-25'inin Hoxb5 ^pos hücrelerinden oluştuğunu ortaya koymuştur. Hoxb5^pos pHSC'ler ve Hoxb5^neg pHSC'ler kullanılarak yapılan rekabetçi bir transplantasyon testi, sadece Hoxb5 pos pHSC'lerin uzun vadeli kendini yenileme kapasitesine sahip olduğunu, Hoxb5^neg pHSC'lerin ise kısa bir süre içinde kendini yenileme kapasitelerini kaybettiğini ortaya koymuştur ve bu da Hoxb5'in pHSC fraksiyonu^16'da LT-HSC'leri tanımladığını göstermektedir.

Burada, Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak LT-HSC'leri ve ST-HSC'leri izole etmek için adım adım bir protokol gösteriyoruz. Ek olarak, Hoxb5^pos/neg pHSC'lerin kendini yenileme kapasitesini değerlendirmek için rekabetçi bir transplantasyon testi sunuyoruz (Şekil 1). Bu Hoxb5 raporlayıcı sistemi, LT-HSC'leri ve ST-HSC'leri ileriye dönük olarak izole etmemizi sağlar ve LT-HSC'ye özgü özelliklerin anlaşılmasına katkıda bulunur.

Protokol

Açıklanan tüm hayvan deneyleri RIKEN Biyosistem Dinamiği Araştırma Merkezi tarafından onaylanmıştır.

1. Alıcı farelerin ön koşullandırması

1. 8-10 haftalık erkek C57BL/6 konjenik fareleri alıcı fareler olarak hazırlayın. Alıcı farelerin sayısı deneysel protokole bağlıdır. Genellikle her durum için 10-20 fare hazırlarız.
   1. Fareleri enrofloksasin (170 mg / L) ile desteklenmiş sterilize edilmiş suyla besleyin. Işınlanmış alıcı fareler enfeksiyona karşı oldukça hassas olduklarından, kafesleri mümkün olduğunca temiz tutun.
      NOT: Antibiyotiklerle takviye, ışınlamadan 24 saat önce başlar ve enfeksiyonları önlemek için transplantasyondan sonra 3 hafta boyunca devam eder.
2. Toplam vücut ışınlaması
   1. Total vücut ışınlaması, donör hücrelerin engraftasyonunu sağlamak için alıcı kemik iliği hücrelerini yok eder. Alıcı fareleri bir ışınlama kafesine aktarın. Transplantasyondan önce alıcı fareleri 12-16 saatte tek bir doz 8.7 Gy ile lethally ışınlayın.
      NOT: Radyasyon dozu ve süresi ekipmana bağlı olarak değişebilir. Ölümcül radyasyon dozu, araştırmacının ışınlayıcısı ve fare suşu ile doğrulanmalıdır.
   2. Tüm vücut ışınlamasından sonra onları kafeslerine geri getirin.

2. Donör kemik iliği hücrelerinin toplanması

1. 12 haftalık bir erkek Hoxb5-tri-mCherry faresi hazırlayın ve fareyi CO_2'ye maruz kalmanın ardından servikal çıkık veya yerel hayvan etik komitesi tarafından onaylanan yöntemleri kullanarak ötenazi yapın.
   NOT: Fare başına reaktif hacmi aşağıdaki adımlarda açıklanmıştır.
2. Steril koşullar altında, cildi çıkarın ve kemikleri (femur, tibia, pelvis, humerus) açığa çıkarın. Ana kasları kesin ve kemikleri (femur, tibia, pelvis, humerus) fareden alın. Onları Ca 2⁺ - ve Mg^{2 +} içermeyen, buz gibi soğuk PBS içeren steril hücre kültürü kaplarına yerleştirin.
3. Kirlenmeyi önlemek için cımbız, küçük makas ve mendil kullanarak kasları ve fibröz dokuları kemiklerden kesin. Bu adımda kemikleri kırmamaya dikkat edin. Kısırlığı korumak için kırık kemikleri atın.
4. Bir harç ve havaneyi% 70 etanol (EtOH) ile sterilize edin ve tamamen kurumasını bekleyin. Hücre boyama tamponu ile dengeleyin (% 2 ısı ile inaktive FBS, 2 mM EDTA, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş Ca² + - ve Mg^{2 +} içermeyen PBS).
5. Kemikleri harç içine koyun ve 3 mL hücre boyama tamponu ekleyin. Kemikleri havaneyle açık olarak ezin. Hücre kümelerini nazik pipetleme ile ayrıştırın ve hücre süspansiyonunu 100 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
6. Çözüm netleşene kadar adım 2.5'i tekrarlayın. Genellikle üç kez yeterlidir.

3. C-kit ⁺ hücrelerinin manyetik sıralama ile ayrılması

1. Manyetik ayıklama için antikor boyama
   1. Numuneleri 400 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı aspire edin ve peletleri 1 mL hücre boyama tamponunda yeniden askıya alın. Spesifik olmayan antikor bağlanmasını azaltmak için 10 μL sıçan-IgG (5 mg/mL) ekleyin ve bir P1.000 pipet kullanarak hafifçe yukarı ve aşağı pipet uygulayın. 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   2. c-Kit antikorunu (klon 2B8) 4 μg/mL konsantrasyonda ekleyin ve P1.000 pipetle karıştırın. 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   3. 5 mL hücre boyama tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Numuneleri 400 x g, 4 °C, 5 dk'da santrifüj edin. Süpernatanı aspire edin ve peleti 500 μL hücre boyama tamponunda yeniden askıya alın.
   4. ^c-Kit+ hücrelerini zenginleştirmek için 35 μL anti-APC mikroboncuk ekleyin ve bir P1.000 pipetle karıştırın. 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   5. 4-5 mL hücre boyama tamponu ekleyin. Numuneleri 400 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı aspire edin ve peletleri 1 mL hücre boyama tamponunda yeniden askıya alın.
2. c-Kit⁺ hücrelerinin manyetik olarak sıralanması
   1. Hücreleri sıralamak için üreticinin yönergelerini izleyin. Kısacası, 3 mL hücre boyama tamponuna sahip manyetik bir sıralama sütunu alayın. Numuneyi (1 mL) 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve numuneyi manyetik sıralama sütununa yükleyin.
   2. Üç kez 3 mL hücre boyama tamponu ekleyerek yıkayın. Hücre boyama arabelleğini yalnızca sütun haznesi boşken ekleyin.
   3. Manyetik sıralama sütununu buz gibi soğuk 15 mL'lik bir tüpün üzerine koyun ve 5 mL hücre boyama tamponu ekleyin. Pistonu kolonun içine sıkıca iterek hücreleri yıkayın. Akışı buz üzerinde tutun.
      NOT: Kazara numune kaybı durumunda, akışı deneyin sonuna kadar tutarız.

4. Hematopoetik kök hücre boyama

1. Adım 3.2.3'te hazırlanan numuneyi 400 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı aspire et.
2. CD34 antikorunu (klon RAM34) peletin üzerine 50 μg / mL konsantrasyonda ekleyin ve 60 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   NOT: İşlem süresini kısaltmak için CD34 ile inkübasyonun ilk saatinde destekleyici hücrelerin hazırlanması önerilir.
3. Antikor ana karışımını Tablo 1'e göre hazırlayın. Numuneye 100 μL ana karışım ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin. CD34 antijeni için antikor (klon; RAM34) yeterli boyama için 90 dakika gerektirir.
4. 4-5 mL hücre boyama tamponu ekleyin. Numuneyi 400 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı aspire et. Peletin üzerine 3 μg/mL konsantrasyonda streptavidin-BUV737 ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
5. 4-5 mL hücre boyama tamponu ekleyin. Numuneyi 400 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı aspire edin ve peleti 400 μL hücre boyama tamponunda yeniden askıya alın. Numuneyi buz üzerinde tutun.

5. Destekleyici hücre hazırlığı

1. 12 haftalık bir CD45.1+ CD45.2⁺ konjenik fare hazırlayın; İdeal olarak, bu donör fare ile aynı yaşta olmalıdır. Fareyi CO₂ maruziyeti, ardından servikal çıkık veya yerel hayvan etik komitesi tarafından onaylanan yöntemleri kullanarak ötenazi yapın.
   NOT: Verilen örnekte, CD45.1+ CD45.2⁺ konjenik fareler B6'yı geçerek şirket içinde yetiştirilmiştir. CD45.1 C57BL/6J fareler ile konjenik fareler¹⁶.
2. Steril koşullar altında, hem femurları hem de tibiaları alın ve bunları Ca 2 + - ve Mg^{2 +} içermeyen, buz gibi soğuk PBS içeren steril hücre kültürü kaplarına yerleştirin. Cımbız ve küçük makas kullanarak kasları ve fibröz dokuları kemiklerden kesin.
3. Kemiklerin her iki ucunu keskin, steril makasla kesin. Kemik iliğini hücre süspansiyon tamponlu steril bir hücre kültürü kabına yıkamak için 23 G iğne ve buz gibi soğuk hücre süspansiyon tamponu (% 2 ısı ile inaktive FBS, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş Ca² + - ve Mg^{2 +} içermeyen PBS) ile doldurulmuş 5 mL'lik bir şırınga kullanın. Hücre kümelerini nazik pipetleme ile ayrıştırın.
4. Hücre süspansiyonunu P1.000 pipet kullanarak 40 μm hücre süzgecinden geçirin. Bir hemositometre kullanarak hücre süspansiyonunun hücre sayısını sayın ve 1 x 10⁶ hücre / mL içeren bir kemik iliği hücre süspansiyonu hazırlayın.
5. Kemik iliği hücre süspansiyonunun 200 μL'sini (2 x 10⁵ hücre) 96 kuyulu, yuvarlak tabanlı bir plakaya aktarın. Kullanana kadar buz üzerinde tutun.
   NOT: Kolay hücre toplanması için yuvarlak tabanlı plakalar önerilir.

6. Hoxb5^pos veya Hoxb5^neg pHSC sıralama

1. Geçit kurulumu
   1. Adım 4.5'te hazırlanan numunenin 400 μL'sini, 35 μm hücre süzgeci çıtçıtlı kapağı olan yuvarlak tabanlı bir polistiren test tüpüne aktarın. Ölü hücre boyama reaktifi hazırlayın ve üreticinin talimatlarına göre analizden önce numuneye ekleyin.
   2. Bir akış sitometresi açın ve analiz yazılımını üreticinin talimatlarına göre başlatın. Ardından, Yükle'ye basın ve verileri alın.
      NOT: Sıralanan hücrelerin saflığını arttırmak için beş lazer ve 70 μm nozul ile donatılmış bir akış sitometresi önerilir.
   3. Çiftleri, ölü hücreleri ve soy-pozitif hücreleri hariç tuttuktan sonra, Soy-c-Kit + ^{Sca-1 +} fraksiyonunu açın. Ardından, Flk2⁺ fraksiyonunu dışarı çıkarın. Daha sonra, CD150 ⁺ CD34 ^{− / düşük} fraksiyondaki kapı Hoxb5^pos veya Hoxb5^neg pHSC'ler (Şekil 2). İlk deneyde spektral örtüşme için telafi gerçekleştirin.
      NOT: Hoxb5 pozitif hücrelerin Soy-c-Kit⁺Sca-1⁺CD150⁺CD34−^/düşükFlk2⁻ fraksiyonunun %20-%25'ini temsil etmesi beklenir.
2. Hoxb5^pos veya Hoxb5^neg pHSC sıralama
   1. % 10 ısı ile inaktive FBS ile desteklenmiş 600 μL Ca 2 + - ve Mg^{2 +} içermeyen PBS içeren 1.5 mL düşük proteinli bir bağlama tüpü hazırlayın.
   2. 1,5 mL düşük proteinli bağlanma tüpünü bir sıralama toplama cihazına yerleştirin ve adım 6.1.3'te belirlenen geçit stratejisini kullanarak Hoxb5^pos veya Hoxb5^neg pHSC'leri 1,5 mL tüpe sıralayın. İlk sıralamada, sıralama hassasiyeti modundaki verimi kullanın.
   3. 96 delikli plakayı, otomatik hücre biriktirme birimi (ACDU) aşamasında adım 5.5'te hazırlanan destekleyici hücrelerle ayarlayın. Adım 6.2.2'de hazırlanan 1,5 mL düşük proteinli bağlayıcı tüpü bir akış sitometresinin yükleme portuna ayarlayın.
   4. Adım 6.1.3'te belirlenen geçit stratejisini kullanarak Hoxb5^pos veya Hoxb5^neg pHSC'leri, destekleyici hücrelerle birlikte 96 delikli bir plakaya sıralayın. Kendi kendini yenileme kapasitelerini test etmek için 10 Hoxb5^pos veya Hoxb5^neg pHSC'yi sıralayın.
      NOT: Saflığı artırmak için çift sıralama önerilir. İkinci sıralamada, önerilen sıralama hassasiyeti modu olarak saflığı kullanın.
   5. Tipik olarak, 500-1.000 Hoxb5^pos pHSC ve 1.500-4.000 Hoxb5^neg pHSC, çift sıralamadan sonra hasat edilir. Hücre canlılığını arttırmak için HSC sıralamasından sonra mümkün olan en kısa sürede transplantasyon prosedürlerine devam edin (ideal olarak 1-2 saat içinde).

7. Transplantasyon

1. Adım 6.2.4'te hazırlanan HSC sıralı, 96 delikli plakayı buzun üzerine yerleştirin. HSC sıralı, 96 delikli plakayı steril koşullarda, ideal olarak bir hücre davlumbazında tutun.
2. Bir alıcı fareyi gaz anestezi indüksiyon odasında% 2 izofluran ile uyuşturun. Hayvan tamamen uyuşturulduktan sonra, çıkarın ve yanına yerleştirin. Yeterli anesteziyi sağlamak için, zararlı bir uyarana yanıt olarak hiçbir hareketi onaylayın.
3. Uygun anestezinin onaylanmasından sonra, farenin bilincini yeniden kazanmasını önlemek için mümkün olan en kısa sürede retro-orbital enjeksiyon yapın. Retro-orbital enjeksiyon 30 saniyeden az sürer.
   NOT: Enjeksiyon süresi kısa olduğu için gözlere oftalmik merhem sürmeden işlemi bitiriyoruz. Bununla birlikte, prosedür daha uzun sürerse, oftalmik merhem kullanılmasını öneririz.
4. HSC'de sıralanmış 96 delikli plakadaki hücreleri karıştırmak için nazikçe pipetleyin. Donör hücreleri 30 G insülin şırıngası kullanarak sıralama plakasında toplayın ve bunları alıcı farelerin retro-orbital venöz pleksusuna enjekte edin. Önerilen enjekte edilebilir hacim ≤200 μL'dir.
5. Fareler bilinçli olana ve temiz bir kafeste hareket edene kadar gözlemleyin. İyileşmelerini onayladıktan sonra onları kafeslerine geri getirin.

8. Periferik kan analizi

1. Kuyruk damarından 50 μL periferik kan toplayın ve 2 mM EDTA ile 100 μL Ca² + - ve Mg^{2 +} içermeyen PBS ile yeniden askıya alın. Tüm numuneleri 96 delikli bir plakaya aktarın. 400 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
2. 200 μL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin ve 3 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Numuneleri 400 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı atın. Bir kez daha tekrarlayın.
3. 200 μL hücre boyama tamponu ekleyin. Numuneleri 400 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı atın.
4. Antikor ana karışımını Tablo 2'ye göre hazırlayın. 50 μL antikor ana karışımı ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
5. 150 μL hücre boyama tamponu ekleyin. Numuneleri 400 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı atın.
6. 200 μL hücre boyama tamponu ekleyin. Numuneleri 400 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı atın. 200 μL hücre boyama tamponunda tekrar askıya alın ve üreticinin talimatlarına göre analizden önce ölü hücre boyama reaktifi ekleyin.
7. Daha önce tarif edildiği gibi bir akış sitometresi kullanarak periferik kan kimerizmini analiz edin¹⁶. Çok soylu sulandırmayı takip etmek için transplantasyondan 4 hafta, 8 hafta, 12 hafta ve 16 hafta sonra kan toplayın. Temsili akım sitometri grafikleri Şekil 3'te verilmiştir.

Sonuçlar

Önceden, kendini yenileme kapasitesi, donör HSC'lerin kendilerini yenileme kapasitelerini ancak alıcı periferik kandaki çok soylu donör hücreleri gözlenirse korudukları düşünülen rekabetçi transplantasyon testleri kullanılarak ölçülmüştür¹⁷. Ek olarak, birkaç rapor LT-HSC'leri ikinci kemik iliği transplantasyonundan birkaç ay sonra periferik kan hücreleri üretmeye devam eden hücreler olarak tanımlamaktadır^10,18...

Tartışmalar

Geleneksel olarak, hücre yüzey belirteci tanımlı HSC'ler, HSC'lerin kendini yenileme kapasitesi ve çoklu potens ^19,20,21 gibi işlevlerini incelemek için hazırlanmıştır. Bununla birlikte, immünofenotipik olarak tanımlanan (Soy-c-Kit + Sca-1 + CD150 ⁺ CD34 ^{− / lo}Flk2 ⁻) HSC fraksiyonu iki ayrı HSC popülasyonu içerir: LT-HSC'ler ve ^{ST-HSC'ler...}

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap	SSIbio	3230-00
0.5M EDTA pH 8.0	Iinvtrogen	AM9260G
100 µm Cell Strainer	Falcon	352360
30G insulin syringe	BD	326668
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	FALCON	352235
7-AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420404
96 well U-Bottom	FALCON	351177
Anti-APC-MicroBeads	Milteny biotec	130-090-855
Aspirator with trap flask	Biosan	FTA-1
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)	BioLegend	103232
B220-Biotin (RA3-6B2)	BioLegend	103204
B220-BV786 (RA3-6B2)	BD Biosciences	563894
B6.CD45.1 congenic mice	Sankyo Labo Service	N/A
Baytril 10%	BAYER	341106546
BD FACS Aria II special order system	BD	N/A
Brilliant stain buffer	BD	566349
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)	BioLegend	101222
CD11b-Biotin (M1/70)	BioLegend	101204
CD11b-BUV395 (M1/70)	BD Biosciences	563553
CD11b-BV711 (M1/70)	BD Biosciences	563168
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)	Invitrogen	56-1271-82
CD150-BV421 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115943
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)	Invitrogen	56-0161-82
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)	BD Biosciences	560230
CD34-FITC (RAM34)	Invitrogen	11034185
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)	BioLegend	100216
CD3ε -Biotin (145-2C11)	BioLegend	100304
CD3ε -BV421 (145-2C11)	BioLegend	100341
CD45.1/CD45.2 congenic mice	N/A	N/A	Bred in our Laboratory
CD45.1-FITC (A20)	BD Biosciences	553775
CD45.2-PE (104)	BD Biosciences	560695
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)	BioLegend	100430
CD4-Biotin (GK1.5)	BioLegend	100404
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)	BioLegend	100730
CD8a-Biotin (53-6.7)	BioLegend	100704
Centrifuge Tube 15ml	NICHIRYO	00-ETS-CT-15
Centrifuge Tube 50ml	NICHIRYO	00-ETS-CT-50
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)	Invitrogen	47117182
D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid	Nacalai	14249-24
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10270106
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)	eBioscience	46135182
FlowJo version 10	BD Biosciences	https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Gmmacell 40 Exactor	Best theratronics	N/A
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)	BioLegend	108422
Gr-1-Biotin (RB6-8C5)	BioLegend	108404
Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background)	N/A	N/A	Bred in our Laboratory
IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution	Sigma-Aldrich	I8015-100MG
isoflurane	Pfizer	4987-114-13340-3
Kimwipes S200	NIPPON PAPER CRECIA	6-6689-01
LS Columns	Milteny biotec	130-042-401
Lysis buffer	BD	555899
MACS  MultiStand	Milteny biotec	130-042-303
Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well	IWAKI	3810-006
MidiMACS Separator	Milteny biotec	130-042-302
Mouse Pie Cages	Natsume Seisakusho	KN-331
Multipurpose refrigerated Centrifuge	TOMY	EX-125
NARCOBIT-E (II)	Natsume Seisakusho	KN-1071-I
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)	BioLegend	108728
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution	nacalai	26253-84
Porcelain Mortar φ120mm with Pestle	Asone	6-549-03
Protein LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431081
Sca-I-BUV395 (D7)	BD Biosciences	563990
Stainless steel scalpel blade	FastGene	FG-B2010
Streptavidin-BUV737	BD Biosciences	612775
SYTOX-red	Invitrogen	S34859
Tailveiner Restrainer for Mice standard	Braintree	TV-150 STD
TCRb-BV421 (H57-597)	BioLegend	109230
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)	BioLegend	116220
Ter-119-Biotin (TER-119)	BioLegend	116204
Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe	TERUMO	SS-05LZ
Terumo Hypodermic Needle 23G x 1	TERUMO	NN-2325-R