PROCÉDÉ D’ISOLEMENT DE CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES À LONG ET À COURT TERME

Résumé

Nous présentons un protocole étape par étape pour l’isolement des cellules souches hématopoïétiques à long terme (LT-HSC) et des CSH à court terme (ST-HSC) à l’aide du système rapporteur Hoxb5.

Résumé

La capacité d’auto-renouvellement et le potentiel de différenciation multi-lignée sont généralement considérés comme les caractéristiques déterminantes des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Cependant, de nombreuses études ont suggéré qu’une hétérogénéité fonctionnelle existe dans le compartiment HSC. Des analyses récentes de cellules uniques ont rapporté des clones de CSH avec des destins cellulaires différents dans le compartiment des CSH, appelés clones de CSH biaisés. Les mécanismes sous-jacents aux résultats hétérogènes ou peu reproductibles sont peu compris, notamment en ce qui concerne la durée de l’auto-renouvellement lorsque des fractions de CSH purifiées sont transplantées par immunomarquage classique. Par conséquent, l’établissement d’une méthode d’isolation reproductible pour les CSH à long terme (CSH-LT) et les CSH à court terme (CSS-ST), définies par la durée de leur auto-renouvellement, est crucial pour surmonter ce problème. En utilisant un dépistage non biaisé en plusieurs étapes, nous avons identifié un facteur de transcription, Hoxb5, qui pourrait être un marqueur exclusif des CSL-LT dans le système hématopoïétique de la souris. Sur la base de cette découverte, nous avons établi une lignée de souris rapporteures Hoxb5 et isolé avec succès les LT-HSC et les ST-HSC. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’isolation des LT-HSC et des ST-HSC à l’aide du système de rapporteur Hoxb5 . Cette méthode d’isolement aidera les chercheurs à mieux comprendre les mécanismes d’auto-renouvellement et la base biologique d’une telle hétérogénéité dans le compartiment HSC.

Introduction

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH), qui possèdent une capacité d’auto-renouvellement et de multipotence, résident au sommet de la hiérarchie hématopoïétique ^1,2. En 1988, Weissman et ses collègues ont démontré pour la première fois que l’isolement des CSH de souris pouvait être réalisé en utilisant la cytométrie^{de flux 3}. Par la suite, une fraction définie par une combinaison de marqueurs de surface cellulaire, Lineage⁻c-Kit⁺Sca-1+CD150⁺CD34−^/loFlk2⁻, a été signalée comme contenant toutes les CSH chez les souris 4,5,6,7,8.

Les CSH définies immunophénotypiquement (Lineage⁻c-Kit⁺Sca-1+CD150⁺CD34−^/loFlk2⁻) (ci-après, les CSHp) étaient auparavant considérées comme fonctionnellement homogènes. Cependant, des analyses récentes sur une seule cellule ont révélé que les CSHp présentent toujours une hétérogénéité en ce qui concerne leur capacité d’auto-renouvellement 9,10 et leur multipotence^11,12. Plus précisément, deux populations semblent exister dans la fraction des CSHp en ce qui concerne leur capacité d’auto-renouvellement : les cellules souches hématopoïétiques à long terme (CSH-LT), qui ont une capacité d’auto-renouvellement continue, et les cellules souches hématopoïétiques à court terme (CSS-ST), qui ont une capacité d’auto-renouvellement transitoire ^9,10.

À ce jour, les mécanismes moléculaires de la capacité d’auto-renouvellement qui distinguent les CSL-LT et les CST-ST restent mal compris. Il est crucial d’isoler les deux populations cellulaires en fonction de leurs capacités d’auto-renouvellement et de découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents. Plusieurs systèmes rapporteurs ont également été introduits pour purifier les LT-HSC^13,14,15; cependant, la pureté LT-HSC définie par chaque système rapporteur est variable, et la purification exclusive LT-HSC n’a pas été atteinte à ce jour.

Par conséquent, le développement d’un système d’isolation pour les CSL-LT et les CSS-ST accélérera la recherche sur la capacité d’auto-renouvellement dans la fraction des CSHp. Dans l’isolement des CSH-LT et des CSS-ST, une étude utilisant un criblage non biaisé en plusieurs étapes a identifié un seul gène, Hoxb5, qui est exprimé de manière hétérogène dans la fraction¹⁶ des CSp. De plus, l’analyse de la moelle osseuse des souris rapporteures Hoxb5 a révélé qu’environ 20% à 25% de la fraction pHSC est constituée de cellules^Pos Hoxb5. Un test de transplantation compétitif utilisant des CSp Hoxb5 pos et des CSp négatives Hoxb5 a révélé que seuls les CSp Hoxb5 ^pos possèdent une capacité d’auto-renouvellement à long terme, tandis que les CSPp Hoxb5^neg perdent leur capacité d’auto-renouvellement en peu de temps, ce qui indique que Hoxb5 identifie les CSH-LT dans la fraction¹⁶ des CSPp.

Ici, nous démontrons un protocole étape par étape pour isoler les LT-HSC et les ST-HSC à l’aide du système de rapporteur Hoxb5 . De plus, nous présentons un test de transplantation compétitif pour évaluer la capacité d’auto-renouvellement des CSp Hoxb5^pos/neg (Figure 1). Ce système de rapporteur Hoxb5 nous permet d’isoler de manière prospective les LT-HSC et les ST-HSC et contribue à la compréhension des caractéristiques spécifiques aux LT-HSC.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.

1. Préconditionnement des souris receveuses

1. Préparer les souris congéniques C57BL/6 mâles âgées de 8 à 10 semaines comme souris receveuses. Le nombre de souris receveuses dépend du protocole expérimental. Nous préparons généralement 10 à 20 souris pour chaque condition.
   1. Nourrissez les souris avec de l’eau stérilisée additionnée d’enrofloxacine (170 mg/L). Comme les souris receveuses irradiées sont très sensibles à l’infection, gardez les cages aussi propres que possible.
      REMARQUE: La supplémentation en antibiotiques commence 24 heures avant l’irradiation et se poursuit pendant 3 semaines après la transplantation pour éviter les infections.
2. Irradiation corporelle totale
   1. L’irradiation corporelle totale détruit les cellules de moelle osseuse receveuses pour assurer la greffe des cellules donneuses. Transférer les souris receveuses dans une cage d’irradiation. Irradier mortellement les souris receveuses avec une dose unique de 8,7 Gy à 12-16 h avant la transplantation.
      REMARQUE : La dose de rayonnement et le temps peuvent varier selon l’équipement. La dose de rayonnement létale doit être confirmée par l’irradiateur et la souche de souris du chercheur.
   2. Remettez-les dans leurs cages après l’irradiation corporelle totale.

2. Prélèvement des cellules de moelle osseuse du donneur

1. Préparer une souris Hoxb5-tri-mCherry mâle âgée de 12 semaines et euthanasier la souris par exposition au CO₂ suivie d’une luxation cervicale ou en utilisant des méthodes approuvées par le comité local d’éthique animale.
   Remarque : Le volume de réactif par souris est décrit dans les étapes suivantes.
2. Dans des conditions stériles, retirez la peau et exposez les os (fémur, tibia, bassin, humérus). Coupez les principaux muscles et prenez les os (fémur, tibia, bassin, humérus) de la souris. Placez-les dans des boîtes de culture cellulaire stériles avec du PBS glacé sans Ca 2+ et Mg²⁺.
3. Coupez les muscles et les tissus fibreux des os à l’aide d’une pince à épiler, de petits ciseaux et de lingettes pour éviter la contamination. Veillez à ne pas casser les os lors de cette étape. Jetez tous les os cassés afin de maintenir la stérilité.
4. Stérilisez un mortier et un pilon avec de l’éthanol à 70% (EtOH) et laissez-les sécher complètement. Équilibrer avec un tampon de coloration cellulaire (PBS libre de Ca 2+ et Mg²⁺ complété par 2% de FBS inactivé par la chaleur, 2 mM d’EDTA, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine).
5. Mettez les os dans le mortier et ajoutez 3 mL de tampon de coloration cellulaire. Écrasez les os avec le pilon. Désagrégez les amas de cellules par pipetage doux et transférez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 100 μm dans un tube de 50 mL.
6. Répétez l’étape 2.5 jusqu’à ce que la solution devienne claire. Habituellement, trois fois suffisent.

3. Séparation des cellules c-kit⁺ par tri magnétique

1. Coloration d’anticorps pour le tri magnétique
   1. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de coloration cellulaire. Ajouter 10 μL d’IgG de rat (5 mg/mL) pour réduire la liaison aux anticorps non spécifiques, et pipeter doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette P1 000. Incuber sur la glace pendant 15 min.
   2. Ajouter l’anticorps c-Kit (clone 2B8) à une concentration de 4 μg/mL et mélanger avec une pipette P1 000. Incuber sur la glace pendant 15 min.
   3. Ajouter 5 mL de tampon de coloration cellulaire et bien mélanger. Centrifuger les échantillons à 400 x g, 4 °C, 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de tampon de coloration cellulaire.
   4. Ajouter 35 μL de microbilles anti-APC pour enrichir les cellules c-Kit⁺ et mélanger avec une pipette P1,000. Incuber sur la glace pendant 15 min.
   5. Ajouter 4-5 mL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de coloration cellulaire.
2. Tri magnétique des cellules c-Kit⁺
   1. Suivez les instructions du fabricant pour trier les cellules. En bref, amorcez une colonne de tri magnétique avec 3 mL de tampon de coloration cellulaire. Filtrer l’échantillon (1 mL) à travers une passoire à cellules de 40 μm et charger l’échantillon sur la colonne de tri magnétique.
   2. Laver en ajoutant trois fois 3 ml de tampon de coloration cellulaire. Ajoutez le tampon de coloration de cellule uniquement lorsque le réservoir de colonne est vide.
   3. Placez la colonne de tri magnétique sur un tube glacé de 15 ml et ajoutez 5 ml de tampon de coloration cellulaire. Rincez les cellules en poussant fermement le piston dans la colonne. Gardez le flux sur la glace.
      REMARQUE: En cas de perte accidentelle de l’échantillon, nous conservons le flux jusqu’à la fin de l’expérience.

4. Coloration des cellules souches hématopoïétiques

1. Centrifuger l’échantillon préparé à l’étape 3.2.3 à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
2. Ajouter l’anticorps CD34 (clone RAM34) à une concentration de 50 μg/mL à la pastille et incuber sur de la glace pendant 60 min.
   NOTE: La préparation des cellules de support pendant la première heure d’incubation avec CD34 est recommandée pour raccourcir le temps de traitement.
3. Préparer le mélange principal d’anticorps conformément au tableau 1. Ajouter 100 μL du mélange principal à l’échantillon et incuber sur de la glace pendant 30 minutes. L’anticorps de l’antigène CD34 (clone; RAM34) nécessite 90 min pour une coloration suffisante.
4. Ajouter 4-5 mL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger l’échantillon à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Ajouter la streptavidine-BUV737 à une concentration de 3 μg/mL à la pastille et incuber sur de la glace pendant 30 min.
5. Ajouter 4-5 mL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger l’échantillon à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 400 μL de tampon de coloration cellulaire. Conservez l’échantillon sur la glace.

5. Préparation des cellules de soutien

1. Préparer une souris congénique CD45.1+ CD45.2⁺ âgée de 12 semaines; Idéalement, cela devrait avoir le même âge que la souris donneuse. Euthanasier la souris par exposition au CO₂ suivie d’une luxation cervicale ou en utilisant des méthodes approuvées par le comité local d’éthique animale.
   REMARQUE : Dans l’exemple fourni, des souris congéniques CD45.1+ CD45.2⁺ ont été élevées en interne par croisement B6. Souris congéniques CD45.1 avec souris C57BL/6J¹⁶.
2. Dans des conditions stériles, prenez à la fois des fémurs et des tibias, et placez-les dans des boîtes de culture cellulaire stériles avec du PBS glacé sans Ca 2+ et Mg²⁺. Coupez les muscles et les tissus fibreux des os à l’aide d’une pince à épiler et de petits ciseaux.
3. Coupez les deux extrémités des os avec des ciseaux tranchants et stériles. Utilisez une aiguille de 23 G et une seringue de 5 mL remplie d’un tampon de suspension cellulaire glacé (PBS sans Ca 2+ et Mg²⁺ complété par du FBS inactivé à 2 %, de la pénicilline 100 U/mL et de la streptomycine à 100 μg/mL) pour rincer la moelle osseuse dans une boîte de culture cellulaire stérile avec tampon de suspension cellulaire. Désagrégez les amas de cellules par pipetage doux.
4. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine à cellules de 40 μm à l’aide d’une pipette P1 000. Compter le numéro cellulaire de la suspension cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et préparer une suspension cellulaire de moelle osseuse contenant 1 x 10⁶ cellules/mL.
5. Transférer 200 μL de la suspension cellulaire de moelle osseuse (2 x 10⁵ cellules) dans une plaque à fond rond à 96 puits. Conserver sur la glace jusqu’à utilisation.
   REMARQUE: Les plaques à fond rond sont recommandées pour faciliter la collecte des cellules.

6. Tri Hoxb5^pos ou Hoxb5^neg pHSC

1. Configuration du point de contrôle
   1. Transférer 400 μL de l’échantillon préparé à l’étape 4.5 dans un tube à essai en polystyrène à fond rond muni d’un capuchon à pression de crépine cellulaire de 35 μm. Préparer le réactif de coloration des cellules mortes et l’ajouter à l’échantillon avant l’analyse conformément aux instructions du fabricant.
   2. Allumez un flowcytomètre et démarrez le logiciel d’analyse conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, appuyez sur Charger et acquérez les données.
      REMARQUE: Un cytomètre en flux équipé de cinq lasers et d’une buse de 70 μm est recommandé pour améliorer la pureté des cellules triées.
   3. Après avoir exclu les doublets, les cellules mortes et les cellules de lignée positive, la fraction Lineage⁻c-Kit+Sca-1⁺. Ensuite, sortez la fraction Flk2⁺. Ensuite, grille Hoxb5^pos ou Hoxb5^neg pHSCs dans la fraction CD150⁺CD34^−/faible (Figure 2). Effectuer une compensation pour le chevauchement spectral dans la première expérience.
      REMARQUE: Les cellules Hoxb5 positives devraient représenter 20% à 25% de la fraction Lineage⁻c-Kit⁺Sca-1+CD150⁺CD34−^/faibleFlk2⁻.
2. Hoxb5^pos ou Hoxb5^neg pHSC tri
   1. Préparez un tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 mL contenant 600 μL de PBS sans Ca 2+ et Mg²⁺ complété par 10 % de FBS inactivé par la chaleur.
   2. Placez le tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 mL sur un dispositif de collecte de tri et triez les^CSPp Hoxb5 pos ou Hoxb5^neg dans le tube de 1,5 mL en utilisant la stratégie de contrôle définie à l’étape 6.1.3. Dans le premier tri, utilisez le rendement du mode de précision de tri.
   3. Placer la plaque à 96 puits avec les cellules de support préparées à l’étape 5.5 sur l’étape de l’unité de dépôt de cellules automatisées (ACDU). Placer le tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 mL préparé à l’étape 6.2.2 sur l’orifice de chargement d’un cytomètre en flux.
   4. Triez les^{points de vente} Hoxb5 ou Hoxb5^neg pHSC dans une plaque de 96 puits avec les cellules de support en utilisant la stratégie de contrôle définie à l’étape 6.1.3. Triez 10^{Hoxb5 pos} ou Hoxb5^neg pHSC pour tester leurs capacités d’auto-renouvellement.
      NOTE: Un double tri est recommandé pour améliorer la pureté. Dans le deuxième tri, utilisez la pureté comme mode de précision de tri recommandé.
   5. En règle générale, 500 à 1 000 CSp Hoxb5^pos et 1 500 à 4 000 HCp Neg5 sont récoltés après double tri. Procéder aux procédures de transplantation dès que possible après le tri HSC pour améliorer la viabilité cellulaire (idéalement dans les 1-2 heures).

7. Transplantation

1. Déposer sur de la glace la plaque de 96 puits triée au CSH préparée à l’étape 6.2.4. Manipulez la plaque de 96 puits triée par HSC dans des conditions stériles, idéalement dans une hotte cellulaire.
2. Anesthésier une souris receveuse avec de l’isoflurane à 2% dans une chambre d’induction d’anesthésie gazeuse. Une fois que l’animal est complètement anesthésié, retirez-le et placez-le sur le côté. Pour assurer une anesthésie suffisante, confirmez l’absence de mouvement en réponse à un stimulus nocif.
3. Après la confirmation de l’anesthésie appropriée, effectuez une injection rétro-orbitaire dès que possible pour empêcher la souris de reprendre conscience. L’injection rétro-orbitale prend moins de 30 s.
   REMARQUE: Comme le temps d’injection est court, nous terminons la procédure sans appliquer de pommade ophtalmique dans les yeux. Cependant, si la procédure prend plus de temps, nous recommandons l’utilisation d’une pommade ophtalmique.
4. Pipeter doucement les cellules dans la plaque de 96 puits triée HSC pour les mélanger. Prélever les cellules donneuses dans la plaque de tri à l’aide d’une seringue à insuline de 30 G et les injecter dans le plexus veineux rétro-orbitaire des souris receveuses. Le volume injectable recommandé est de ≤200 μL.
5. Observez jusqu’à ce que les souris soient conscientes et se déplacent dans une cage propre. Remettez-les dans leurs cages après avoir confirmé leur rétablissement.

8. Analyse du sang périphérique

1. Prélever 50 μL de sang périphérique dans la veine de la queue et le remettre en suspension avec 100 μL de PBS sans Ca 2+- et Mg²⁺ avec 2 mM d’EDTA. Transférer tous les échantillons dans une plaque de 96 puits. Centrifuger à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant.
2. Ajouter 200 μL de tampon de lyse des globules rouges et incuber sur de la glace pendant 3 min. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant. Répétez une fois de plus.
3. Ajouter 200 μL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant.
4. Préparer le mélange principal d’anticorps conformément au tableau 2. Ajouter 50 μL de mélange principal d’anticorps et incuber sur de la glace pendant 30 minutes.
5. Ajouter 150 μL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant.
6. Ajouter 200 μL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant. Remettez en suspension dans 200 μL de tampon de coloration cellulaire et ajoutez le réactif de coloration des cellules mortes avant l’analyse conformément aux instructions du fabricant.
7. Analyser le chimérisme du sang périphérique à l’aide d’un cytomètre en flux comme décrit précédemment¹⁶. Prélever du sang à 4 semaines, 8 semaines, 12 semaines et 16 semaines après la transplantation pour suivre la reconstitution multi-lignée. Des diagrammes de cytométrie en flux représentatifs sont fournis à la figure 3.

Résultats

Auparavant, la capacité d’auto-renouvellement était mesurée à l’aide de tests de transplantation compétitifs, dans lesquels on pensait que les CSH du donneur ne conservaient leur capacité d’auto-renouvellement que si des cellules de donneurs multi-lignées dans le sang périphérique du receveur sont observées¹⁷. De plus, plusieurs rapports définissent les CSH-LT comme des cellules qui continuent à produire des cellules sanguines périphériques plusieurs mois après la deuxième gr...

Discussion

Traditionnellement, les CSH définies par marqueurs de surface cellulaire ont été préparées pour étudier les fonctions des CSH, telles que la capacité d’auto-renouvellement et la multipuissance 19,20,21. Cependant, la fraction de CSH définie immunophénotypiquement (Lineage⁻c-Kit⁺Sca-1+CD150⁺CD34−^/loFlk2⁻) contient deux populations distin...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap	SSIbio	3230-00
0.5M EDTA pH 8.0	Iinvtrogen	AM9260G
100 µm Cell Strainer	Falcon	352360
30G insulin syringe	BD	326668
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	FALCON	352235
7-AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420404
96 well U-Bottom	FALCON	351177
Anti-APC-MicroBeads	Milteny biotec	130-090-855
Aspirator with trap flask	Biosan	FTA-1
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)	BioLegend	103232
B220-Biotin (RA3-6B2)	BioLegend	103204
B220-BV786 (RA3-6B2)	BD Biosciences	563894
B6.CD45.1 congenic mice	Sankyo Labo Service	N/A
Baytril 10%	BAYER	341106546
BD FACS Aria II special order system	BD	N/A
Brilliant stain buffer	BD	566349
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)	BioLegend	101222
CD11b-Biotin (M1/70)	BioLegend	101204
CD11b-BUV395 (M1/70)	BD Biosciences	563553
CD11b-BV711 (M1/70)	BD Biosciences	563168
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)	Invitrogen	56-1271-82
CD150-BV421 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115943
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)	Invitrogen	56-0161-82
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)	BD Biosciences	560230
CD34-FITC (RAM34)	Invitrogen	11034185
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)	BioLegend	100216
CD3ε -Biotin (145-2C11)	BioLegend	100304
CD3ε -BV421 (145-2C11)	BioLegend	100341
CD45.1/CD45.2 congenic mice	N/A	N/A	Bred in our Laboratory
CD45.1-FITC (A20)	BD Biosciences	553775
CD45.2-PE (104)	BD Biosciences	560695
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)	BioLegend	100430
CD4-Biotin (GK1.5)	BioLegend	100404
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)	BioLegend	100730
CD8a-Biotin (53-6.7)	BioLegend	100704
Centrifuge Tube 15ml	NICHIRYO	00-ETS-CT-15
Centrifuge Tube 50ml	NICHIRYO	00-ETS-CT-50
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)	Invitrogen	47117182
D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid	Nacalai	14249-24
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10270106
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)	eBioscience	46135182
FlowJo version 10	BD Biosciences	https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Gmmacell 40 Exactor	Best theratronics	N/A
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)	BioLegend	108422
Gr-1-Biotin (RB6-8C5)	BioLegend	108404
Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background)	N/A	N/A	Bred in our Laboratory
IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution	Sigma-Aldrich	I8015-100MG
isoflurane	Pfizer	4987-114-13340-3
Kimwipes S200	NIPPON PAPER CRECIA	6-6689-01
LS Columns	Milteny biotec	130-042-401
Lysis buffer	BD	555899
MACS  MultiStand	Milteny biotec	130-042-303
Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well	IWAKI	3810-006
MidiMACS Separator	Milteny biotec	130-042-302
Mouse Pie Cages	Natsume Seisakusho	KN-331
Multipurpose refrigerated Centrifuge	TOMY	EX-125
NARCOBIT-E (II)	Natsume Seisakusho	KN-1071-I
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)	BioLegend	108728
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution	nacalai	26253-84
Porcelain Mortar φ120mm with Pestle	Asone	6-549-03
Protein LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431081
Sca-I-BUV395 (D7)	BD Biosciences	563990
Stainless steel scalpel blade	FastGene	FG-B2010
Streptavidin-BUV737	BD Biosciences	612775
SYTOX-red	Invitrogen	S34859
Tailveiner Restrainer for Mice standard	Braintree	TV-150 STD
TCRb-BV421 (H57-597)	BioLegend	109230
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)	BioLegend	116220
Ter-119-Biotin (TER-119)	BioLegend	116204
Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe	TERUMO	SS-05LZ
Terumo Hypodermic Needle 23G x 1	TERUMO	NN-2325-R